[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及Pak3抑制剂在治疗瑞芬太尼诱发的切口痛觉过敏中的应用。

[0002] 阿片类药物是临床治疗急、慢性疼痛及癌痛的最重要的镇痛药物，临床用药量极大，但它们在镇痛的同时还能够激活体内的促伤害感受机制，表现为机体对伤害性刺激的反应性增强，镇痛药物需求量增加，即阿片类药物诱发的痛觉过敏(opioid‑induced hyperalgesia,OIH)。瑞芬太尼是一种超短效的μ‑阿片受体激动剂，由于它具有起效快、清除快、无蓄积、代谢不依赖于肝肾功能等优点广泛应用于临床术中镇痛。但是，瑞芬太尼诱发术后痛觉过敏(remifentanil‑induced postoperative hyperalgesia，RIH)的发生率远高于其他阿片类镇痛药物，高达85％。另有一项研究发现，手术时间超过2小时的患者，RIH的发生率为32.7％，累计输注量超过30μg/kg时，RIH的发生率甚至高达41.8％。RIH的主要特征为瑞芬太尼以0.05～0.3μg/kg/min的速度输注60～90min后出现术后切口疼痛的程度和范围增加，以及阿片类镇痛药需求增加。RIH不仅降低了药物的镇痛效果，还促进了痛觉感知，产生异常疼痛，甚至引发术后慢性疼痛的发生，患者对阿片类药物剂量需求越来越大，不仅增加住院时间、医疗费用、占用医疗资源，最关键的是增加了患者的身心创伤，加重了患者的痛苦，严重影响了患者的生活质量。目前，临床无有效的治疗措施，主要是因为其发生机制目前尚不清楚，因此，深入阐明瑞芬太尼诱发痛觉过敏的发病机制和寻找有效治疗策略是当务之急。

[0032] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0033] 实施例Pak3与瑞芬太尼诱发的切口痛相关性研究

[0034] 一、实验步骤

[0035] (1)实验分组：雄性C57BL6小鼠40只，1月龄，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。采用随机数字表法分为3组(n＝10)：

[0036] DMSO+生理盐水组(NS组)，经腹腔持续输注与瑞芬太尼等容量的生理盐水60min；

[0037] DMSO+瑞芬太尼+切口痛组(RI组)：在注射瑞芬太尼之前10min腹腔注射0.1％‑1 ‑1DMSO，经腹腔持续输注瑞芬太尼1μg·kg ·min 共60min，同时建立切口痛模型；

[0038] FRAX597+瑞芬太尼+切口痛组(F+RI组)：在注射瑞芬太尼之前10min腹腔注射FRAX597100mg/kg(MedChemExpress，HY‑15542A，美国)，经腹腔持续输注瑞芬太尼1μg·kg‑1 ‑1·min 共60min，同时建立切口痛模型。

[0039] (2)切口痛模型制作：小鼠吸入2％七氟醚麻醉，消毒左后足，从足底近端0.2cm处向趾部做长约0.5cm的纵行切口，切开皮肤后，用眼科镊挑起足底肌肉并纵行分离至骨膜，保持肌肉起止和附着完整。按压止血后，以4‑0丝线缝合皮肤。切口皮肤不能重叠、内翻、裂开。术后伤口用碘伏消毒，并涂抹少量红霉素软膏预防感染。

[0040] (3)行为学实验：于输注瑞芬太尼前24h(T0)、输注停止后2、6、24和48h(T1‑4)时测定热刺激缩足潜伏期(PWL)和机械刺激缩足频率(PWF)，实验室温度18～22℃，安静。采用红外足底测痛仪(IICT Life Science 390)测定PWL，记录从左后足接触热板至出现回缩、踮脚、挣扎、嘶叫、舐足任一反应的时间为PWL，连续测定3次，间隔5min，取平均值作为PWL(sec)。为防止烫伤鼠爪，PWL上限定设置为20s。将大鼠置于20cm×20cm×20cm的金属笼内，30min后，以BSEVF3 von Frey纤维丝0.4g(HarvardApparatus公司，美国)刺激右后足2、3趾骨间，垂直施加压力，记录出现快速缩足反应、舔舐右足或嘶叫时压力，连续测定10次，间隔
1min，取缩足频率为PWF(％)。

[0041] (4)Western Blot：于最后1次行为学测定结束后，处死小鼠，取L3‑5背根神经节，采用Western Blot法测定蛋白的表达。L3‑5背根神经节组织加入预冷的组织蛋白裂解液，研磨成组织匀浆。将匀浆液4℃离心5min，12000rpm，离心半径10cm，上清液即为脊髓组织总蛋白。用膜蛋白提取试剂盒(Thermo公司，美国)，按照说明书进行具体操作提取膜蛋白。使用PAK3 Polyclonal Antibody(ThermoFisher，PA5‑112638，美国)，按照说明书的指南进行实验测定Pak3表达。

[0042] (5)统计学分析：采用SPSS 18.0统计学软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示，随机区组设计的计量资料比较采用单因素方差分析，重复测量设计的计量资料比较采用重复测量设计的方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

[0043] 二、实验结果

[0044] 1)瑞芬太尼输注加剧了术后机械和热痛觉过敏

[0045] 与DMSO+生理盐水(NS)组输注相比，DMSO+瑞芬太尼+切口痛(RI)组以1μg·kg‑1·‑1min 的速度输注60分钟，从2h到48h，导致缩足频率(PWF)显著升高和缩足潜伏期(PWL)显著‑1 ‑1
降低(所有P<0.001，图1)。这些结果表明，以1μg·kg ·min 的速度输注瑞芬太尼可增加阿片类药物引起的切口痛热和机械性痛觉过敏。瑞芬太尼输注和切口疼痛模型引起的切口引起的热痛和机械痛的超敏反应可从2小时持续到48小时。

[0046] (2)瑞芬太尼输注和切口增加了背根神经节Pak3的表达

[0047] 在瑞芬太尼和切口疼痛模型后48h，处死小鼠去背根神经节，在Western Blot结果发现Pak3蛋白表达明显增加(P<0.001，图2)。以上结果表明，瑞芬太尼输注后的痛觉过敏与背根神经节中Pak3表达增加有关。

[0048] (3)用FRAX597抑制Pak3活性可以减低Pak3的蛋白表达水平(P<0.001，图2)。提示Pak3可以调控AMPAR参与的神经兴奋性突触的突触可塑性调控，而这是瑞芬太尼痛觉过敏的神经病理生理基础。另外FRAX597可以明显的降低瑞芬太尼切口痛诱发的机械痛觉过敏和热痛觉过敏，提示FRAX597的潜在镇痛特性。

[0049] (4)FRAX597可抑制术后机械和热痛觉过敏

[0050] 结果如图1所示，FRAX597加入可导致缩足频率(PWF)显著降低和缩足潜伏期(PWL)显著升高(所有P<0.001)。

[0051] 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。