[0001] 本发明属于植物遗传学领域，涉及一种改善杨树性状的方法。

[0002] 杨树(拉丁语学名：Populus L.)是杨属的植物，全属有约100多种，全世界约62种(包括6杂交种)，其中分布中国的有57种，引入栽培的约4种，此外还有很多变种、变型和引种的品系。杨树(Populus)分类系统共分为五大派：青杨派(Tacamahaca)、白杨派(Leuce)、黑杨派(Aigeiros)、胡杨派(Turanga)、大叶杨派(Leucoides)。树干通常端直；树皮光滑或纵裂，常为灰白色。主要分布于华中、华北、西北、东北等广阔地区。

[0003] 由于繁殖快，生长旺盛，杨树是防风固沙中的重要树种。在用于防风固沙中，希望具有更发达的根系以便更好地固定水土，更好地吸收沙土中的养分。植株变矮能够降低在沙漠或松软土质中杨树被大风吹倒。杨树根系发达也能够更好地在滩涂河边固定土壤，防止水土流失。现有技术中缺少良好的增加根系发达程度且降低植株高度的杨树育种方法，这样的育种将具有推广应用价值。杨树是我国重要的速生工业用材树种和绿化造林树种，根中木质部增多，可更好的运输水分和无机盐。根中木质部的形成和发育直接影响到林木的木材质量和产量，因此有关木质部形成和发育的研究也一直是林木育种的研究的重点，但是由于木质部形成和发育的机理十分复杂，到目前为止，在杨树中尚未见到显著促进根木质部发育的报道。

[0075] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。本发明没有说明的材料与仪器为本领域常规材料与仪器，本发明没有说明的操作细节为本领域常规操作。除特别说明外，本发明所示核酸序列均是按照5’到3’的方向从左到右书写。

[0076] GLR基因：glutamate receptor gene，谷氨酸受体基因，GLR基因的前缀中Pop代表来自杨树参考基因组毛果杨基因组，Pag代表来自下述84K杨基因组，后缀代表相应的同源基因编号。

[0077] 杨树参考基因组：本发明指毛果杨基因组，数据参见diurnal.tools平台中的毛果杨基因组数据库，链接参考：https://diurnal.sbs.ntu.edu.sg/species/view/21。

[0078] 84K杨基因组：本发明采用Illumina HiSeq X Ten平台配合Sanger法测序，测定并组装了84K杨基因组，构建了84K杨基因组数据库，其数据未公开。参考毛果杨基因组对84K杨基因组中的同源基因命名。

[0079] 84K杨是杂交育种培育出来的杂合体杨树，PagGLR3.3a与PopGLR3.3b分别有一个等位基因来源于父本，另一个同源的等位基因来源于母本。根据前述基因组数据，得到PagGLR3.3a(对应毛果杨基因组基因IDPotri.002G007400)的一个等位基因代号Pop_A02G026914.T1(SEQ ID NO:1)，另一个等位基因代号Pop_G02G065355.T1(SEQ ID NO:2)；PagGLR3.3b(对应毛果杨基因组基因IDPotri.005G253800)的一个等位基因代号Pop_A05G057109.T1(SEQ ID NO:3)，另一个等位基因代号Pop_G05G008778.T1(SEQ ID NO:4)，具体编码序列如下所示。

[0080] Pop_A02G026914.T1序列：

[0081] ATGGATTCTACTAGGTTTGGTTGTTGGGTATTTCTCATCTGTTTACTGCTTTCAACAACCGGATATAGTAGGAATCTGACCTCAAGGCCTGCTGTTGTGAATATTGGAGCTCTTTTTACATTCGAATCTTCGATTGGAAGAGTTGCCAAGATTGCTATTCAGGAAGCTGTCAAAGATGTAAATGCGAATTCTAGCATTCTGCGGGGCACCAAACTCAATGTTGATATGAGAAACTCTAATTGCAGTGGGTTTCTAGGAATGGTTGAAGCTTTGCGTTTTATGGAGACCGATATTGTTGCCATTATCGGCCCACAATCTTCTGTCGTTGCTCGTATCGTATCCCATGTTGCGAATCAGCTTCAAGTTCCCCTATTGTCATTTTCAGCAACAGACCCCAGTCTCAACTCTCTGCAGTTTCCCTTTTTTGTTCAGACCACCCAGAGCGATTTGCACCAAATGGCAGCAATATCAGACGTTGTTGATTATTATGGTTGGAAGCAGGTAACTGCCATTTACATTGATGATGATTATGGACGAAATGGCATGTCAGCTCTGGGTGATAAACTTGCAGAGAGACGTTGTAGAATATCTTACAAGGTGGGGGTTCCCCCGGATTCTGGAGTTAATAGGACTGACATCTTAGATATGCTTATTAAGGTTGCATCAATGGAATCTCGAGTTATAGTTCTCCATGTAAATCCTGATGTGGGTTTCGAGGTCTTTTCTGTGGCAAACCGTCTTCAAATGATGGGTAATGGGTGGGTATGGATTGCTACAGATTGGCTCTCGTCTGTTTTGGATTCTGCTTCTCCTCTCCAATCAGAGACCATGGACTCAATTCAAGGAGTTCTCTTTTTTCGTCAACATACACCAGATTCAGATCGAAAGAGAGCGTTTTACTCTAGGTGGCGCAAATTGACTGGTGGTTCTTCGGGGCTGAATTCTTATGGCCTTTATGCTTATGATTCTGTCTGGCTAATTGCACATGCTATTGATGCATTTTTTAACCAGGGTGGTATTATCTCATTTTCTAATGATTCCAGGTTACGTTCAGTGAAAGATAGTGGTCTCCACCTTGAGGCAATGGGCATCTTTGATGATGGAAAACTTCTGCTGAATAACATATTGCAGAGTGATCTTGTTGGTTTGACAGGCCGTATTAAGTTTGACACAGACAGATCTCTTATTCTTCCTGCATATGATGTTAATAACGTGTTCGGAACTGGGTTCAAACGGATTGGTTACTGGTCCAATTACTCTGGTTTGACTGTCGTACCTCCTGAGATACTTTATACAAAGCCACCAAATCGTTCAAGTGCAAACCAGGAACTGTACAAAGTCATTTGGCCTGGAGATACATTGTCCACGCCACGTGGATGGGCTTTTGCTAACAATGGGAAGCAACTGAGAATTGGTGTGCCACTTCGGGTCAGCTTCCGGGAGTTTGTATCACAAGCACAAGGGACAGATACATTCAAGGGTTTCTGCATAGATGTTTTTACATCTGCAATAACTTTGTTACCATATCCTGTTCAATATCAGTTTATCCCCTTTGGAGATGGTAAAAACAATCCGAGCTACTCAGAGCTGGTGTATAAAATTACGACGGGTTTCTTTGATGCTGTTGTTGGTGACGTTGCCATTGTCACCAACAGGACAAAAATCCTAGATTTTACACAGCCATATGTCGCATCTGGATTGGTTGTTGTGGCCCCTTTTAGGAAGTCAAACTCAGGAGCCTGGACTTTCCTGGGGCCATTTAGTGCCCGTTTGTGGATTGTCACCGGTTGTTTCTTCTTTGTTGTTGGCGTAGTTGTGTGGATTCTTGAGCATAGGATAAATGATGAGTTCAGGGGCCCGCCTAAAAGGCAAATCATAACCGTTATATGGTTCAGTCTCTCGACTCTATTTTCCACTCATAGAGAAAACACTATGAGCACCCTTGCGCGATTTGTGCTACTTATATGGCTCTTTGTGGTTTTAATAATCAACTCAAACTACACTGCAAGCTTGACGTCAATTCTCACAGTGCATCAACTATCTTCTCATATTAAAGGAATTGAAAGCTTGAAGGAAAGTGGTGAGCCAGTAGGGTACCAGGTGGGTTCTTTTGCTGAATATTACTTGAGTGAGGAAGTTGGAATATCAAAATCTAGGCTTGTTGCCCTGGGATCACCAGAAGAATATGCTAAAGCACTCCAACTCGGTCCTGGAAAAGGGGGTGTTGCTGCCATTGTTGATGAACGTCCCTATGTGGAACTTTTCCTTGCAGGGCAGTGCACGTTCAGGATTGTGGGTCGAGAATTTACAAAAAGTGGCTGGGGTTTCGCATTTCCAAGAGACTCTCCCTTAGCTGTGGACATGTCGACTGCAATTCTAGCACTATCAGAGAATGGTGATCTCCAACGGATCCATGACAAGTGGCTGATGCAAAGCACATGCAGTTCGGATACTTCTGAGCTTGAAGCAGATAAACTTTACCTGAGGAGCTTTTGGGGCCTCTTTCTCCTTTGTGGTCTAGCTTGTTTCATTTCACTCGTCATACACGTCTTGCAGATTATACGACTGTTTTATGCTGCCCCTGCAGAATCTGCTTCTCCTGGTCAATGTCCCTCACGTCCTGGGTGTATCCGTAGACTATTGACATTAATGGATCAGAAGGAAGAGCCCACAAAGAATGCGAGTAAAAGAAGGAAGTTGGAAAGATCATTATCCGGGAAAGATCAGGACGGTGAGTCACTGAGGAATCCCAAGAGGAAAGAAACAGAAAGGACGATTGGAGCGACATCAACATAA

[0082] Pop_G02G065355.T1序列：

[0083] ATGGATTCTATTAGGTTTGGTTGTTGGGTATTTCTCATCTGTTTACTGCTTTCAACAACTGGATATAGTAGGAATCTGACCTCAAGGCCTGCTGTTGTGAATATTGGAGCTCTTTTTACATTCGAATCTTCGATTGGAAGAGTTGCCAAGATTGCTATTCAGGAAGCTGTCAAAGATGTAAATGCGAATTCTAGCATTCTGCGGGGCACCAAACTCAATGTTGATATGAGAAACTCTAATTGCAGTGGGTTTCTAGGCATGGTTGAAGCTTTGCGTTTTATGGAGACCGATATTGTTGCCATTATCGGCCCACAATCTTCTGTCGTTGCTCGTATCATTTCCCATGTTGCGAATCAGCTTCAAGTTCCCCTATTGTCATTTGCAGCAACAGACCCCAGTCTCAACTCTCTGCAGTTTCCCTTTTTTGTTCAGACCACCCAGAGCGATTTGCACCAAATGGCAGCAATATCAGACGCTGTTGATTATTATGGTTGGAAGCAGGTAACTGCCATTTACATTGATGATGATTATGGACGAAATGGCATGTCAGCTCTGGGTGATAAACTTGCAGAGAGACGTTGTAGAATATCTTACAAGGTGGGGGTTCCCCCGGATTCTGGAGTTAATAGGACTGACATCTTAGATATGCTTATTAAGGTTGCATCAATGGAATCTCGAGTTATAGTTCTCCATGTAAATCCTGATGTGGGTTTCGAGGTCTTTTCTGTGGCAAACCGTCTTCAAATGATGGGTAATGGGTGGGTATGGATTGCTACAGATTGGCTCTCGTCTGTTTTGGATTCTGCTTCTCCTCTCCAATCAGACACCATGGACTCAATTCAAGGAGTTGTCTTTTTTCGTCAACATACACCAGATTCAGATCGAAAGAGAGCGTTTTACTCTAGGTGGCGCAAATTGACTGGTGGTTCTTCGGGGCTGAATTCTTATGGCCTTTATGCTTATGATTCTGTCTGGCTAATTGCACATGCTATTGATGCATTTTTTAACCAGGGTGGTATTATCTCATTTTCTAATGATTCCAGGTTACGTTCAGTGAAAGATAGTGCTCTCCACCTTGAGGCAATGGGCATCTTTGATGATGGAAAACTTCTGCTGAATAACATATTGCAGAGTGATCTTGTTGGTTTGACAGGCCGTATTAAGTTTGACACGGACAGATCTCTTATTCTTCCTGCATATGACGTTAATAACGTGTTCGGAACTGGGTTCAAACGGATTGGTTACTGGTCCAATTACTCTGGTTTGACTATCGTACCTCCTGAGATACTTTATACAAAGCCACCAAATCGTTCAAGTGCAAACCAGGAACTGTACAAAGTCATTTGGCCTGGAGATACATTGTCCACGCCACGTGGATGGGCTTTTGCTAACAATGGGAAGCAACTGAGAATTGGTGTGCCACTTCGGGTCAGCTTCCGGGAGTTTGTATCACAAGCACGAGGGACAGATACATTCAAGGGTTTCTGCATAGATGTTTTTACATCTGCAATAACTTTATTACCATATCCTGTTCAATATCAGTTTATCCCCTTCGGAGATGGTAAAAACAATCCGAGCTACTCAGAGCTGGTGCATAAAATTACGACGGGTTTCTTTGATGCTGTTGTTGGTGACGTTGCCATTGTCACCAACAGGACAAAAATCCTAGATTTTACACAGCCATATGTCGCATCTGGATTGGTTGTTGTGGCCCCTTTTAGGAAGTCAAACTCAGGAGCCTGGACTTTCCTGGGGCCATTTAGTGCCCGTTTGTGGATTGTCACCGGTTGTTTCTTCTTTGTTGTTGGCGTAGTTGTGTGGATTCTTGAGCATAGGATAAATGATGAGTTCAGGGGCCCGCCTAAAAGGCAAATCATAACTGTTATATGGTTCAGTCTCTCGACTCTATTTTCCACTCATAGAGAAAACACTATGAGCACCCTTGCGCGATTTGTGCTACTTATATGGCTCTTTGTGGTTTTAATAATCAACTCAAACTACACTGCAAGCTTGACGTCAATTCTCACAGTGCATCAACTATCTTCTCATATTAAAGGAATTGAAAGCTTGAAGGAAAGTGATGAGCCAGTAGGATACCAGGTGGGTTCTTTTGCTGAATATTACTTGAGTGAGGAAGTTGGAATATCAAAATCTAGGCTTGTTGCCCTGGGATCACCAGAAGAATATGCTAAAGCACTCAAACTCGGTCCTGGAAAAGGGGGTGTTGCTGCCATTGTTGATGAACGTCCCTACGTGGAACTTTTCCTTGCAGGGCAGTGCACGTTCAGGATTGTGGGTCGAGAATTTACAAAAAGTGGCTGGGGTTTCGCATTTCCAAGAGACTCTCCCTTAGCTGTGGACATGTCGACTGCAATTCTAGCACTATCAGAGAATGGTGATCTCCAACGGATCCATGACAAGTGGCTGATGCAAAGCACATGCAGTTCGGATACTTCTGAGCTTGAAGCAGATAAACTTTACCTTAGGAGCTTTTGGGGCCTCTTTCTCCTTTGTGGTCTAGCTTGTTTCATTTCACTCGTCATATACGTCTTGCAGATTATACGACAGTTTTATGCTGCCCCTGCAGAATCTGCTTCTCCTGGTCAATGTCCCTCACGTCCTGGGTGTATCCGTAGATTATTGACATTAATGGATCAGAAGGAAGAGCCCACAAAGAATTCGAGTAAAAGAAGGAAGTTGGAAAGATCATTATCCGGGAAAGATCAGGACGGTGAGTCACTGAGGAATCCCAAGAGGAAAGAAACAGAAAGGACGATTGGAGCGACATCAACATAA

[0084] Pop_A05G057109.T1序列：

[0085] ATGAACGCGGTTAGGTTTGCTTTGTGTCTTTTTCTCTTCTGTGTGCTGTTTTCATCAAGTGGATATAGTAGGAATGTGAGCTCAAGGCCTGCCGCTGTGAATATTGGAGCTATTTTTACCTTCGAATCTACGATTGGAAGAGCTGCCAAGATTGCTATCCAGGAAGCTGTCAAAGATGTGAATGCAAATTCTAGCATTCTGCATGGCACCGAACTCAAAATTCACATGAGAAACTCTAACTGCAGTGGGTTTCTAGGCTTGGCTGAAGGTTTGAAGTTCACGGAGAATGATGTCATTGCCATTATTGGCCCGCAATCTTCTGTTGTTGCCCATATTATATCCCATGTCGCTAATGAACTTCAAGTTCCCCTATTGTCATTTGCAGCAACAGACCCCACTCTGAACTCGCTGCAGTTCCCCTTTTTTGTTAGGACCACGCAGAGTGATTTCTACCAAATGGCGGCAATATCAGAGGTAGTTGATCATTATGGTTGGAAGCAGGTGACTGCCATTTTCATTGATAATGATTATGGACGAAATGGCGTGTCAGCTCTAGGTGATAGACTTGCAGAGAGACGTTGTAGAATATCTTACAAGGTGGGGATTCCCCCGGATTCTGGAGTTAATAGGGGTGACATCACGGATATTCTTGTTAAGGTCGCGTTAATGGAATCTCGGGTTGTAATTGTCCATGTGTATCCTGACATGGGTTTCAAGATCTTTTCCATGGCAAACCATCTTGAAATGATGGGTAATGGGTGGGTATGGATTGCCACGGATTGGCTTTCGTCTGTTTTGGATTCTGCTTCACCTCTCCCATCAGAGACCATGGACTCAGTGCAAGGGGTTCTTGTTTTGCGTCAACACACACCAGATTCAGATAGAAAGAGAGCCTTTTCCTCTAGGTGGCACAAATTGACTGGTGGTTCTTTGGGGCTGCATTCTTATGGACTCTATGCTTATGATTCTGTCTGGCTAATTGCGCATGCTCTTGATGCATTTTTTAACCAGGGTGGTATAATCTCATTTTCTAACGATTCCAGGTTACCTTCTGGGGAAGGTAGTAGTCTCCACCTTGAGGCAATAAGCATCTTTGATGATGGAAAACTTCTGCTGAATAACATATTGCAGAGTGATTTTGTTGGTTTGACGGGCCGTATTAAGTTTGGAATAGACAGATCTCTTATTCTGCCCGCATATGATGTCATTAATGTTATTGGAACTGGGTATAGACGGATTGGTTACTGGTCCAATTATTCTGGTTTGTCTATCACGCCTCCTGAGACACTTTATACAAAGCCACCAAATCGTTCAAGCTCAAACCAGAATTTGTACAATGCCATTTGGCCTGGGGATACATTGCTTACGCCACGTGGATGGGCTTTTGCTAACAATGGGAAGCAACTGAGAATTGGTGTGCCAATTCGGGTGAGTTTCCGAGAATTTGTATCGCAAGTACAAGGGACAGATACATTCAAGGGTTTCTGCATAGATGTTTTTACAGCTGCTGTAAGTCTATTACCATACCCTGTTCAATATCAGTTCATCCCCTTTGGAGATGGTAAAGAAAATCCAAGCTACACAGAGCTGGTGAATAAGATCACGACGGGTTTCTTTGATGCTGCTGTTGGTGATATTGCCATTGTAACCAAAAGAACGAAAGTCCTTGATTTTACGCAGCCATATGTTGCGTCTGGATTGGTTGTTGTGGCCCCATTTAGGAAGTTGAACTCTGGAGCCTGGGCTTTCCTGAGGCCATTCAGTGCCCGTATGTGGATTGTCACTGCTTGTTTCTTCCTTGTTGTTGGCTTGGTTGTGTGGATTCTGGAGCATAGGATAAATGACGACTTCAGGGGCCCTCCTAAAAGACAAATAATAACTGTTTTATGGTTCAGCCTCTCAACTCTATTTTTCGCTCATAGAGAAAACACTATGAGCACCCTTGCGCGGTTTGTGCTACTTATATGGCTCTTTGTGGTCTTAATAATCAACTCAAGCTACACTGCAAGTTTGACTTCAATTTTCACAGTGCAGCAACTATCTTCTCCTATTAAAGGAATTGAAAGCTTGAAGGAAAGCAATGAGCCTATAGGATACCAGGTGGGTTCGTTTGCTGAATATTATTTGAGAGAGGAAGTTGGAATATCCAAATCTAGGCTTGTTGCCTTGGGATCACCAGAAGCATATGCTAATGCACTCCAACTTGGTCCTGAAAAAGGGGGTGTTGCTGCCATTGTTGATGAACTTCCTTATGTGGAACTTTTCCTCTCAAGGCAGTGCACATTCAGGATTGTTGGTCAAGAATTTACAAAAAGTGGCTGGGGTTTTGCGTTTCCAAGAGACTCTCCCTTAGCTTTGGATATGTCAACTGCAATTCTAGCACTCTCAGAGAATGGTGATCTCCAACGGATCCATGACAAGTGGCTTACGCAAAGCACATGCAGTTCAGAGACATCTGAGCTTGAATCAGATAGACTTCACCTCAAGAGCTTTTGGGGCCTCTTTCTCATTTGTGGTCTAGCTTGCTTCATTTCCCTCCTCATACACTTTTACCTGATTGCACGCAAGTTATATCACGCCACCCCTGAAGAATCTCCATCTGCTGGTCAAGGTTCCTCGCGTTCTAGGCGTCTTCATAGACTATTATCATTAATGGATGAGAAGGCTGGCCAAGAAAAGAGTGCAGTTAAAAGAAGGAAGTTGGAAAGATCATTATCCGAGAATGATCGGGACTGTGAGTTGGGGAGGAATCCCATGAGGAAAGAAACAGAAAGGATGACCGGAACAACATCAACTTAA

[0086] Pop_G05G008778.T1序列：

[0087] ATGAACGCGGTTAGGTTTGTTTCGTGTCTTTTTCTCTTTTGTGTACTGTTTTCATCAAGTGGATATAGTAGGAATGTGAGCTCAAGGCCTGCCGTTGTGAATATTGGAGCTATTTTTACCTTCGAATCTACGATTGGAAGAGCTGCCAAGATTGCTATCCAGGAAGCTGTCAAAGATGTGAATGCAAATTCTAGCATTCTGCATGGCACCGAACTCAAAATTCATATGAGAAACTCTAACTGCAGTGGGTTTCTAGGCTTGGCTGAAGGTTTGAAGTTCACGGAGAATGATGTCATTGCTGTTATTGGCCCGCAATCTTCTGTTGTTGCCCATATTATATCCCATGTCGCTAATGAACTTCAAGTTCCCCTATTGTCATTTGCAGCAACAGACCCCACTCTTAGCTCGCTGCAGTTCCCCTTTTTTGTTAGGACCACGCAGAGTGATTTCTACCAAATGGCGGCAATATCAGAGGTAGTTGATCATTATGGTTGGAAGCAGGTGACTGCCATTTTCATTGATAATGATTATGGACGAAATGGCGTGTCAGCTCTAGGTGATAGACTTGCAGAGAGACGTTGTAGAATATCTTACAAGGTGGGGATTCCCCCGGATTCTGGAGTTAATAGGGGTGACATCACGGATATTCTTGTTAAGGTCGCGTTAATGGAATCTCGGGTTGTAATTGTCCATGTGTATCCTGACATGGGTTTCAAGATCTTTTCCATGGCAAACCATCTTGAAATGATGGGTAATGGGTGGGTATGGATTGCCACGGATTGGCTTTCATCTGTTTTGGATTCTGCTTCACCTCTCCCATCAGAGACCATGGACTCAGTGCAAGGGGTTCTTGTTTTGCGTCAACACACACCAGATTCAGATAGAAAGAGAGCCTTTTCCTCTAGGTGGCTCAAATTGACTGGTGGTTCTTTGGGGCTGCATTCTTATGGACTTTATGCTTATGATTCTGTCTGGCTAATTGCGCATGCTCTTGATGCATTTTTTAACCAGGGTGGTATGATCTCATTTTCTAACGATTCCAGGTTACCTTCTGGGGAAGGTAGTAGTCTCCACCTTGAGGCAATAAGCATCTTTGATGATGGAAAACTTCTGCTGAATAACATATTGCAGAGTGATTTTGTTGGTTTGACGGGCCGTATTAAGTTTGGAATGGACAGATCTCTTATTCTACCTGCATATGATGTCATTAATGTTATTGGAACTGGGTATAGACGGATTGGTTACTGGTCCAATTATTCTGGTTTGTCTATCATGCCTCCTGAGACACTTTATACAAAGCCACCAAATCGCTCAAGCTCAAACCAGAATTTGTACAATGCCATTTGGCCTGGGGATACATTGCTTACACCACGTGGATGGGCTTTTGCTAACAATGGGAAGCAACTGAGAATTGGTGTGCCAATTCGGGTGAGTTTCCGAGAATTTGTATCGCAAGTACAAGGGACAGATACGTTCAAGGGTTTCTGCATAGATGTTTTTACAGCTGCTGTAAGTCTATTACCATACCCTGTTCAATATCAGTTCGTCCCCTTTGGAGATGGTAAAGAAAATCCAAGCTACACAGAGCTGGTGAATAAGATCACGACGGGTTTCTTTGATGCTGCTGTTGGTGATATTGCCATTGTAACCAAAAGAACGAAAGTCCTTGATTTTACGCAGCCATATGTTGCGTCTGGATTGGTTGTTGTGGCCCCATTTAGGAAGTTGAACTCTGGAGCCTGGGCTTTCCTGAGGCCATTCAGTGCCCGTATGTGGATTGTCACTGCTTGTTTCTTCCTTGTTGTTGGCTTGGTTGTGTGGATTCTGGAGCATAGGATAAATGACGACTTCAGGGGCCCTCCTAAAAGACAAATAATAACTGTTTTATGGTTCAGCCTCTCAACTCTATTTTTCGCTCATAGAGAAAACACTATGAGCACCCTTGCTCGGTTTGTGCTACTTATATGGCTCTTTGTGGTCTTAATAATCAACTCAAGCTACACTGCAAGTTTGACTTCAATTTTCACAGTGCAGCAACTATCTTCTCCTATTAAAGGAATTGAAAGCTTGAAGGAAAGCAATGAGCCTATAGGATACCAGGTGGGTTCGTTTGCTGAATATTATTTGAGAGAGGAAGTTGGAATATCTAAATCTAGGCTTGTTGCCTTGGGATCACCAGAAGCATATGCTAATGCACTCAAACTTGGTCCTGAAAAAGGGGGTGTTGCTGCAATTGTTGATGAACTTCCTTATGTGGAACTTTTCCTCTCAAGGCAGTGCACATTCAGGATTGTTGGTCAAGAATTTACAAAAAGTGGCTGGGGTTTTGCGTTTCCAAGAGACTCTCCCTTAGCTTTGGATATGTCAACTGCAATTCTAGCACTCTCAGAGAATGGTGATCTCCAACGGATCCATGACAAGTGGCTTACGCAAAGCACATGCAGTTCAGAGACATCTGAGCTTGAATCAGATAGACTTCACCTCAAGAGCTTTTGGGGCCTCTTTCTCATTTGTGGTCTAGCTTGCTTCATTTCCCTCCTCATACACTTTTTCCTGATTACACGCAAGTTATATCACACCAACCCTGAAGAATCTCCATCTGGTGGTCAAGGTTCCTCGCGTTCTGGGCGTCTTCATAGACTATTATCATTAATGGATGAGAAGGCTGGCCAAGACAATAGTGCAGTTAAAAGAAGGAAGTTGGAAAGATCATTATCCGACAATGATCGGGACTGTGAGTTGGGGAGGAATCCCATGAGGAAAGAAACAGAAAGGATGACCGGAACAATGTCAACTTAA

[0088] 实施例1：钙浓度对杨树生长的影响

[0089] 在不含琼脂、蔗糖和钙盐的MS培养基(购买自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，货号为：HB8469‑21)按照要求添加水后，分别添加氯化钙到终浓度0.1mM(钙缺乏)、1mM(低钙)、5mM(钙充足)、10mM(高钙)，得到水培液1、水培液2，水培液3和水培液4。

[0090] 选用同一批次生根一个月后的野生型84K杨(Populus alba×P.glandulosa)杨树常规组织培养苗，用常规方法在水培液3中预培养一个月，然后移植到新的培养瓶中分别用前述四种水培液常规水培培养两周，探索不同钙条件下的培养后植株表型差异。四种浓度钙盐培养的杨树植株形态参见图1，地上枝条和根的鲜重和干重，侧根的数量以及根中木质素、纤维素和木糖含量参见图2。形态比较显示植物生长有明显差异。在水培液中以5mM的2+ 2+ 2
Ca 供应(Ca充足)生长的植物在后续实验中被用作对照。在1mM Ca (低钙胁迫)或10mM Ca+ 2+
(高钙胁迫)培养下的植物地上部分与对照没有显著差异，在0.1mM Ca (钙缺乏)下生长的植物显示出淡黄色皱纹的叶子(图1)，并且鲜重(FW)和干重(DW)降低(图2A)。Ca缺乏和1mM处理导致根的表型相反。在缺钙的情况下，观察到密度较低、主要呈褐色和坏死的根，侧根数量减少(图1和图2B)，根的FW和DW分别显着降低了58.4％和41.0％(图2B)，而在低钙1mM 
2+
Ca 供应下与对照相比观察到更密集的根、增加的生物量积累和增强的侧根(图1、图2A和图
2B)。此外，根细胞的纤维素、木聚糖和木质素含量在不同的Ca水平上有所不同(图2C)。在Ca缺乏状态中，纤维素、木聚糖和木质素含量显着低于其他Ca水平(图2C)。这些结果表明，Ca在杨树根系生长中具有重要的调节作用。

[0091] 实施例2：钙处理杨树基因表达谱的影响

[0092] 针对实施例1四种水培液培养两周的84K杨树苗，分别取茎尖、叶片、茎和根，一共16种样本，3个重复，提取RNA，通过Illumina HiSeq X Ten平台的Paired‑end 150‑bp模式进行转录组测序，结合前述84K杨基因组进行分析，共得到31869个转录的基因。主成分分析(Principal component analysis,PCA)显示，这些基因在前述四种组织样本中具有组织特异性表达模式。使用R package WGCNA v.1.71针对数据进行加权基因共表达网络分析(Weighted gene co‑expression network analysis,WGCNA)显示，所有表达的基因分为17种模块。在其一种模块中(参见图3)，一些谷氨酸受体基因呈现出共表达网络，需要更进一步研究这些基因。

[0093] 实施例3：谷氨酸受体基因钙离子应激表达谱的研究

[0094] 通过实施例2的实验可见，培养液中钙离子浓度影响杨树苗GLR基因的表达谱。为了进一步研究PagGLR成员的组织特异性，以及在钙离子介导过程中的潜在功能与相应机制，针对实施例2所述16中样本，分别以PtrUBQ作为内参基因，针对84K杨中的PagGLR3.7、PagGLR3.4/3.5b、PagGLR3.4/3.5a、PagGLR3.3b、PagGLR3.3a、PagGLR3.1/3.2、PagGLR3.6a和PagGLR3.6b基因，进行qRT‑PCR检测，结果热图参见图4。

[0095] 前述七个基因在毛果杨中同源基因名称及相关基因在前述毛果杨基因组中的基因ID分别依次为：PopGLR3.7(Potri.002G229900)、PopGLR3.4/3.5b(Potri.014G152200)、PopGLR3.4/3.5a(Potri.002G230000)、PopGLR3.3b(Potri.005G253800)、PopGLR3.3a(Potri.002G007400)、PopGLR3.1/3.2(Potri.009G168300)、PopGLR3.6a(Potri.005G102600)、PopGLR3.6b(Potri.005G102700)。

[0096] 由图4可见，GLR亚家族III的基因具有更高的表达丰度。表达谱显示，在钙缺乏的情况下，GLR3.3b在杨树根和茎中的表达显著上调(图4)。系统发育分析表明，84K杨树基因组中存在两个近缘基因GLR3.3a和GLR3.3b。因为存在潜在的基因冗余，为了降低两个基因表达调控以及表达产物的冗余影响，在后续研究中分别针对这两个同源基因进行遗传操作与研究。采用实施例1中经过水培液3培养两周后的84K杨树苗，提取样本总RNA，通过定量PCR方法，测定84K杨树PopGLR3.3a同源基因PagGLR3.3a和PopGLR3.3b同源基因PagGLR3.3b在根、茎、叶中的表达量，将叶中表达量归一化为参照，统计结果参见图5。由图5可见，定量PCR分析显示PagGLR3.3a和PagGLR3.3b在根和茎中的表达量高于叶。

[0097] 实施例4：GLR基因启动子活性的研究

[0098] 为了进一步获得详细的基因表达组织特异性信息，以84K杨基因组为模板，以GLR3.3aPro_F和GLR3.3aPro_R为引物，克隆了PagGLR3.3a的启动子ProPagGLR3.3a，以GLR3.3bPro_F和GLR3.3bPro_R为引物克隆了PagGLR3.3b的启动子ProPagGLR3.3b。

[0099] GLR3.3aPro_F(SEQ ID NO:5)：TTCTACCATTTCGATACATGC

[0100] GLR3.3aPro_R(SEQ ID NO:6)：TTCAATTCAATAACACAATTATCTTCTC

[0101] GLR3.3bPro_F(SEQ ID NO:7)：TTGTTTTAATTCAATGTCGAGCT

[0102] GLR3.3bPro_R(SEQ ID NO:8)：TTCAATTCAATAGCACAATTATCTTCCCC

[0103] 将ProPagGLR3.3a和ProPagGLR3.3b分别连接到PMDC164载体中的GUS基因(β‑葡萄糖苷酶基因)上游启动子区，并构建重组表达载体，通过常规叶盘转化法转化84K杨，获得各自启动子转基因杨树植株。

[0104] 针对一月龄转基因植株，使用含有X‑Gluc的GUS染液进行常规组织学染色，植株照片参见图6，由此可见，GUS信号存在于杨树茎、根等维管组织中。针对一月龄转基因植株，进一步针对茎的第五节间和根的横截面进行石蜡切片分析，结果照片参见图7。表明GUS信号分布在茎和根的韧皮部。

[0105] 实施例5：基因敲除植株的制备

[0106] 本发明使用的CRISPR/Cas9系统(版本的使用方法参见文献Yi An,Yangyan Zhou,Xiao Han,Chao  Shen,Shu Wang,Chao Liu,Weilun Yin,Xinli Xia.The GATA transcription factor GNC plays an important role in photosynthesis and growth in poplar.J Exp Bot.2020Mar 25；71(6):1969‑1984.)为Andrew Groover实验室赠与，其入门载体为pEn‑Chimera1.1，也叫作pEn‑C1.1，含有第一gRNA靶标插入位点以及gRNA表达元件；目的载体为pDe‑Cas9，也叫作pDe‑Cas9‑npt，含有第二gRNA靶标插入位点以及gRNA表达元件，还有具有表达元件的Cas9基因；通过Gateway反应将插入第一gRNA靶标的入门载体和插入第二gRNA靶标目的载体重组后，就具备了同时敲除两个靶点的CRISPR/Cas9载体，该载体适用于通过农杆菌转化植物。

[0107] 1.基因靶位点的选择

[0108] 根据本发明构建的84K杨基因组数据库，分析PagGLR3.3a和PagGLR3.3b基因的CDS区并分析结构，明确内含子和外显子部分。按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。利用在线分析平台CRISPR‑P(方法参见Liu,H.,Ding,Y.,Zhou,Y.,Jin,W.,Xie,K.,Chen,L.L.,2017.CRISPR‑P 2.0:An Improved CRISPR‑Cas9 Tool for Genome Editing in Plants.Mol Plant 10,530‑532.)和ZiFiT Targeted Version4.2查找潜在的Cas9靶位点(方法参见Sander J D,Maeder M L,Reyon D,Voytas D F,Joung J K,Dobbs D.ZiFiT(Zinc Finger Targeter):an updated zinc finger engineering tool[J].Nucleic Acids Research,2010,gkq319)。为了分析PagGLR3.3的具体功能，使用CRISPR/Cas9系统对PagGLR3.3基因的编码序列进行突变编辑。每个基因选择两个靶位点进行突变，即每个基因设计了2个靶位点。为了编辑PagGLR3.3a基因，根据基因序列特征设计特异性靶点系列1，根据前述Pop_A02G026914.T1和Pop_G02G065355.T1的相同序列部分(针对父本来源和母本来源的靶点相同)设计5个靶点，选择位于第二外显子上的靶点T1和T2(称作靶点组合1)进行后续基因敲除工作，该两个靶点及其之间的序列参见图8。为了编辑PagGLR3.3b基因，根据基因序列特征设计特异性靶点系列2，根据前述Pop_A05G057109.T1和Pop_G05G008778.T1的相同序列部分(针对父本来源和母本来源的靶点相同)设计5个靶点，选择位于第二外显子上的靶点T1和位于第三外显子上的靶点T2(称作靶点组合2)进行后续基因敲除工作，该两个靶点及其之间的序列参见图9。为了消除基因冗余效应，同时针对两个基因进行突变编辑操作，根据前述Pop_A02G026914.T1、Pop_G02G065355.T1、Pop_A05G057109.T1和Pop_G05G008778.T1的相同序列部分(针对PagGLR3.3a和PagGLR3.3b父本来源和母本来源的靶点相同)设计4个靶点，选择位于第二外显子上的靶点T1和位于第三外显子上的靶点T2(称作靶点组合3)进行后续基因敲除工作，该两个靶点及相关序列参见图10。三个靶点系列的序列如下。

[0109] 靶点系列1：

[0110] T1(SEQ ID NO:9)：5’‑CCGATATTGTTGCCATTATCGG‑3’；

[0111] T2(SEQ ID NO:10)：5’‑TTGAAGCTGATTCGCAACATGG‑3’

[0112] T2在编码链中的序列为(SEQ ID NO:11)：5’‑CCATGTTGCGAATCAGCTTCAA‑3’[0113] T3(SEQ ID NO:12)：5’‑TAGGAATCTGACCTCAAGG‑3’

[0114] T4(SEQ ID NO:13)：5’‑GCCAAGATTGCTATTCAGG‑3’

[0115] T5(SEQ ID NO:14)：5’‑ACTGCAGTGGGTTTCTAGG‑3’

[0116] 靶点系列2：

[0117] T1(SEQ ID NO:15)：5’‑GACCATGGACTCAGTGCAAGGG‑3’

[0118] T2(SEQ ID NO:16)：5’‑GGTAGTAGTCTCCACCTTGAGG‑3’

[0119] T3(SEQ ID NO:17)：5’‑GCCAAGATTGCTATCCAGG‑3’

[0120] T4(SEQ ID NO:18)：5’‑ATGGCGGCAATATCAGAGG‑3’

[0121] T5(SEQ ID NO:19)：5’‑CATTATGGTTGGAAGCAGG‑3’

[0122] 靶点系列3：

[0123] T1(SEQ ID NO:20)：5’‑GATGGGTAATGGGTGGGTATGG‑3’

[0124] T2(SEQ ID NO:21)：5’‑CCCGGATTCTGGAGTTAATAGG‑3’

[0125] T3(SEQ ID NO:22)：5’‑TGTAGAATATCTTACAAGG‑3’

[0126] T4(SEQ ID NO:23)：5’‑GGATTCTGGAGTTAATAGG‑3’

[0127] 通过PCR分别扩增84K杨的PagGLR3.3a和PagGLR3.3b基因的序列，进行Sanger法测序，验证了高通量测序得到的基因序列的正确性以及靶点序列的正确性(真实存在)。

[0128] 2.gRNA的设计

[0129] 针对靶点组合1靶点T1合成寡核苷酸gRNAa1_GLR_F2和gRNAa1_GLR_R2，将二者退火形成双链C1T1。

[0130] 针对靶点组合1靶点T2合成寡核苷酸gRNAa2_GLR_F3和gRNAa2_GLR_R3，将二者退火形成双链C1T2。

[0131] 针对靶点组合2靶点T1合成寡核苷酸gRNAb1_GLR_F和gRNAb1_GLR_R，将二者退火形成双链C2T1。

[0132] 针对靶点组合2靶点T2合成寡核苷酸gRNAb2_GLR_F和gRNAb2_GLR_R，将二者退火形成双链C2T2。

[0133] 针对靶点组合3靶点T1合成寡核苷酸gRNAab1_GLR_F和gRNAab1_GLR_R，将二者退火形成双链C3T1。

[0134] 针对靶点组合3靶点T2合成寡核苷酸gRNAab2_GLR_F和gRNAab2_GLR_R，将二者退火形成双链C3T2。

[0135] gRNAa1_GLR_F2(SEQ ID NO:24)：attgCCGATATTGTTGCCATTAT

[0136] gRNAa1_GLR_R2(SEQ ID NO:25)：aaacATAATGGCAACAATATCGG

[0137] gRNAa2_GLR_F3(SEQ ID NO:26)：attgTTGAAGCTGATTCGCAACA

[0138] gRNAa2_GLR_R3(SEQ ID NO:27)：aaacTGTTGCGAATCAGCTTCAA

[0139] gRNAb1_GLR_F(SEQ ID NO:28)：attgGACCATGGACTCAGTGCAA

[0140] gRNAb1_GLR_R(SEQ ID NO:29)：aaacTTGCACTGAGTCCATGGTC

[0141] gRNAb2_GLR_F(SEQ ID NO:30)：attgGGTAGTAGTCTCCACCTTG

[0142] gRNAb2_GLR_R(SEQ ID NO:31)：aaacCAAGGTGGAGACTACTACC

[0143] gRNAab1_GLR_F(SEQ ID NO:32)：attgCCCGGATTCTGGAGTTAAT

[0144] gRNAab1_GLR_R(SEQ ID NO:33)：aaacATTAACTCCAGAATCCGGG

[0145] gRNAab2_GLR_F(SEQ ID NO:34)：attgGATGGGTAATGGGTGGGTA

[0146] gRNAab2_GLR_R(SEQ ID NO:35)：aaacTACCCACCCATTACCCATC

[0147] 3.重组入门载体的制备

[0148] 在限制性内切酶NEB BbsI的作用下，将pEn‑Chimera1.1载体酶切线性化，将线性化的载体分别与双链C1T1、双链C2T1、双链C3T1在T4DNA连接酶的作用下进行连接，将重组载体分别转化感受态DH5α细胞中进行筛选培养，提取质粒，经电泳确定重组阳性克隆成功后进行Sanger法测序验证重组序列的正确性，分别得到重组入门载体EVC1T1、EVC2T1、EVC3T1。

[0149] 4.重组目的载体的制备

[0150] 在限制性内切酶Bsu36I的作用下，将pDe‑Cas9载体酶切线性化，将线性化的载体分别与双链C1T2、双链C2T2、双链C3T2在T4DNA连接酶的作用下进行连接，将重组载体分别转化感受态DH5α细胞中进行筛选培养，提取质粒，经电泳确定重组阳性克隆成功后进行Sanger法测序验证重组序列的正确性，分别得到重组入门载体DVC1T2、DVC2T2、DVC3T2。

[0151] 5.重组基因敲除载体的制备

[0152] 将重组入门载体EVC1T1与重组目的载体DVC1T2混合，在LR clonase II enzyme mix的作用下，通过Gateway反应，形成重组产物，将重组产物转化感受态农杆菌GV3101中进行筛选培养，提取质粒，经电泳确定重组阳性克隆成功后进行Sanger法测序验证重组序列的正确性，得到重组农杆菌菌液1。同样的方法通过重组入门载体EVC2T1与DVC2T2，得到重组农杆菌菌液2。通过重组入门载体EVC3T1与重组目的载体DVC3T2，得到重组农杆菌菌液3。

[0153] 6.84k杨叶盘浸染转化

[0154] (1)外植体处理：取生长4‑6周的84K杨树组织培养苗的嫩叶叶片作为外植体转化材料。取材后先用清水对叶片进行清洗，然后在超净台中用20w/v％的次氯酸钠水溶液消毒20min，用无菌蒸馏水清洗至少5遍，确保材料表面没有次氯酸钠残留，用无菌滤纸吸取多余蒸馏水。

[0155] (2)农杆菌的培养：在含有100mg/L Kan和50mg/L Rif的YEP液体培养基(200mL)中28℃、180rpm摇床过夜摇菌培养重组农杆菌菌液1，在对数期扩增后在3600rmp，4度离心10‑
15min，菌体用无菌的1/2MS(带蔗糖)溶液重悬到最终OD600约为0.4，得到侵染菌液1待用。

[0156] (3)侵染：将消毒的外植体叶用刀尖将主叶脉划出伤口、切除叶缘、切成约0.5×2.0cm大小，然后在OD600约为0.4菌液中侵染10‑20min，其间轻轻旋转振荡，使每一叶片均能与农杆菌密切接触。

[0157] (4)共培养：将侵染后的叶片用滤纸吸干菌液平铺在共培养基上，避光放置2天，以便将带有目的基因的农杆菌转入叶片中。共培养基以WPM为基础培养基，还含有20g/L蔗糖、7.8g/L琼脂、0.5g/L MES(2‑吗啉乙磺酸)、100μMAS(乙酰丁香酮)，pH5.9。

[0158] (5)筛选培养：将叶片撕开并转移到筛选培养基上继续暗培养约两周，愈伤长出后，继代到新的筛选培养基。两周继代一次，大约2‑4周长出愈伤。筛选培养基以WPM为基础培养基，还含有20g/L蔗糖、7.8g/L琼脂、0.5g/LMES、1.0mg/L2,4‑D、0.1mg/LKT、200mg/L头孢霉素、200mg/L特美汀、1.5mg/L潮霉素B，pH5.9。

[0159] (6)分化培养：愈伤至大米粒大小时，转移至分化培养基上约三周继代一次，培养‑2 ‑1温度为25℃，光照强度为50μmol·m ·s ，光周期为16h光照/8h黑暗。期间愈伤会变绿，变硬，生芽。本阶段大约两个月左右。分化培养基以WPM为基础培养基，还含有20g/L蔗糖、
7.8g/L琼脂、0.5g/L MES、0.05mg/LNAA、0.5mg/L6‑BA、200mg/L头孢霉素、200mg/L特美汀、
1.5mg/L潮霉素B，pH5.9。

[0160] (7)生根培养：待小苗生长约1cm后，切下，放入生根培养基约一周生根，培养温度‑2 ‑1为25℃，光照强度为50μmol·m ·s ，光周期为16h光照/8h黑暗。生根培养基以WPM为基础培养基，还含有10g/L蔗糖、7.8g/L琼脂、0.5g/L MES、200mg/L头孢霉素、200mg/L特美汀、
1.5mg/L潮霉素B，pH5.9。

[0161] (8)结果：生根2周后，提取植株DNA，利用CRISPR载体上的特异性引物进行PCR检测，获得阳性转基因植株，选择10株进行后续研究。

[0162] 使用前述相同的方法，使用重组农杆菌菌液2针对靶点组合2的前述基因敲除操作，选择10个阳性转基因植株进行后续研究。使用重组农杆菌菌液3针对靶点组合3的前述基因敲除操作，选择10个阳性转基因植株进行后续研究。

[0163] 7.转基因植株的突变鉴定

[0164] 针对靶点组合1基因敲除操作的10个阳性株，分别提取基因组DNA，采用gRNA靶位点检测的特异性引物GLRa_Mut_F1和GLRa_Mut_R1为引物进行PCR扩增，将扩增产物连接到T载体上。转化大肠杆菌，获得单菌落。然后提取质粒，用于靶位点的测序。将测序结果与对照序列比较，分析突变效果。#3、#6和#7号植株与野生对照植株(CK)的敲除部位序列参见图8。两个序列分别代表84K杨中来自父本的序列和来自母本的序列。由此可见，该三个转基因阳性植株的PagGLR3.3a基因的两个等位基因序列都在两个靶点之间发生了大片段删除，成功敲除了基因。采用相同的方法，针对靶点组合2基因敲除操作的10个阳性株，以GLRb_Mut_F1和GLRb_Mut_R1为引物，#4、#6和#8号植株与野生对照植株(CK)的敲除部位序列参见图9。由此可见，该三个转基因阳性植株的PagGLR3.3b基因的两个等位基因序列都在两个靶点之间发生了大片段删除，成功敲除了基因。采用相同的方法，针对靶点组合3基因敲除操作的10个阳性株，以GLRa_Mut_F2和GLRa_Mut_R2为引物扩增PagGLR3.3a基因，以GLRb_Mut_F2和GLRb_Mut_R2为引物扩增PagGLR3.3b基因，#3、#6和#9号植株与野生对照植株(CK)的敲除部位序列参见图11。由此可见，该三个转基因阳性植株的PagGLR3.3a基因和PagGLR3.3b基因的两个等位基因序列都在两个靶点所在位置发生了插入或删除，成功敲除了基因。

[0165] GLRa_Mut_F1(SEQ ID NO:36)：ATGGATTCTATTAGGTCTGGTTGTTGG

[0166] GLRa_Mut_R1(SEQ ID NO:37)：ATTACCCATCATTTGAAGGCGGTT

[0167] GLRb_Mut_F1(SEQ ID NO:38)：GGATTGCCACGGATTGGCTTTC

[0168] GLRb_Mut_R1(SEQ ID NO:39)：CGACCAACAGCCAAAATGAGATGAT

[0169] GLRa_Mut_F2(SEQ ID NO:40)：CGGCCCACAATCTTCTGTCGT

[0170] GLRa_Mut_R2(SEQ ID NO:41)：GCCTCAAGGTGGAGACCACT

[0171] GLRb_Mut_F2(SEQ ID NO:42)：GGCCCGCAATCTTCTGTTGT

[0172] GLRb_Mut_R2(SEQ ID NO:43)：GGTGGAGACTACTACCTTCCCC

[0173] 由此可见，图8，9，11所示的9个转基因植株，均成功编辑了转基因植株的目标位点。每个目标的两个等位基因序列都产生了突变事件，并且从不同的编辑事件中产生了多个双等位突变体，可用于PagGLR3.3a和PagGLR3.3b基因的单基因敲除和双基因敲除的表型等方面的遗传学研究。

[0174] 实施例6：基因敲除植株的性状表征

[0175] 比较野生型(CK)、PagGLR3.3a基因编辑株(针对靶点组合1的基因敲除，代号：crispr‑PagGLR3.3a)、PagGLR3.3b基因编辑株(针对靶点组合2的基因敲除，代号：crispr‑PagGLR3.3b)、PagGLR3.3a、PagGLR3.3b双基因编辑株(针对靶点组合3的基因敲除，代号：
crispr‑PagGLR3.3ab)的性状。针对实施例5中得到的CK，crispr‑PagGLR3.3a的#3、#6和#7号植株，crispr‑PagGLR3.3b的#4、#6和#8号植株，以及crispr‑PagGLR3.3ab的#3、#6和#9号植株组织培养苗，进行观察与统计。

[0176] 各种结果统计参见图12，其中，A的上部示出了培养瓶底部的照片，下部示出了根的形态照片。B示出了四株杨树苗的侧根数量对照柱状图。C示出了四株杨树苗的侧根长度对照柱状图。D示出了四株杨树苗的硬度对照柱状图。E示出了CK与crispr‑PagGLR3.3ab从距离根尖1cm、2cm和5cm的根系横截面切片显微照片。在CK的2cm照片中，由上到下三个箭头所指分别为表皮，木质部和韧皮部，上面线段指示维管束，下面线段指示皮质。在A、B、C、D、E中，crispr‑PagGLR3.3a选择#3敲除株，crispr‑PagGLR3.3b选择#4敲除株，crispr‑PagGLR3.3ab选择#3敲除株。F示出了四株杨树苗从距离根尖1cm、2cm和5cm的根系横截面积对照柱状图。G示出了四株杨树苗根部维管束比对照柱状图。H示出了四株杨树苗根部维管木质部比对照柱状图。G、H中使用了对照和三种双敲除植株。

[0177] 由图12可见，形态学对比分析显示，crispr‑PagGLR3.3a和crispr‑PagGLR3.3b突变体植株的侧根数量比对照多，双突变体crispr‑PagGLR3.3ab具有更多的侧根分枝(图12A)。双突变体侧根数量较对照显著增加，且侧根长度较对照显著增加(图12B和图12C)。根系硬度测定结果显示，突变体植株显著高于对照，反映出突变体植株根系木质素含量高于对照(图12D)。从距离根尖1cm、2cm和5cm的根系不同发育部位的横切面分析可知，突变体植株木质部细胞增多，促进了次生维管组织的发育(图12E)。离根尖5cm的根的横截面面积、维管柱比例和维管柱木质部比例分别比对照提高了37％、28％和41％(图12F、12G和12H)。以上结果表明GLR3.3基因参与了杨树根系发育。

[0178] 野生对照与三种基因敲除株在平行培养条件和相同生长时间下的株高与地茎参见表1，取三株的平均值。

[0179] 表1.植株高度与地茎的统计比较

[0180]

[0181] 由此可见，本发明通过PagGLR3.3a和PagGLR3.3b基因单敲除或双敲除，除了增加根数量和长度外，还能够增加地茎降低株高，有助于牢固植根于土壤并且抗风吹倒伏能力增强。

[0182] 实施例7：基因敲除植株对钙离子的响应

[0183] 以无钙盐的1/2MS培养基为基础培养基，添加0.8％(w/v)琼脂，3％(w/v)蔗糖后，分别添加到终浓度1mM氯化钙；5mM氯化钙；5mM氯化钙+10mg/L氯化镧(lanthanum chloride,LaCl3)；10mM氯化钙，制备四种生根培养基，pH5.7。分别使用前述四种生根培养基，以常规方法做84K杨crispr‑PagGLR3.3ab#3和对照植株(CK)的叶片外植体的组织培养苗，生根培养一个月后，对其根形态进行拍照，统计侧根数量和长度，结果参见图13。

[0184] 由图13可见，低钙和钙通道抑制剂LaCl3处理促进了对照和crispr‑PagGLR3.3ab2+
植株的侧根生长(图13A)。在正常条件下(5mM Ca )，crispr‑PagGLR3.3ab植株的侧根数量相对于对照增加37％，侧根长度相较于对照增加48.5％；在LaCl3处理下，crispr‑PagGLR3.3ab植株的侧根数量相对于对照增加18.2％，侧根长度相较于对照增加47％；在低钙处理下，crispr‑PagGLR3.3ab植株的侧根数量相对于对照增加60.5％，侧根长度相较于对照增加61％(图13A，13B，13C)。结果表明，LaCl3和低钙处理均能显著促进杨树侧根数量和根长，而PagGLR3.3突变体进一步强化了这一效应。这些形态变化表明PagGLR3.3参与了钙离子介导的侧根发育。

[0185] 实施例8：基因双敲除植株对转录组的响应

[0186] 生根培养基以无钙盐的1/2MS培养基为基础培养基，添加0.8％(w/v)琼脂，3％(w/v)蔗糖，5mM氯化钙。使用前述生根培养基，以常规方法做84K杨crispr‑PagGLR3.3ab#3株和对照植株(CK)的组织培养苗，培养一个月后，提取各自侧根RNA，通过Illumina HiSeq X Ten平台的Paired‑end 150‑bp模式进行转录组测序，结合前述84K杨基因组信息进行比较转录组与功能分析。

[0187] 相对于野生型对照植株，双敲除植株有572个上调表达基因和70个下调表达基因。采用Gene ontology(GO)方法分析上调表达基因的功能，发现，在双敲除植株中上调表达的
2+ 2+
基因包括四种钙转运蛋白Ca ‑ATP酶基因，ACA7，ACA12a，ACA12b和ACA13(自身抑制的Ca ‑ATP酶)；蛋白激酶，比如，CIPK7(CBL‑interacting protein kinase 7)，CPK1(calcium‑dependent protein kinase 1)，MAPKKK19(mitogen‑activated protein kinase kinase kinase19)，MAPKKK21和WAG1基因；三种生长素运输相关ABC转运蛋白，ABCB21(ATP‑binding cassette B21)，可能影响生长素在细胞中的积累；一些过氧化物酶基因(PRX3，PRX4，PRX25和PRX52)，CAD7(cinnamyl‑alcohol dehydrogenase 7)，BCB(blue‑copper binding protein)和MYB43，参与木质素生物合成；一些木葡聚糖内糖基转移酶蛋白基因，XTH15和XTH23旁系同源基因，促进木葡聚糖代谢，参与侧根发育；一些转录因子，WRKY，MYB和ERF，可能调控细胞壁发育。针对基因ACA7，ABCB21a，PRX3，CAD7，MYB43a，BCB，XTH15a，XTH23a，CIPK7，WAG1，以野生型为对照，通过qPCR法测试双突变型侧根中的表达量，结果参见图14。
可见，这些基因表达量相对于野生型提高到约2.5‑4.5倍，差异显著，由此判断，这些基因的高表达是该基因敲除株促进侧根生长等方面的机制中的一部分。

[0188] 由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。