[0001] 本发明属于植物基因工程领域，涉及一种用MYB75基因改善杨树性状的方法。

[0002] 随着环境状况恶化、林地面积减少、木材质量下降，我国木材资源已不能满足日益增长的产业需求，同时大量木材进口增加我国企业成本。为了提高木材质量、弥补原料不足、降低生产成本，培育优质高产胶合板材新品种是我国人造板产业高质量发展的重要目标。

[0003] 杨树(拉丁语学名：Populus L.)干形通直、出材率高、生长迅速、轮伐期短、分布范围广，是我国重要的胶合板材树种。由于杨树人工林普遍单产水平低，突破性良种创制不足，缺乏优质高产胶合板材专用杨树新品种，难以满足木材多元化市场需求，制约我国杨树产业发展。针对胶合板材质量不高、品种不足等问题，创制生物量高、纤维长等综合性状优异的杨树新材料是培育速生优质高产胶合板材新品种的关键科学问题。

[0004] 转录因子是植物生长发育的重要调控因子。其中MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，参与植物非生物胁迫、生物胁迫、生长发育、次生代谢物积累等多种生物过程。并且，越来越多的研究表明多个MYB转录因子成员参与细胞壁合成的层级调控过程，在植物生长发育，特别是林木木材发育过程中扮演重要角色。因此，MYB转录因子是林木新品种创制的重要基因资源。

[0070] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

[0071] 本发明没有说明的材料与仪器为本领域常规材料与仪器，本发明没有说明的操作细节为本领域常规操作。除特别说明外，本发明所示核酸序列均是按照5’到3’的方向从左到右书写。

[0072] 实施例1:84K杨MYB75基因敲除植株制备

[0073] 1.植物种属

[0074] 本发明所用杨树为银腺杨84K(Populus alba×P.glandulosa‘84K’，简称“84K杨”)。

[0075] 2.基因信息

[0076] 根据基因同源性命名规则，克隆得到84K杨MYB75基因(称作PagMYB75基因)。

[0077] 第一亲本(银白杨Populus alba，简称A亲本)来源的84K杨PagMYB75等位基因编码序列如下(SEQ ID NO.1)：

[0078] ATGGGTAGACAACCTTGTTGCGACAAACTTGGTGTGAAGAAGGGGCCTTGGACAGCTGAGGAAGACAAGAAGTTGGTCAGTTTTATTCTCTCACACGGCCAATGTTGTTGGCGTGCTGTACCAAAGCTCGCCGGACTCCGCCGATGTGGCAAGAGCTGCCGTCTTCGCTGGACTAATTACCTCCGGCCAGACTTGAAGAGAGGCCTTCTTAACGAGGATGAGGAAAAACTTGTCATTGATCTCCATGCCCGCCTTGGCAATAGGTGGTCCAAAATCGCTGCAAGATTGCCGGGAAGAACAGATAATGAGATCAAGAATCATTGGAATACTCACATTAAGAAAAAGCTTATTAAGATGGGCATCGATCCTGTTACACATGGGTCTCTCAGTAGACAAGTGAGCCCACAAGAAAGCACAGTATCTTCTCACACTAATTATGATCAACCCATTATTAATGCTGATAATCAGCAGATTCTTCCCAAAATTTGCGCCCACGCCTCCTCTCGTACTGATAATTCAAGCACTACGACTACACCGACAGAAAATTCCTCAGTGGATGAATGCGTAGGGTCGTCAGAACCTAATAATGACAATGATCCATCAATGAGTTTCATATGGTCAGATGCATTTCTTGATGACTCATCTTGGGACTTCCAAGCCACGAGAGAAGATTACAGTGAATTTGGGGTATCTAATTCTTCGTCAGAGGATAGTAACTCTACATGGTTTTTAGACTGTAAGGATCTTGGAGATGAATTCTTTGGGCTTAGTTGCTTCAGTGACGTGGACTTGAGCATTCTAGACATGGTTGGCAAGCATTAA

[0079] 第一亲本(A亲本)来源的84K杨PagMYB75等位基因编码的蛋白氨基酸序列如下(SEQ ID NO.2)：

[0080] MGRQPCCDKLGVKKGPWTAEEDKKLVSFILSHGQCCWRAVPKLAGLRRCGKSCRLRWTNYLRPDLKRGLLNEDEEKLVIDLHARLGNRWSKIAARLPGRTDNEIKNHWNTHIKKKLIKMGIDPVTHGSLSRQVSPQESTVSSHTNYDQPIINADNQQILPKICAHASSRTDNSSTTTTPTENSSVDECVGSSEPNNDNDPSMSFIWSDAFLDDSSWDFQATREDYSEFGVSNSSSEDSNSTWFLDCKDLGDEFFGLSCFSDVDLSILDMVGKH

[0081] 第二亲本(腺毛杨Populus glandulosa，简称G亲本)来源的84K杨PagMYB75等位基因编码序列如下(SEQ ID NO.3)：

[0082] ATGGGTAGACAACCTTGTTGCGACAAACTTGGTGTGAAGAAGGGGCCCTGGACAGCTGAGGAAGACAAGAAGTTGGTCAGTTTTATTCTCTCACACGGCCAATGTTGTTGGCGTGCTGTACCAAAGCTCGCCGGACTCCGCCGATGTGGCAAGAGCTGCCGTCTTCGCTGGACTAATTACCTCCGGCCTGACTTAAAGAGAGGCCTTCTTAATGAGGAGGAGGAAAAACTTGTCATTGATCTCCATGCCCGCCTTGGCAATAGGTGGTCCAAAATCGCTGCAAGATTGCCGGGAAGAACAGATAATGAGATCAAGAATCATTGGAATACTCACATTAAGAAAAAGCTTATTAAGATGGGCATCGATCCTGTTACACATGGTTCTCTCAGTAGACAAGTGAGCCCACAAGAAAGCACAGTATCTTGTCACACTAATTATGATCAACCCATTATTAATGCTGATAATCAGCAGGTTCTTCCCAAAATTTGCGCCCACGCCTCCTCTCGTACTGATAATTCAAGCACTACGACTACACCGACAGAAAATTCCTCAGTGGATGAATGCGTAGGGTCGTCAGAACCTAATAATGACAATGATCCATCAATGAGTTTCATATGGTCAGAGGCATTTCTTGATGACTCGTCTTGGAACTTCCAAGCCACGAGAGAAGATTATAGTGAATTTGGGGTATCTAATTCTTCGTCAGAGGATAGTAACTCTACATGGTTTTTAGACTGTAAGGATCTTGGAGATGAATTCTTTGGGCTTAGTTGCTTCAGTGACGTGGACTTGAGTATCCTAGACATGGTTGGCAAGCATTAA

[0083] 第二亲本(G亲本)来源的84K杨PagMYB75等位基因编码的蛋白氨基酸序列如下(SEQ ID NO.4)：

[0084] MGRQPCCDKLGVKKGPWTAEEDKKLVSFILSHGQCCWRAVPKLAGLRRCGKSCRLRWTNYLRPDLKRGLLNEEEEKLVIDLHARLGNRWSKIAARLPGRTDNEIKNHWNTHIKKKLIKMGIDPVTHGSLSRQVSPQESTVSCHTNYDQPIINADNQQVLPKICAHASSRTDNSSTTTTPTENSSVDECVGSSEPNNDNDPSMSFIWSEAFLDDSSWNFQATREDYSEFGVSNSSSEDSNSTWFLDCKDLGDEFFGLSCFSDVDLSILDMVGKH

[0085] 3.基因靶点选择

[0086] 为了保证两个PagMYB75等位基因能同时被编辑，提高双等位基因敲除效率，根据两个PagMYB75等位基因第1外显子中一致的序列(设计思路参见图1上半部分)，设计如下靶序列：

[0087] T1(SEQ ID NO:5)：TTCGCTGGACTAATTACCTC

[0088] 针对靶序列合成寡核苷酸gRNA1_MYB75_F和gRNA1_MYB75_R，将二者退火形成双链CT。

[0089] gRNA1_MYB75_F(SEQ ID NO:6)：attgTTCGCTGGACTAATTACCTCgRNA1_MYB75_R(SEQ ID NO:7)：aaacGAGGTAATTAGTCCAGCGA A

[0090] 4.基因编辑载体的制备

[0091] 本发明使用的CRISPR/Cas9系统(版本的使用方法参见文献Yi An,Yangyan Zhou,Xiao  Han,Chao  Shen,Shu  Wang,Chao  Liu,Weilun Yin,Xinli  Xia.The GATAtranscription factor GNC plays an important role in photosynthesis and growth in poplar.J Exp Bot.2020Mar 25；71(6):1969‑1984.)为Andrew Groover实验室赠与，其入门载体为pEn‑Chimera，含有靶序列插入位点以及引导RNA(guide RNA，gRNA)表达元件；终载体(也称目的载体)为pDe‑Cas9，具有Cas9蛋白编码序列与表达元件；通过Gateway反应将入门载体中的靶序列表达元件插入终载体后，通过农杆菌转化目标受体。

[0092] 在限制性内切酶BbsI的作用下，将pEn‑Chimera载体酶切线性化，将线性化的载体进行电泳验证并纯化回收。将回收产物与双链CT在T4 DNA连接酶的作用下连接。将重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用含50mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基筛选培养。挑取单克隆菌落用gRNA1_MYB75_F和M13_R作为引物进行单克隆检测PCR，经电泳确定重组阳性克隆成功后，用SS42引物进行Sanger法测序验证重组序列的正确性，得到重组入门载体EVCT。

[0093] M13_R(SEQ ID NO:8)：CACAGGAAACAGCTATGAC

[0094] SS42(SEQ ID NO:9)：TCCCAGGATTAGAATGATTAGG

[0095] 将重组入门载体EVCT与终载体质粒混合，利用LR clonase II enzyme mix试剂盒，通过Gateway反应，形成重组产物。将重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用含50mg/L壮观霉素的LB固体培养基筛选培养。挑取单克隆菌落用Crispr_F和gRNA1_MYB75_R作为引物进行单克隆检测PCR，经电泳确定重组阳性克隆成功后，用Crispr_F引物进行Sanger法测序验证重组序列的正确性。选择阳性重组质粒转化农杆菌GV3101感受态细胞，使用含壮观霉素和利福霉素的YEP固体培养基筛选培养，用Crispr_F和gRNA1_MYB75_R作为引物进行单克隆检测PCR，经电泳确定转化成功的单克隆。对阳性单克隆扩大培养获得重组农杆菌菌液1。

[0096] Crispr_F(SEQ ID NO:10)：CTCCCTAGGCCTGTTATCCCT

[0097] 5.杨树叶盘浸染转化

[0098] (1)外植体处理：取生长4‑6周的84K杨树组织培养苗的嫩叶叶片作为外植体转化材料。取材后先用清水对叶片进行清洗，然后在超净台中用20％(w/v)的次氯酸钠水溶液消毒20min，用无菌蒸馏水清洗至少5遍，确保材料表面没有次氯酸钠残留，用无菌滤纸吸取多余蒸馏水。

[0099] (2)农杆菌培养：在含有100mg/L卡那霉素和50mg/L利福霉素的YEP液体培养基(200mL)中28℃、180rpm摇床过夜摇菌培养重组农杆菌菌液1，在对数期扩增后在3600rmp，4度离心10‑15min，菌体用无菌的1/2MS(含30g/L蔗糖)溶液重悬到OD600约为0.4，得到侵染菌液1待用。

[0100] (3)受体侵染：将前述消毒的外植体叶用刀尖将主叶脉划出伤口、切除叶缘、切成约0.5×2.0cm大小方块，然后在侵染菌液1中侵染10‑20min，其间轻轻旋转振荡，使每一叶片均能与农杆菌密切接触。

[0101] (4)共培养：将侵染后的叶片用滤纸吸干菌液平铺在共培养基上，避光放置2天。共培养基以WPM为基础培养基，还含有20g/L蔗糖、7.8g/L琼脂、0.5g/L MES(2‑吗啉乙磺酸)、100μM乙酰丁香酮，pH 5.9。

[0102] (5)愈伤诱导培养：将叶片转移到愈伤诱导培养基上继续暗培养约两周，待愈伤长出后，转移到新的愈伤诱导培养基。两周更换一次培养基，大约2‑4周长出愈伤。筛选培养基以WPM为基础培养基，还含有20g/L蔗糖、7.8g/L琼脂、0.5g/LMES、1.0mg/L2,4‑D、0.1mg/LKT(激动素)、200mg/L头孢霉素、200mg/L特美汀、50mg/L卡那霉素，pH 5.9。

[0103] (6)分化培养：愈伤长至米粒大小时，转移至分化培养基上，三周更换一次培养基，‑2 ‑1培养温度为25℃，光照强度为50μmol·m ·s ，光周期为16h光照/8h黑暗。期间愈伤会变绿，变硬，生芽。本阶段大约两个月左右。分化培养基以WPM为基础培养基，还含有20g/L蔗糖、7.8g/L琼脂、0.5g/LMES、0.05mg/LNAA、0.5mg/L6‑BA、200mg/L头孢霉素、200mg/L特美汀、50mg/L卡那霉素，pH 5.9。

[0104] (7)生根培养：待小苗生长约2cm后，切下，放入生根培养基约一周生根，培养温度‑2 ‑1为25℃，光照强度为50μmol·m ·s ，光周期为16h光照/8h黑暗。生根培养基以WPM为基础培养基，还含有10g/L蔗糖、7.8g/L琼脂、0.5g/L MES、200mg/L头孢霉素、200mg/L特美汀、
50mg/L卡那霉素，pH5.9。

[0105] (8)阳性检测：生根2周后，提取植株DNA，利用特异性引物进行PCR检测，获得阳性转基因植株，用于后续分析。

[0106] 6.转基因植株突变鉴定

[0107] 提取阳性转基因杨树基因组DNA，利用靶位点检测特异性引物MYB75_F1和MYB75_R1进行PCR扩增，将扩增产物连接到克隆载体上。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得单菌落，用于靶位点扩增子Sanger测序，分析突变事件情况。其中，#7和#8号植株与野生对照植株(CK)的对应靶序列比较参见图1下半部分。每个植株的两个序列代表两个等位基因。由此可见，该植株的两个PagMYB75等位基因均发生移码突变，成功敲除目的基因。两个敲除株系分别命名为crispr‑PagMYB75#7和crispr‑PagMYB75#8。

[0108] MYB75_F1(SEQ ID NO:11)：GGTAGACAACCTTGTTGCGAC

[0109] MYB75_R1(SEQ ID NO:12)：CTGTCGGTGTAGTCGTAGTGC

[0110] 实施例2：84K杨MYB75基因高表达植株制备

[0111] 1.植物种属

[0112] 与实施例1相同。

[0113] 2.基因信息

[0114] 与实施例1相同。

[0115] 3.PagMYB75基因的克隆

[0116] 根据84K杨PagMYB75基因序列，设计克隆引物PagMYB75_F和PagMYB75_R。

[0117] PagMYB75_F(SEQ ID NO:13)：ATGGGTAGACAACCTTGTTGCG

[0118] PagMYB75_R(SEQ ID NO:14)：ATGCTTGCCAACCATGTCTAG

[0119] 使用TRIZOL法提取84K杨茎中RNA，然后反转录为cDNA，用于基因克隆模板，使用引物PagMYB75_F和PagMYB75_R，利用高保真酶Phanta Max Master Mix进行PCR产物扩增。在PCR热循环仪中设置扩增反应程序为95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸2min，其中变性‑退火‑延伸循环29次，最后72℃完全延伸10min。将PCR产物纯化回收连接克隆载体并测序，获得两个PagMYB75等位基因序列，选择G亲本等位基因PagMYB75g用于后续基因表达载体构建。

[0120] 4.PagMYB75基因表达载体构建

[0121] 使用SpeI和PmeI限制性内切酶(购自NEB)对pK2GW7载体(https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1360138502022513)双酶切，选用琼脂糖凝胶电泳检测目标条带，胶回收获得线性化载体片段。设计目标基因重组引物PagMYB75‑pK‑F和PagMYB75‑pK‑R，以步骤3所得含有目的基因(G亲本等位基因PagMYB75基因)的重组克隆载体为模版，PCR扩增产物。利用同源重组酶Exnase II(购买自南京Vazyme)连接前述PCR扩增产物与线性化载体片段，37℃培养30min，置于冰上5min。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用含50mg/L壮观霉素的LB固体培养基筛选培养。使用PK‑F和PagMYB75‑pK‑R作为引物菌检，目标条带820bp，用引物PK‑F和PK‑R扩增后对扩增产物测序验证。用测序验证转入了PagMYB75基因序列的重组pK2GW7载体转化到农杆菌GV3101感受态细胞中。利用PK‑F和PagMYB75‑pK‑R作为引物进行单克隆检测PCR，经电泳确定转化成功的单克隆。对阳性单克隆扩大培养获得含有PagMYB75基因的重组农杆菌菌液(菌液2)，保存于‑80℃备用。

[0122] PagMYB75‑pK‑F(SEQ ID NO:15):TCGACCTGCAGGCGGCCGCAATGGGTAGACAACCTTGTTG[0123] PagMYB75‑pK‑R(SEQ ID NO:16):TCCTTGTAATCGTTTGTTTGATGCTTGCCAACCATGTCTA[0124] PK‑F(SEQ ID NO:17):GGACTCCGGTATTTTTACAACAA

[0125] PK‑R(SEQ ID NO:18):GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCA

[0126] 5.PagMYB75基因高表达杨树制备

[0127] (1)外植体处理：取生长4‑6周的84K杨树组织培养苗的嫩叶叶片作为外植体转化材料。取材后先用清水对叶片进行清洗，然后在超净台中用20％(w/v)的次氯酸钠水溶液消毒20min，用无菌蒸馏水清洗至少5遍，确保材料表面没有次氯酸钠残留，用无菌滤纸吸取多余蒸馏水。

[0128] (2)农杆菌培养：在含有100mg/L卡那霉素和50mg/L利福霉素的YEP液体培养基(200mL)中28℃、180rpm摇床过夜摇菌培养重组农杆菌菌液2，在对数期扩增后在3600rmp，4度离心10‑15min，菌体用无菌的1/2MS(含30g/L蔗糖)溶液重悬到OD600约为0.4，得到侵染菌液2待用。

[0129] (3)受体侵染：将前述消毒的外植体叶用刀尖将主叶脉划出切口、切除叶缘、切成约0.5×2.0cm大小方块，然后在侵染菌液2中侵染10‑20min，其间轻轻旋转振荡，使每一叶片均能与农杆菌密切接触。

[0130] (4)共培养：将侵染后的叶片用滤纸吸干菌液平铺在共培养基上，避光放置2天。共培养基以WPM为基础培养基，还含有20g/L蔗糖、7.8g/L琼脂、0.5g/L MES(2‑吗啉乙磺酸)、100μM乙酰丁香酮，pH 5.9。

[0131] (5)愈伤诱导培养：将叶片转移到愈伤诱导培养基上继续暗培养约两周，待愈伤长出后，转移到新的愈伤诱导培养基。两周更换一次培养基，大约2‑4周长出愈伤。筛选培养基以WPM为基础培养基，还含有20g/L蔗糖、7.8g/L琼脂、0.5g/L MES、1.0mg/L 2,4‑D、0.1mg/LKT(激动素)、200mg/L头孢霉素、200mg/L特美汀、50mg/L卡那霉素，pH 5.9。

[0132] (6)分化培养：愈伤长至米粒大小时，转移至分化培养基上，三周更换一次培养基，‑2 ‑1培养温度为25℃，光照强度为50μmol·m ·s ，光周期为16h光照/8h黑暗。期间愈伤会变绿，变硬，生芽。本阶段大约两个月左右。分化培养基以WPM为基础培养基，还含有20g/L蔗糖、7.8g/L琼脂、0.5g/LMES、0.05mg/LNAA、0.5mg/L6‑BA、200mg/L头孢霉素、200mg/L特美汀、50mg/L卡那霉素，pH 5.9。

[0133] (7)生根培养：待小苗生长约2cm后，切下，放入生根培养基约一周生根，培养温度‑2 ‑1为25℃，光照强度为50μmol·m ·s ，光周期为16h光照/8h黑暗。生根培养基以WPM为基础培养基，还含有10g/L蔗糖、7.8g/L琼脂、0.5g/L MES、200mg/L头孢霉素、200mg/L特美汀、
50mg/L卡那霉素，pH5.9。

[0134] 6.转基因杨树鉴定

[0135] 提取待检测植株DNA，利用特异性引物PK‑F和PagMYB75‑pK‑R进行PCR检测，其中#3，#9，#12，#16，#26和#30这6个转基因植株(oxPagMYB75#3，#9，#12，#16，#26，#30)呈现阳性扩增结果，推测PagMYB75基因已经转入受体基因组，获得阳性转基因植株(oxPagMYB75)。

[0136] 实施例3.基因工程杨树植株性状表征

[0137] 针对亲本84K杨(简称CK)、oxPagMYB75#9、oxPagMYB75#26、oxPagMYB75#30、crispr‑PagMYB75#7，crispr‑PagMYB75#8这6种杨树植株(简称6种杨树种质)的二月龄苗(常规组织培养移栽后两个月)，分别进行以下平行测试实验。

[0138] (1)PagMYB75基因对杨树茎和根形态的影响

[0139] 针对前述6种杨树种质，分别平行制备常规组织培养苗，移栽两个月后观察株高与植株形态，结果参见图2A；观察根部形态，结果参见图2A；观察第7节间叶形态，结果参见图2B；观察从顶端到同一高度茎基部排列的所有节间茎形态(结果参见图2C)并测定第7节间茎直径(每个种质采用≥6株进行统计，结果参见图3B)。

[0140] 由此可见，表型分析发现PagMYB75高表达、基因敲除和对照植株高度差别不明显；高表达植株的茎有明显增粗，而基因敲除植株与对照相似；根系比较发现PagMYB75高表达植株的根比对照明显更茂密，细根更多，而基因敲除植株相对要少；PagMYB75高表达与对照相比叶片面积更大。

[0141] 由此可见，PagMYB75高表达能够使杨树更粗壮。

[0142] (2)PagMYB75基因对杨树木质部的影响

[0143] 采用振动切片机(VT1200S，徕卡)分别针对前述6种杨树种质二月龄苗的第7节间茎进行切片，切片厚度为50μm，将新鲜切片进行0.01％甲苯胺蓝O(toluidine blue O，简称TBO)常规染色1min后，用水清洗三次，清除表面多余染色液，盖上盖玻片，采用光学显微镜(徕卡DM6B)，对经TBO染色的切片进行观察，拍照，以分析茎横截面的形态差异。

[0144] 采用钙荧光白(CFW)染色法分别针对前述6种杨树种质的第7节间茎切片进行染色，以便显示纤维素。

[0145] 采用间苯三酚染色法分别针对前述6种杨树种质的第7节间茎切片进行染色，以便显示纤维素和木质素分布。

[0146] 结果参见图3，其中A示出了茎横截面的形态(上部)和木质部(下部)的形态；B示出了茎直径的统计数据；C示出了形成层宽度的统计数据；D示出了导管宽度的统计数据；E示出了木质部宽度的统计数据；F示出了茎纤维素(上部)和木质素(下部)含量分布。

[0147] 结果显示，PagMYB75高表达株系的直径和木质部宽度都显著增加，而敲除植株的木质部宽度与对照相比则会减少。高表达植株与对照的形成层宽度无明显差异，但敲除植株的形成层显著减少。相比于对照，高表达植株形成层层数更少，但形成层细胞更大。转基因植株和对照之间的纤维素含量无明显差异。高表达植株的木质素分布范围较大，基因敲除植株的木质素分布范围较小，表明基因敲除植株中的木质素含量显著下降。

[0148] 由此可见，PagMYB75高表达促进了植株整体细胞发育伸长，进而促进木质部加宽。

[0149] (3)PagMYB75基因对杨树纤维细胞和导管尺寸的影响

[0150] 采用振动切片机(VT1200S，徕卡)分别针对前述6种杨树种质二月龄苗的第7节间茎进行切片，切片厚度为50μm。先将双面碳导电胶带(日新NEM)粘在扫描电镜载物台的观察区，再将切片吸干多余水分粘在观察区胶带上。将载物台放入扫描电镜观察，并保存所观察到的图片。

[0151] 结果如图3所示，G示出了纤维细胞孔径和细胞壁厚度。扫描电镜结果发现PagMYB75高表达植株的纤维细胞孔径显著增大，且高表达转基因植株的纤维细胞角隅(CC)明显减少；而对比对照，基因敲除植株的CC增加，故整体纤维细胞轮廓会更趋于圆形(图3G)。导管孔径比较结果显示PagMYB75高表达植株的导管孔径显著增大(图3G)。

[0152] 由此可见，PagMYB75高表达抑制木质素在细胞角隅的积累，使纤维细胞腔更大。

[0153] (4)PagMYB75基因对杨树木质部纤维形态的影响

[0154] 分别取前述6种杨树种质二月龄苗的第8‑10节间茎，将树皮剥下，用小刀将分离出的韧皮部与木质部纵切成若干小块分别放入离心管中。将离析液(冰醋酸AR分析纯：30％过氧化氢＝1：1)放入离心管，放入65℃恒温水浴锅中，离析期间需多次剧烈摇晃。离析完全后将带有纤维的离析液倒入离心管中，将离心管放入离心机离心，弃上清液。加入RO水离心洗涤，重复步骤至冰醋酸气味散尽。用滴管吸取离心管中已洗净的纤维，用光学显微镜(徕卡DM6B)进行观察并拍摄纤维照片，用Image J软件测量纤维长度。

[0155] 图4A示出了6种杨树种质木质部纤维与韧皮部纤维的形态。

[0156] 图4B示出了6种杨树种质木质部纤维长度的统计图。

[0157] 图4C示出了6种杨树种质韧皮部纤维长度的统计图。

[0158] 木质部纤维尺寸比较发现PagMYB75高表达杨树的木质部纤维会更长且更宽，而基因敲除植株则更短。韧皮部纤维比较发现PagMYB75高表达杨树有更多长纤维(>1.6mm)，但同时又有更多较短纤维，纤维长度差异大，而敲除植株的韧皮纤维长度较平均，且小于对照。结果表明PagMYB75高表达杨树的纤维增长且增宽，有利于胶合板生产等应用。

[0159] 由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。