技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种优化杨树性状的PagSUPb基因及其应用。
相关背景技术
[0002] 杨树是我国重要的速生丰产用材树种之一。而不同用材对木质素含量的需求不同，如纸浆材需要木质素含量低、纤维素含量高和纤维长度长的木材，而建筑材、装饰材及大口径材等则需要增加木质素含量，以提高木材力学性质。如何根据不同用材的需要，改善木材品质，提高人工用材林资源质量，提高木材产量是目前林木育种亟待解决的问题。
[0003] SUP(SUPERMAN)基因在调节植物的生长、发育和响应胁迫中发挥着至关重要的作用，研究SUP基因在杨树发育中的作用，可能有助于实现木材材性的工程调控，以培育改良的树木品种。
具体实施方式
[0027] 本发明提供了一种优化杨树性状的基因PagSUPb，所述PagSUPb基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：MVKKYSSTVKDKWEKNN AIFKGEHSSVCSWPQRNYSCSFCKRQFISAQALGGHMNVHRRDRAKLRQLPSWFFKCPKYPTSNPNPDHLLSSSSKFLPYPDDHTHDHSPYLSSFSSPCCREKKSIVECQEGKDLTKKKSNAGAVFGVGELKKNFAQECDQLEVLRRSEIINLDMEMGCEDPKEVLDLELRLGL。
[0028] 在本发明中，所述PagSUPb基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.2所示，具体为：5'‑ATGGTCAAGAAATATAGCAGCACGGTTAAAGACAAATGGGAGA AGAACAACGCGATCTTTAAGGGAGAGCATTCAAGCGTTTGTTCATGGCCTCAAAGAAACTACTCATGCAGCTTTTGCAAGAGACAATTCATCTCTGCTCAAGCACTTGGGGGCCATATGAACGTTCACAGGAGAGATAGAGCCAAGCTGAGACAGCTACCTTCTTGGTTTTTTAAATGTCCAAAGTACCCTACTAGTAATCCTAACCCCGATCATTTACTTTCTTCGTCATCTAAGTTCTTGCCGTACCCTGATGATCACACTCATGATCATTCTCCATACCTGAGTTCTTTCTCTTCACCTTGTTGCCGAGAAAAGAAATCCATAGTTGAATGTCAAGAAGGTAAAGATTTAACAAAGAAGAAGAGCAATGCAGGAGCTGTGTTCGGGGTTGGAGAGTTGAAGAAAAATTTCGCACAAGAATGTGATCAACTTGAAGTTTTGAGGAGAAGTGAGATTATTAACTTGGACATGGAAATGGGGTGCGAAGATCCGAAGGAGGTTTTGGATTTGGAGCTTCGACTTGGCCTTTAA‑3'。
[0029] 本发明还提供了一种沉默上述技术方案所述PagSUPb基因的gRNA，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：5'‑GGGGCCATATGAACG TTCAC‑3'。
[0030] 本发明还提供了一种优化杨树性状的重组载体，所述重组载体包括基础载体和插入所述基础载体的gRNA；
[0031] 所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0032] 本发明还提供了上述技术方案所述的重组载体的构建方法，包括以下步骤：
[0033] 将用于合成gRNA的退火引物退火，得到退火产物；
[0034] 将所述退火产物插入基础载体，得到所述重组载体；
[0035] 所述退火引物由PagSUPb‑T2‑F和PagSUPb‑T2‑R组成；所述PagSUPb‑T2‑F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体为：5'‑gtcAGGGGCCATATGAACG TTCAC‑3'；所述PagSUPb‑T2‑R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体为：5'‑aaacGTGAACGTTCATATGGCCCC‑3'。
[0036] 在本发明中，所述基础载体优选为pYLCRISPR/Cas9‑DH；所述退火的温度优选为90℃，所述退火的时间优选为30s；
[0037] 所述退火的体系优选包括：pYLgRNA‑AtU3d/U3b 1μL，BsaI 0.5μL，NEB rCutsmartbuffer 1μL，靶点接头0.5μL，T4 DNAligase 0.1μL，T4 DNAligase buffer0.5μL，ddH2O 6.4μL。
[0038] 本发明还提供了一种优化杨树性状的重组工程菌，所述重组工程菌包括上述技术方案所述的重组载体和基础菌株。
[0039] 在本发明中，所述基础菌株优选为农杆菌，更优选为农杆菌GV3101。
[0040] 本发明还提供了一种优化杨树性状的方法，包括：将上述技术方案所述的重组工程菌导入杨树受体后培养。
[0041] 本发明中优选利用所述重组工程菌侵染杨树受体后在黑暗条件下进行培养。本发明所述侵染的时间优选为10～20min，更优选为15min；所述培养的温度优选为22～26℃，更优选为25℃，所述培养的时间优选为2～3d；所述杨树受体包括杨树愈伤组织；所述杨树优选为银腺杨84K。
[0042] 在本发明中，所述利用重组工程菌侵染杨树受体的方式优选为：将重组工程菌重悬液与杨树愈伤组织混合；所述重组工程菌重悬液的制备方法优选为：将重组工程菌进行菌落PCR，筛选得到阳性单菌落，将阳性单菌落扩大培养至OD600＝0.4～0.6，然后富集菌液，离心后重悬至OD600＝0.4～0.6。所述扩大培养优选为依次进行的第一培养和第二培养；所述第一培养的培养基优选为含有50mg/LKanamycin、10mg/L Gentamicin和17mg/L Rifampicin抗生素的LB液体培养基，所述第一培养的条件优选为28℃，200rpm，培养时间优选为12～14h；所述第二培养的培养基优选为含有50mg/L Kanamycin、10mg/L Gentamicin和17mg/L Rifampicin抗生素的LB液体培养基；所述第二培养优选为将第一培养所得的菌液与第二培养的培养基按照体积比为1：500进行转接，所述第二培养的条件优选为28℃，200rpm，培养时间优选为13h。
[0043] 所述离心优选为3500rpm离心15min；所述重悬优选为使用无菌重悬液进行重悬，所述重悬液优选为100μmol/L acetosyringone(AS，乙酰丁香酮)溶液。
[0044] 在本发明中，所述培养优选为使用共培养培养基进行培养；所述共培养培养基优选为含有100μMAS的1/2MS培养基
[0045] 本发明还提供了上述技术方案所述的PagSUPb基因或所述gRNA或重组载体或重组工程菌在优化杨树性状中的应用。
[0046] 在本发明中，所述优化杨树性状优选包括提高杨树地径、增加杨树节间数、增加杨树茎长、增加杨树茎粗、提高杨树总生物量和提高杨树中木质素含量中的一种或多种；更优选为提高杨树总生物量和提高杨树中木质素含量。
[0047] 为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种优化杨树性状的PagSUPb基因及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0048] 实施例1
[0049] 1.引物设计
[0050] 根据CRISPR‑GE(http://skl.scau.edu.cn/)在线网站分析设计靶位点，在PagSUP基因的编码区序列中选取一段20bp的核苷酸序列(PAM)作为靶序列，具体为：5'‑GGGGCCATATGAACGTTCAC‑3'(SEQ ID No.3)；设计得到沉默PagSUPb基因表达的引物组PagSUPb‑T1‑F和PagSUPb‑T1‑R，其序列如下：
[0051] PagSUPb‑T2‑F：5'‑gtcAGGGGCCATATGAACGTTCAC‑3'(SEQ ID No.4)；
[0052] PagSUPb‑T2‑R：5'‑aaacGTGAACGTTCATATGGCCCC‑3'(SEQ ID No.5)。
[0053] 2.靶点接头的制备
[0054] 将合成的引物PagSUPb‑T2‑F和PagSUPb‑T2‑R分别用ddH2O溶解至10μM，各取1μL加入到8μL ddH2O混合，稀释至1μM，90℃反应30s，移至室温冷却完成退火，得到靶点接头。进行酶切连接反应，体系如表1所示，其反应条件为37℃5min；20℃5min，5个循环。
[0055] 表1酶切连接反应体系
[0056]
[0057] 3.gRNA表达盒的扩增
[0058] 第一轮PCR扩增体系如表2所示，反应条件为95℃3min；95℃15s，55℃15s，68℃10s，30个循环。
[0059] 表2第一轮PCR扩增体系
[0060]
[0061] 注：表格中的U‑F和gRNA‑R为Cas9系统固定引物，其序列具体为：
[0062] U‑F：5'‑CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG‑3'(SEQ ID No.6)；
[0063] gRNA‑R：5'‑CGGAGGAAAATTCCATCCAC‑3'(SEQ ID No.7)。
[0064] 反应结束后，取4μL产物进行电泳检查并将剩余产物继续进行二轮PCR反应。
[0065] 第二轮PCR扩增：
[0066] 取第一轮PCR反应产物1μL，用ddH2O稀释10倍，95℃反应10s。然后取1μL作为第二轮PCR的扩增模板，第二轮PCR扩增体系如表3所示，反应条件为：95℃3min；95℃15s，55℃15s，68℃10s，30个循环。
[0067] 表3第二轮PCR扩增体系
[0068]
[0069] 注：表格中的B1’和BL为Cas9系统固定引物，其序列具体为：
[0070] B1’：5'‑TTCAGAggtctcTctcgACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG‑3'(SEQ IDNo.8)；
[0071] BL：5'‑AGCGTGggtctcGaccgACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC‑3'(SEQ IDNo.9)。
[0072] 4.PCR产物纯化及表达载体连接：
[0073] 将第一轮PCR反应产物与第二轮PCR反应产物进行等量混合，采用PCR产物纯化试剂盒进行纯化后进行pYLCRISPR/Cas9‑DH终载体连接，反应体系如表4所示；反应条件为：37℃2min；10℃3min，20℃5min，15个循环；37℃2min。
[0074] 表4载体连接体系
[0075]
[0076] 将以上反应后的混合液取5μL转化大肠杆菌并涂布于筛选培养基(含50mg/LKanamycin抗生素的LB固体培养基)上，37℃培养12h后从筛选培养板上挑取单克隆进行PCR检测及测序验证。确认gRNA表达盒成功连接至pYLCRISPR/Cas9‑DH表达载体上，得到如图1所示的重组载体。
[0077] 实施例2
[0078] 将实施例1所构建的重组载体转入农杆菌GV3101中，通过农杆菌介导法，将其转入银腺杨84K，具体步骤如下：
[0079] 菌体准备
[0080] 在含有重组载体的平板上挑取单克隆进行菌落PCR，通过电泳检查挑选阳性单菌落。接种至1mL的液体LB培养基(含50mg/LKanamycin抗生素的LB固体培养基)中，28℃恒温摇床，200rpm培养12～14h。取100μL培养好的菌液转移至50mL加有抗性的LB液体培养基中，28℃，200rpm继续培养13h，培养至OD600＝0.4～0.6，保证菌液有良好的活性。将菌液进行富集，3500rpm，离心15min，菌体用无菌的重悬液(100μmol/L乙酰丁香酮)重悬，重悬菌液OD600至0.4～0.6，用于遗传转化。
[0081] 愈伤组织准备
[0082] 以银腺杨84K作为实验材料，分别取生长状态良好的84K组培苗叶片，在超净工作台中，使用无菌消毒器具，沿垂直于叶脉的方向将叶片划伤，将叶背面平铺于愈伤组织诱导培养基(含有2mg/L2,4‑D(2,4‑Dichlorophenoxyacetic acid，2,4‑二氯苯氧乙酸)，0.1mg/L Kineti(KT，激动素)和0.2mg/L NAA(naphthaleneacetic acid，萘乙酸)的1/2MS培养基)中，25℃暗培养15～25天。
[0083] 侵染及鉴定
[0084] 在超净工作台中，用镊子将培养的愈伤组织分割成小块，转移到重悬后的菌液中侵染15min，置于无菌滤纸上吹干。转移至共培养基(含有100μMAS的1/2MS培养基)中，在25℃黑暗条件下共培养2d～3d。
[0085] 共培养结束后将其转移至分化诱导培养基(含有3mg/L潮霉素B(hygromy cin B)、200mg/L timentin(特美汀)、0.5mg/L 6‑BA(6‑benzyl aminopurine，6‑苄基氨基嘌呤)和
0.05mg/L NAA的1/2MS培养基)中，诱导、筛选抗性不定芽；待叶片分化出不定芽后且长度达
2cm左右时，将不定芽转移到生根培养基(含有3mg/L潮霉素B、200mg/L特美汀、0.05mg/L IBA(吲哚丁酸)和0.02mg/L NAA的1/2MS培养基)中进行生根培养；选取已生根的植株叶片提取DNA，进行PCR验证、基因测序；最终获得KO#63pagsupb突变体植株和KO#76pagsupb突变体植株，其PagSUPb基因靶位点编辑结果如图2所示。银腺杨84K是一种杂交杨，图2中的A和G分别用来表示它的两个亲本Populus alba和Populus glandulosa。在基因组上，PagSUPb在Populus alba(A)和Populus glandulosa(G)两个亲本的等位基因位点上是不同的序列。
[0086] 由图2可知，PagSUPb蛋白在未经转化的银腺杨84K亲本Populus alba植株中的氨基酸序列为：MVKKYPQGSSTVKDKWEKNNAIFKGEHSSVFSWPQR NYSCSFCKRQFISAQALGGHMNVHRRDRAKLRQLPSWFFKCPKYPTSNPNPDHLLSSSSKLLPYPDYHTHDHSPYLSSFSSPCCREKKSIVECHEVKDLTKKKSNAGAVFGVGELKKNFAQECDQLEVLRRSEIINLDMEMGCEDPKEVLDLELRLGL(SEQ ID No.10)；在亲本Populus glandulosa植株中的氨基酸序列为：MVKK YSSTVKDKWEKNNAIFKGEHSSVCSWPQRNYSCSFCKRQFISAQALGGHMNVHRRDRAKLRQLPSWFFKCPKYPTSNPNPDHLLSSSSKFLPYPDDHTHDHSPYLSSFSSPCCREKKSIVECQEGKDLTKKKSNAGAVFGVGELKKNFAQECDQLEVLRRSEIINLDMEMGCEDPKEVLDLELRLGL(SEQ ID No.1)；
[0087] PagSUPb蛋白在KO#63pagsupb突变体亲本Populus alba植株中的氨基酸序列为：MVKKYPQGSSTVKDKWEKNNAIFKGEHSSVFSWPQRNYSCSFCKR QFISAQALGGHMNVSQER(SEQ ID No.11)；在亲本Populus glandulosa植株中的氨基酸序列为：MVKKYSSTVKDKWEKNNAIFKGEHSSVCSWPQRNYSCS FCKRQFISAQER(SEQ ID No.12)；
[0088] PagSUPb蛋白在KO#76pagsupb突变体亲本Populus alba植株中的氨基酸序列为：MVKKYPQGSSTVKDKWEKNNAIFKGEHSSVFSWPQRNYSCSFCKR QFISAQALGGHMNVAQER(SEQ ID No.13)；在亲本Populus glandulosa植株中的氨基酸序列为：MVKKYSSTVKDKKWEKNNCKRQFISAQALGGHMNVTG IEKGEHSSVCSWPQRNYSCSFTGEIEPS(SEQ ID No.14)。
[0089] 实施例3
[0090] 将实施例2获得的KO#63pagsupb突变体植株(记为supb63)和KO#76pagsupb突变体植株(记为supb76)和未经转化的银腺杨84K植株(记为CK)在16h光照/8h黑暗光周期，温度为22～26℃，湿度为40～60％条件下培养两个月，观察并测量其性状，然后根据文献KNAT2/6b,a class I KNOX gene，impedes xylem differentiationbyregulatingNAC domaintranscription factors inpoplar(Zhao Y，Xueqin S，Zhou H，et al.New Phytologist，2019，225(4).DOI:10.1111/nph.16036.)中所记载的方式检测其木质素含量。
[0091] 结果如图3～图5所示，其中图5是未转基因杨树CK与本发明转基因杨树KO#63、KO#76土培苗生长2个月的植株第20节间的间苯三酚染色比较图；A中比例尺为600μm，B是木质素的测量分析结果，t检验P值用星号表示：t检验P值用星号表示：，“**”表示P＜0.01，pf表示韧皮纤维，Xy表示木质部，Pi表示髓心。
[0092] 由图3～图5可知，和对照植株相比，pagsupb突变体杨树的两个株系(KO#63和KO#76)明显变高。突变体植株地径比对照大，节间数也显著增多(图3)。pagsupb突变体杨树茎与对照相比变长变粗(图4)。木质素含量显著高于对照(图5)。
[0093] 由上述实施例可知，本发明沉默PagSUPb基因的表达，相比于未转基因杨树(CK)植株明显变高变粗，且木质素含量显著增多，说明PagSUPb基因可调控杨树木材发育，改变杨树木质素含量，对培育适合不同工业用材需要的树木品系具有应用意义。
[0094] 尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
