[0001] 本发明属于林学领域，涉及一种提高杨树抗旱能力和抗氧化能力的方法。

[0002] 干旱是一种复杂的水文和气候灾害，具有持续时间长和破坏力强等特点，全球性干旱问题日趋严重，这致使森林的分布、结构、群落组成及生态多样性不断改变，也对各国林业发展造成严重影响。我国干旱、半干旱地区面积不断增加，人工造林成活率仅为4％～30％。杨树(Populus L.)作为我国北方地区传统的防风造林速生树种，又是可再生生物能源植物，在防风固沙、涵养水源、木材供应等方面起着重要作用。

[0003] 杨树作为我国速生人工树种，其生长发育长期受到各种胁迫的制约，因此提高杨树抗干旱胁迫的方法具有重要意义。

[0004] 谷氨酸(也称α‑氨基戊二酸)是一种普遍存在的氨基酸，在氨基酸代谢过程中发挥着重要的作用。谷氨酸还可以作为代谢产物、产生能量的底物、营养物质、以及蛋白质结构的决定因素，甚至作为信号分子参与各种生物学反应。

[0034] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

[0035] 试验材料

[0036] 银腺杨84K(Populus alba×P.glandulosa‘84K’，简称“84K杨”)，选用380mL组培瓶培养。组培苗茎尖(长约3cm)转入生根培养基，在光照培养室中生长一个月，株高约10cm，培养条件为：光照16h/黑暗8h，温度25℃，光照强度12 000Lux。选择长势良好，生长一个月的组培苗转移至装有营养土的育苗盆(10cm×10cm×8cm)中常规土培一个月，株高约35cm，‑2 ‑1培养条件为：光照16h/黑暗8h，温度23～25℃，光照强度50μmol·m s 。

[0037] 试验设计

[0038] 一、施加外源谷氨酸后进行干旱试验

[0039] 为了确定外源谷氨酸最优施加时间。以育苗盆中生长两个月的84K杨为材料，在84K杨干旱胁迫前0d、1d、2d和3d(本发明的干旱胁迫前n天是指浇灌谷氨酸溶液与干旱之间‑1
间隔n天)进行外源10mmol·L 的L‑谷氨酸水溶液进行根系浇灌，每个育苗盆50mL，没有L‑谷氨酸浇灌的每一天都浇灌50mL清水，并设置正常浇水对照组(每一天都浇灌50mL清水)。
处理分别记为：G0、G1、G2、G3和对照。以上操作均维持土壤含水量为约75％。

[0040] 在此基础上将G0、G1、G2、G3和对照中的每一组分为两小组：一小组在前述操作基础上继续正常浇水，维持土壤含水量为约75％；另一组施加谷氨酸后进行干旱处理，分别为施加谷氨酸后进行干旱(G0+干旱)、施加谷氨酸1d后进行干旱(G1+干旱)、施加谷氨酸2d后进行干旱(G2+干旱)、施加谷氨酸3d进行后干旱(G3+干旱)和正常浇水后进行干旱(干旱)。

[0041] 自然干旱6d(土壤含水量降至约25％)，每个处理设6个生物学重复、3次试验重复，处理期间观察叶片表型，确定谷氨酸最优施加时间(实验设计见图1a)。

[0042] 经上述试验分析确定谷氨酸最优施加时间为0d，随后对84K杨干旱胁迫前0d浇灌谷氨酸并进行生理指标的测定。试验包括四个处理：正常浇水(对照)、正常浇水后进行干旱(干旱)、施加谷氨酸后正常浇水(谷氨酸)和施加谷氨酸后进行干旱(谷氨酸+干旱)，每个处理设8个生物学重复，试验重复3次，分别在未处理(试验开始：D0)、谷氨酸处理后开始干旱(试验第4d：D4)和谷氨酸处理后干旱胁迫6d(试验第10d：D10)三个时间点取样，测试不同的指标，具体试验处理详见图1a。

[0043] 二、复水试验

[0044] 以育苗盆中生长两个月的84K杨为材料，自然干旱6d(土壤含水量降至25％)后分‑1 ‑1
别浇灌50mL水(H2O)、10mmol·L L‑谷氨酸水溶液(Glu)以及10mmol·L L‑天冬氨酸水溶液(Asp)，观察复水情况。分别在未处理(试验开始：D0)、干旱胁迫6d(试验第6d：D6)及复水恢复培养3个小时(D6+3h)三个时间点取样，测定相应的生理指标，具体试验处理详见图1b。

[0045] 在图1中，a示意了外源谷氨酸处理后进行干旱试验。D0：未处理；D4：谷氨酸处理后开始干旱；D10：干旱胁迫6天；对照：正常浇水；干旱：正常浇水后干旱；G0：施加谷氨酸后正常浇水；G0+干旱：施加谷氨酸后干旱；G1：施加谷氨酸1天后正常浇水；G1+干旱：施加谷氨酸1天后进行干旱；G2：施加谷氨酸2天后正常浇水；G2+干旱：施加谷氨酸2天后进行干旱；G3：
施加谷氨酸3天后正常浇水；G3+干旱：施加谷氨酸3天后进行干旱。B示意了复水试验。D0：未处理；D6：干旱胁迫6天；D6+3h：复水恢复培养3个小时；H2O：干旱胁迫后浇灌50mL水；Glu：干‑1 ‑1
旱胁迫后浇灌50mL10mmol·L L‑谷氨酸水溶液；Asp：干旱胁迫后浇灌50mL 10mmol·L L‑天冬氨酸溶液。

[0046] 试验方法

[0047] 一、实时荧光定量PCR分析

[0048] 对84K杨脯氨酸合成和降解相关基因在谷氨酸处理的不同时间进行实时荧光定量PCR分析。取正常生长以及不同处理后84K杨的第5和第6片叶片，提取RNA进行反转录，使用Vazyme ChamQ SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：Q311‑‑ΔΔCT
02)按照说明书试验，使用2 计算表达量，内参基因为Actin，每个处理设4个生物学重
复、3次试验重复。

[0049] 二、叶片相对含水量测量

[0050] 分别取正常生长以及不同处理后84K杨的第8片叶片测定相对含水量。取下叶片后立即称取鲜质量记为FW，室温下把叶片完全浸没于去离子水中放置24h，用滤纸吸干表面水分称量叶片饱和鲜质量记为TW。再将叶片装至信封放至75℃烘箱干燥至质量恒定，称量记为DW。叶片相对含水量＝(FW‑DW)/(TW‑DW)×100％。

[0051] 三、叶倾角测量

[0052] 分别对正常生长以及不同处理后84K杨的第5片功能叶(L5)进行叶倾角的测量。植株保持垂直地面状态，选取L5叶面积最小的角度，在植株前60cm处固定位置，用延时摄像机(ATLI，T100 TS)每隔半个小时进行拍照。使用Image J软件，连接叶片基部与叶尖，利用量角器测量与主茎干之间的夹角。每个处理设3个生物学重复、3次试验重复。

[0053] 四、电解质渗透率测量

[0054] 分别取正常生长以及不同处理后84K杨的第7片叶片测定电解质渗透率。用去离子水清洗叶片，滤纸吸干表面水分，主叶脉两端用6mm直径打孔器各打5个小圆片，用镊子夹取放入装有2mL去离子水的10mL离心管中，完全浸泡抽真空20min后，压强为0.08Mpa，向离心管中加入6mL去离子水，25℃200rpm摇床中振荡1h，电导率仪测电导率记为S1，将离心管封口放入沸水浴中水浴15min，待溶液冷却至室温后，测电导率记为S2。计算电解质渗率＝(S1/S2)×100％。

[0055] 五、叶片失水率测量

[0056] 分别取正常生长以及不同处理后84K杨的第4片叶片测定叶片失水率，取不同处理叶片立即称取鲜质量记为FW，室温放置，每隔0.5h称量一次，记为desiccated weight，总时间为4h。最后将叶片放置75℃烘箱里烘干至质量恒定，称其干质量(DW)。计算每个测量时间点每个样本的叶片失水率。计算公式：叶片失水率＝(FW‑desiccated weight)/(FW‑DW)×100％。

[0057] 六、谷氨酸含量测量

[0058] 分别取正常生长以及不同处理后84K杨的第5和第6片叶片测定谷氨酸的含量。选用谷氨酸含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号BC1580)，谷氨酸脱氢酶(GDH)催+
化谷氨酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生成α‑酮戊二酸、NADH和NH4 ，会引起340nm处吸光度的上升，通过测定5min内340nm吸光度的变化，计算谷氨酸含量。以谷氨酸含量/(μmol·‑1
mL )为x轴，5min内样品增加的吸光值ΔA为y轴，绘制y＝kx+b标准曲线，按照样本质量计‑1
算：谷氨酸含量/(μmol·g )＝x/W，W：样本质量。

[0059] 七、脯氨酸含量测量

[0060] 分别取正常生长以及不同处理后84K杨的第5和第6片叶片测定脯氨酸的含量。选用脯氨酸含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号BC0290)，依据加热处理后脯氨酸与酸性茚三酮溶液反应生成红色，在520nm处有吸收峰测定脯氨酸含量。称取约0.1g叶片组织(W)，加入1mL提取液沸水震荡提取10min，常温离心10min，取上清，冷却后加入酸性茚三酮溶液沸水浴保温30min。以脯氨酸标准溶液浓度为横坐标x，ΔA标准＝A标准管‑A空白管为纵坐标绘制标准曲线，在波长520nm下将不同样品吸光值变化(ΔA)代入标准曲线得到x/(μg·‑1 ‑1
mL )。按照样本质量计算：脯氨酸含量/(μg·g )＝x/W。

[0061] 八、活性氧含量测量

[0062] 分别取正常生长以及不同处理后84K杨的第5和第6片叶片测定过氧化氢(H2O2)和‑
超氧阴离子(O2·)含量，选用过氧化氢含量检测试剂盒和超氧阴离子含量检测试剂盒(北
京索莱宝科技有限公司，货号BC3595，BC1295)，样品液氮充分研磨后取0.1g(W)，加入1mL提取液涡旋混匀，4℃离心取上清作为待测液。在离心管中按步骤加入试剂混匀，分别在波长
415nm和530nm下测定吸光值，计算ΔA标准＝A标准管‑A空白管，ΔA样本＝A测定管‑A空白管。按样本质量计算‑1
H2O2含量，H2O2含量/(μmol·g )＝2×(ΔA样本/ΔA标准)/W。

[0063] O2·‑含量测定需以ΔA标准为y轴，不同标准液浓度为x轴，绘制标准曲线y＝kx+b，将‑ ‑1ΔA样本带入标准曲线得到x值，O2·含量/(μmol·mg )＝2x/W。

[0064] 九、抗氧化清除酶活性测量

[0065] 分别取正常生长以及不同处理后84K杨的第5和第6片叶片测定过氧化氢酶CAT(北京索莱宝科技有限公司，货号BC0200)、过氧化物酶POD(北京索莱宝科技有限公司，货号BC0090)和超氧化物歧化酶SOD(北京索莱宝科技有限公司，货号BC0170)的活性。样品液氮充分研磨后取0.1g(W)，加入1mL提取液涡旋混匀，离心取上清作为待测液，按步骤加入检测工作液后立刻混匀5s测定不同波长下吸光值。CAT活性以240nm下每克组织在反应体系中催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位；POD以470nm下每克组织在每毫升反应体系中每分钟吸光值变化0.01为一个酶活力单位；SOD以560nm下黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为50％时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位，按样本质量计算不同抗‑1 ‑1 ‑1
氧化酶活性：CAT/(U·g )＝764.5×ΔA/W，POD/(U·g )＝7133×ΔA/W，SOD/(U·g )＝
11.11×[抑制百分率/(1‑抑制百分率)]/W，ΔA＝A测定‑A对照，抑制百分率＝(A空白‑A对照)/A测定×
100％。

[0066] 十、数据分析

[0067] 采用Excel和SPSS统计软件进行数据处理和分析；样本数据采用SPSS 17.0数据处理软件进行独立样本t检验，在0.05水平上检验差异显著性，并用Excel进行数据分析、图表绘制。

[0068] 实施例1：干旱胁迫前外源谷氨酸处理影响84K杨耐抗旱性影响

[0069] 分别在干旱胁迫前0、1、2、3d浇灌谷氨酸，观察表型，测量干旱6d后的叶片相对含水量发现，干旱胁迫前0d浇灌谷氨酸的植株干旱症状出现得更为缓慢，其干旱胁迫损害程度由强到弱依次为干旱、G3+干旱、G2+干旱、G1+干旱、G0+干旱(参见图2a，c)。在干旱过程中，84K杨叶片萎蔫下垂，表现出对干旱胁迫的敏感性，但经过谷氨酸处理的植株对干旱的敏感性降低，G0+干旱处理植株叶片相对含水量比干旱植株高1.60倍，表现出较强的耐旱性。

[0070] 当所有处理出现茎尖萎蔫下垂表型时进行复水(50mL)，每半小时拍照记录。测定功能叶叶倾角发现外施谷氨酸的植株叶片优先恢复，且恢复速度由快到慢依次为G0+干旱、G1+干旱、G2+干旱、G3+干旱、干旱(参见图2b，d)，表明干旱胁迫前0d浇灌谷氨酸的84K植株复水响应能力更强。综上所述，谷氨酸处理降低了植株对干旱的敏感性，选择0d为最优施加时间，进行后续生理指标的测定。

[0071] 图2中，a：外源谷氨酸处理后干旱胁迫的植株表型；b：干旱胁迫后复水植株表型；c：干旱胁迫6天后L8叶片相对含水量；d：复水后L5叶倾角。G3+干旱：施加谷氨酸3天后干旱；
G2+干旱：施加谷氨酸2天后进行干旱；G1+干旱：施加谷氨酸1天后进行干旱；G0+干旱：施加谷氨酸后进行干旱；干旱：正常浇水后干旱；图a箭头表示植株干旱后叶片开始萎焉；图b箭头表示植株复水后叶片开始恢复；比例尺＝5cm。

[0072] 实施例2：外源谷氨酸对84K杨抗寒性的影响

[0073] 一、外源谷氨酸处理导致的干旱胁迫下84K杨叶片生理变化

[0074] 进一步检测图1a所示对照、G0(谷氨酸)、干旱、G0+干旱(谷氨酸+干旱)这四种模式的84K杨在0d(D0)，干旱胁迫下的4d及10d的生理指标变化。与对照相比，施加谷氨酸后(D4)，植株叶片相对含水量和电解质渗透率没有明显的变化。相较于对照，干旱胁迫6d后(D10)，干旱处理84K杨叶片相对含水量降低34.2％，而谷氨酸+干旱处理后的植株相对含水量仅降低14.2％(图3a)。由此可见，浇灌谷氨酸能够有效减小干旱对叶片相对含水量降低的影响。干旱胁迫6d后，干旱处理植株电解质渗透率显著升高，是对照84K杨的2.73倍；而谷氨酸+干旱处理植株电解质渗透率变化幅度较小，与对照84K杨无显著差异(图3b)。由此可见，浇灌谷氨酸能够有效维持叶片电解质渗透率的稳定性，降低干旱胁迫对杨树的损伤。未干旱前，相较于对照植株，谷氨酸处理植株叶片失水率显著降低；植株干旱6d后，由于干旱植株叶片已失水，干旱植株离体叶片失水率低于未干旱植株(图3c，d)。相较于干旱植株，谷氨酸+干旱植株叶片失水率显著降低(图d)。以上结果表明外施谷氨酸可以降低叶片失水
率，增强保水能力，减轻干旱胁迫对细胞质膜透性的损伤，增强84K杨的耐旱性。

[0075] 二、外源谷氨酸处理影响干旱胁迫下84K杨渗透调节物质含量的积累

[0076] 植物缺水时，植物细胞自身会合成一些渗透调节物质降低渗透势，维持细胞渗透平衡，防止细胞失水。外源施加谷氨酸后，植株叶片谷氨酸含量是对照处理的1.85倍(图3e)。因此根据不同标准品浓度下吸光度的差异，绘制标准曲线，对不同处理植株叶片进行谷氨酸和脯氨酸含量测定。施加谷氨酸后，四个处理脯氨酸含量无明显变化(图3f)。相较于谷氨酸处理后(D4)，干旱胁迫6d后(D10)谷氨酸含量增加幅度较低，但谷氨酸+干旱处理谷氨酸含量具有显著的增加，是对照的1.28倍。D10脯氨酸含量除对照外均有所增加，其中谷氨酸+干旱处理植株脯氨酸含量最高，是对照的2.41倍，干旱处理植株的1.21倍(图3e，f)。

[0077] 施加谷氨酸后，与对照相比，脯氨酸合成相关基因吡咯啉‑5‑羧酸合成酶(P5CS)、吡咯啉‑5‑羧酸还原酶(P5CR)和吡咯啉‑5‑羧酸脱氢酶(P5CDH)表达显著升高，分别是对照的2.47倍、2.57倍和8.89倍，脯氨酸还原酶(PDH)表达量减少48.8％(图4)。干旱胁迫6d后，与干旱处理相比，脯氨酸合成基因P5CS和P5CR在谷氨酸+干旱处理中表达量分别增加了23.0％和32.5％(图4b，d)，脯氨酸降解基因PDH表达量降低20.4％，P5CDH表达量有所下降(图4c)。上述结果表明谷氨酸处理后增加了植株叶片谷氨酸含量，但随着植株的生长被分解代谢；在植株受到干旱胁迫时，谷氨酸作为脯氨酸合成的前体，诱导脯氨酸的合成和积累，提高渗透调节能力，降低植株对干旱的敏感性。

[0078] 图3中，a：叶片相对含水量；b：电解质渗透率；c：谷氨酸处理后(D4)叶片失水率；d：干旱胁迫后(D10)叶片失水率；e：谷氨酸含量；f：脯氨酸含量。D0：未处理；D4：谷氨酸处理后开始干旱；D10：干旱胁迫6天。数值表示为平均值±标准误(n＝3)，根据Duncan的多重范围测试，不同字母表示在P＜0.05时存在显著差异，下同。

[0079] 图4中，a：吡咯啉‑5‑羧酸脱氢酶(P5CDH)相对表达量；b：吡咯啉‑5‑羧酸合成酶(P5CS)相对表达量；c：脯氨酸脱氢酶(PDH)相对表达量；d：吡咯啉‑5‑羧酸还原酶(P5CR)相对表达量。D0：未处理；D4：谷氨酸处理后开始干旱；D10：干旱胁迫6天。紧邻四个数据条分别依次代表示对照、G0(谷氨酸)、干旱、G0+干旱(谷氨酸+干旱)这四种模式。

[0080] 小结：

[0081] (1)D4，与对照相比，G0(谷氨酸)组谷氨酸含量显著增加；D10，与对照相比，G0(谷氨酸)组谷氨酸含量略微增加，这说明没有干旱胁迫的情况下，浇灌谷氨酸带来的谷氨酸含量会逐渐代谢趋于平稳。

[0082] (2)D4，与干旱组相比，G0+干旱(谷氨酸+干旱)组中，脯氨酸含量略微升高，D10，与干旱组相比，G0+干旱(谷氨酸+干旱)组中，脯氨酸含量显著升高。

[0083] (3)不论D4还是D10，与对照相比，G0(谷氨酸)组PDH下调表达，P5CR上调表达，与干旱组相比，G0+干旱(谷氨酸+干旱)组PDH下调表达，P5CR上调表达，均利于组织内提高脯氨酸含量，说明谷氨酸参与了脯氨酸的合成途径。

[0084] 不论D4还是D10，与对照相比，G0(谷氨酸)组中P5CDH与P5CS均上调表达，与干旱组相比，G0+干旱(谷氨酸+干旱)组中P5CS上调表达。D10，与干旱组相比，G0+干旱(谷氨酸+干旱)组中P5CDH下调表达，说明谷氨酸影响了脯氨酸的降解途径在没有干旱胁迫的情况下，P5CDH与P5CS均上调表达，尽量维持生理状态下的谷氨酸浓度平衡，避免外源谷氨酸破坏内稳态。而有干旱胁迫的D10，P5CDH下调表达间接降低脯氨酸的消耗，P5CS上调表达间接促进脯氨酸的合成，PDH下调表达直接降低脯氨酸的消耗，P5CR上调表达直接促进脯氨酸的合成。这说明无干旱胁迫的时候，谷氨酸对谷氨酸和脯氨酸的影响不大，而在干旱胁迫后，外源谷氨酸则能够显著提高脯氨酸含量。基于不知道细节的代谢通路与调节机制，实现了良好的通过外源谷氨酸调节内源脯氨酸含量进而提升杨树抗旱能力。

[0085] 三、外源谷氨酸处理对干旱胁迫下84K杨过氧化氢含量及抗氧化清除酶活性的影响

[0086] 活性氧作为植物细胞代谢的副产物，在植物受到胁迫后大量增加，可对细胞产生氧化伤害。为探究谷氨酸处理干旱胁迫后的植株氧化损伤情况，本发明测定了图1a所示对照、G0(谷氨酸)、干旱、G0+干旱(谷氨酸+干旱)这四种模式中谷氨酸处理和干旱过程中84K杨叶片的H2O2含量。相较于对照，施加谷氨酸后谷氨酸处理植株H2O2积累显著降低，干旱胁迫6d后(D10)，干旱84K杨H2O2含量增加了46.1％，而谷氨酸+干旱植株仅增加17.9％，增幅显著低于干旱处理植株(图5a)。

[0087] 活性氧清除酶CAT、POD和SOD在干旱试验过程中呈现相同的趋势，与对照相比，谷氨酸处理可以显著提高叶片的CAT、POD和SOD活性，分别提高了34.5％、32.5％和9.7％。在84K杨受到干旱胁迫后，谷氨酸处理植株会维持较高的抗氧化酶活水平，CAT、POD和SOD酶活分别是干旱处理植株的1.67倍、1.35倍、1.17倍(图5b，c，d)。较高的CAT和POD活性加速了过氧化氢的分解，此时与干旱植株相比过氧化氢含量降低了19.3％。故谷氨酸处理可缓解干旱胁迫产生的大量活性氧引起的氧化损伤，从而协同增强84K杨的耐旱性。

[0088] 图5中，a：过氧化氢含量；b：过氧化氢酶活性；c：过氧化物酶活性；d：超氧化物歧化酶活性。D0：未处理；D4：谷氨酸处理后开始干旱；D10：干旱胁迫6天。

[0089] 实施例3：干旱胁迫后外源谷氨酸影响84K杨生长的恢复

[0090] 一、干旱胁迫后外源谷氨酸处理叶片的生理变化

[0091] 为探究干旱胁迫后外施谷氨酸(Glu)对84K杨恢复能力的影响，对干旱胁迫后的植株进行复水试验，并增加与谷氨酸相近的酸性氨基酸天冬氨酸(Asp)作为对照，验证谷氨酸在复水过程中特异性发挥作用。表型观察可知，萎焉植株复水后，第5和第6片叶片最先发生响应，与复水处理相比，经谷氨酸处理的植株优先恢复(图6a)。

[0092] 相较于干旱胁迫6d后(D6)的84K杨，复水3h后(D6+3h)，复水处理、复谷氨酸处理和复天冬氨酸处理叶片相对含水量分别增加了22.4％、36.9％和24.6％；电解质渗透率分别下降了18.6％、28.8％和18.0％(图6)。这些生理指标表明，复谷氨酸处理减轻了干旱胁迫带来的细胞膜损伤，叶片相对含水量更高，植株恢复能力更强。

[0093] 图6中，a：植株表型。H2O：干旱胁迫后浇灌50mL水；Glu：干旱胁迫后浇灌50mL L‑谷‑1 ‑1氨酸水溶液(10mmol·L )；Asp：干旱胁迫后浇灌50mL L‑天冬氨酸水溶液(10mmol·L )。
b：叶片相对含水量；c：电解质渗透率；d：谷氨酸含量；e：脯氨酸含量。D0：未处理；D6：干旱胁迫6天；D6+3h：复水恢复培养3个小时。比例尺＝5cm。

[0094] 二、干旱胁迫下外源谷氨酸影响杨树体内谷氨酸和脯氨酸含量

[0095] 三个处理在未处理(D0)和干旱胁迫6d后谷氨酸含量无显著变化，但在复水3h后复谷氨酸处理与复水相比，谷氨酸含量增加了41.8％(图6d)。复水3h后复水处理和复谷氨酸处理脯氨酸含量均有所增加，但复谷氨酸处理增加更为显著，是复水处理的1.48倍，复天冬氨酸处理无显著变化(图6e)。这表明谷氨酸处理后通过增加植物体内谷氨酸含量，诱导脯氨酸合成积累，维持细胞渗透平衡，阻碍水分亏缺。

[0096] 三、干旱胁迫下外源谷氨酸对活性氧含量和抗氧化清除酶活性的影响

[0097] 植物受到干旱胁迫后，会打破植物体内的活性氧动态平衡，活性氧含量增加，过氧化氢和超氧阴离子积累增加。复水3h后，复水植株过氧化氢和超氧阴离子含量显著降低，而复谷氨酸处理植株过氧化氢降低幅度显著高于复水84K杨，且过氧化氢含量由高到低为H2O>Asp>Glu(图7a，b)。复水后，与复水处理相比，复谷氨酸处理CAT和POD酶活性分别提高了19.0％和62.7％(图7c，d)。结果表明谷氨酸处理后，增强抗氧化酶活性，减轻了活性氧增加带来的氧化损伤，加快了84K杨的恢复能力。

[0098] 图7中，a：过氧化氢含量；b：超氧阴离子含量；c：过氧化氢酶活性；d：过氧化物酶活‑1性。H2O：干旱胁迫后复水；Glu：干旱胁迫后浇灌50mL L‑谷氨酸溶液(10mmol·L )；Asp：干‑1
旱胁迫后浇灌50mL L‑天冬氨酸溶液(10mmol·L )；D0：未处理前；D6：干旱胁迫6天；D6+3h：
复水恢复培养3个小时。

[0099] 讨论

[0100] 通过植株干旱前不同时间施加谷氨酸试验发现，随着谷氨酸施加与干旱处理之间的间隔时间越短，植株表现出的耐旱性越强；谷氨酸施加与干旱处理之间的间隔时间越长，植株表现出的耐旱性越弱(图2)。干旱胁迫6d后，谷氨酸+干旱处理植株脯氨酸含量最高，是干旱处理植株的1.21倍(图3f)，且谷氨酸施加后脯氨酸合成酶(P5CS)和吡咯啉‑5‑羧酸还原酶(P5CR)表达量升高(图4b，d)，说明外源施加谷氨酸在干旱胁迫下，通过积累脯氨酸增强84K杨渗透调节能力，从而在一定程度上缓解干旱对84K杨的胁迫。本发明中谷氨酸处理使84K杨体内脯氨酸合成基因(P5CS、P5CR)表达量增加，降解基因(PDH)表达量降低，谷氨酸和脯氨酸含量上升，叶片细胞质中渗透物质浓度提高，渗透势下降而减轻水分胁迫的伤害，所以在干旱胁迫下谷氨酸处理植株叶片失水率显著低于对照植株(图3d)。与之相反，谷氨酸+干旱处理植株叶片相对含水量显著高于干旱植株，这表明谷氨酸和脯氨酸含量的增加，可以维持细胞渗透平衡，阻碍水分亏缺进一步的发生和发展，增强植株耐旱性，也有利于复水后植株的快速恢复。除谷氨酸作为氨基酸前体合成脯氨酸外，谷氨酸本身也作为一种渗透调节物质，以游离的形式在植物细胞中积累，通过降低细胞渗透势来减少水分流失。谷氨酸处理后植株活性氧的积累量较对照明显减少(图5a)，抗氧化酶活性显著提高，也证明了谷氨酸在一定程度上缓解了干旱对植株的氧化胁迫伤害。相较于干旱处理，施加谷氨酸的84K杨干旱后脯氨酸显著增加(图3f)，谷氨酸可作为脯氨酸合成前体，由此我们认为谷氨酸诱导了脯氨酸的合成，调节了干旱胁迫下植株的渗透能力，增强抗氧化酶活性清除了过量的活性氧，从而增强了植株对干旱胁迫的耐受力。

[0101] 植物受到胁迫后，活性氧自由基与抗氧化酶之间的平衡被破坏，活性氧的大量积累损伤细胞膜系统，使细胞内电解质外渗导致电导率增大。在复水试验中，谷氨酸处理后减轻84K杨细胞膜损伤，电解质渗透率显著降低，有助于植株复水后的快速恢复(图6a，c)。为避免受到活性氧的伤害，植物体内会形成一套有效的防御机制，其中起主要作用的是活性‑氧清除酶系统，如POD、SOD、CAT等可有效清除植物体内的H2O2和O2·，抑制高浓度活性氧的积累，防止膜脂的过氧化和细胞的死亡。本发明中无论植株干旱前施加谷氨酸或干旱后复水试验，添加谷氨酸后都可迅速提高植株体内POD、CAT的酶活性(图5b，c；图7c，d)，减少活性氧积累。本发明表明，外施谷氨酸可提高木本植物84K杨树的耐旱性，增强对环境胁迫的抗逆性。

[0102] 干旱处理前外施谷氨酸可增加植株叶片谷氨酸含量、诱导脯氨酸合成基因的表达、增加脯氨酸积累、降低渗透势以减少叶片失水、增强叶片持水能力；同时还提高了植株体内抗氧化酶(CAT、POD和SOD)活性，减少了H2O2积累，从而缓解了干旱胁迫对植株的负面症状，增强了植株耐旱性。干旱胁迫后施加谷氨酸，增强了抗氧化酶CAT和POD活性清除，减轻膜脂过氧化造成细胞膜损伤，从而加速植株在干旱胁迫后的快速恢复。综上所述，谷氨酸既可作为木本植物干旱胁迫的缓解剂又可作为恢复剂，在干旱胁迫下能够调节植物生理代谢来减轻胁迫带来的伤害，为揭示谷氨酸在林木耐旱性方面的作用提供了重要依据。

[0103] 由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。