技术领域
[0001] 一种阿莫西林人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
相关背景技术
[0002] 阿莫西林（AMX），又名安莫西林或安默西林，是一种最常用的半合成青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素，是目前应用较为广泛的口服半合成青霉素之一，抗菌谱及抗菌活性与氨苄西林基本相同，但其耐酸性较氨苄西林强，其杀菌作用较后者强而迅速，半衰期约为61.3分钟，在酸性条件下更为稳定。阿莫西林杀菌作用强，穿透细胞壁的能力也强，口服后药物分子中的内酰胺基立即水解生成肽键，迅速和菌体内的转肽酶结合使之失活。可广泛用于治疗人类与动物的尿道、呼吸道等的敏感菌感染，然而随着阿莫西林的广泛应用，其在动物原性食品中的残留问题引起人们的广泛关注，对阿莫西林残留物的检测成为关键。
[0003] 目前检测阿莫西林的方法主要有分光光度法，如：紫外分光光度法、比色法、红外分光光度法、原子吸收分光光度法、荧光分光光度法等；还包括高效液相色谱法（HPLC），虽然这些方法能够实现阿莫西林的检测，然而分光光度法检测灵敏度低，不能达到低残留样品的检测需求，而HPLC法需要昂贵的仪器和复杂的样品前处理流程，不能实现快速、普遍通用的检测效果。因此目前开发了基于抗原抗体反应的酶联免疫方法（ELISA），这种方法操作简单方便，不需要专业的操作人员，要想获得较好的检测效果，制备高灵敏高选择性的抗体是此类方法的必要因素，而高质量抗体的获得首先需要高免疫原性的抗原，因此抗原的制备是此类方法成功的关键。
[0004] 目前阿莫西林抗原的合成方法用的最多的是碳二亚胺法，然而阿莫西林分子结构同时含有氨基和羧基，碳二亚胺法会使得阿莫西林自身氨基羧基发生偶联，使得合成产率较低，同时此方法本身合成副产物较多，较低合成后的抗原纯度。因此，急需开发一种高产率高纯度的阿莫西林抗原合成方法。
具体实施方式
[0019] 实施例1一种阿莫西林人工抗原的合成方法，包括如下步骤：
（1）半抗原的合成
将阿莫西林与舒巴坦以1:1.5的摩尔比通过碳二亚胺法进行偶联，首先将舒巴坦用2-吗啉乙磺酸缓冲液进行溶解，然后舒巴坦与碳二亚胺以1:4的摩尔比加入碳二亚胺溶液，在磁力搅拌的状态下反应2h后，将反应液冷冻干燥，从而得到偶联舒巴坦的阿莫西林半抗原固体。
[0020] （2）完全抗原的合成将步骤（1）得到的半抗原2mg用1mL N-N二甲基甲酰胺进行溶解，加入20μL三正丁胺，在
4℃条件下反应20min后再加入35μL氯甲酸异丁酯继续反应2h，将其以50:1的摩尔比在搅拌状态下逐滴加入到0.01M pH7.2的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液溶解的牛血清白蛋白BSA中反应5h；将偶联产物在4℃条件下用生理盐水进行透析，每隔3h换一次透析液，一共透析四次，得到阿莫西林完全人工抗原。
[0021] （3）人工抗原的鉴定凝胶电泳鉴定：将步骤（2）得到的人工抗原通过10%SDS-PAGE进行分析，BSA和人工抗原的上样量均为3μg，分析人工抗原和BSA的蛋白条带得出，人工抗原的条带位置在BSA的上边，也就是说人工抗原的电泳速度比BSA慢，分子量比BSA大，从而说明阿莫西林成功偶联到了BSA上；
蛋白质浓度测定：将BSA用超纯水配置成1mg/mL的浓度，然后将其稀释成0.01mg/mL、
0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL的浓度，每种浓度取100μL加入
1.5mL离心管中，同时另取100μL水作为空白孔加入离心管中，取预先配置好的考马斯亮蓝试剂加入离心管中，每管400μL，室温下避光反应5min后，测定595nm的吸光值，从而得到BSA浓度和595nm吸光值关系的标准曲线。将人工抗原稀释到0.01-0.1mg/mL的浓度范围，用此方法测定人工抗原的蛋白浓度为5mg/mL。
[0022] （4）阿莫西林抗体的制备方法：a) 动物免疫
用制备好的人工抗原作为免疫原，取等量抗原与弗氏完全佐剂，两者在注射器中充分乳化后皮下注射5只10周龄的BALB/C雄性小鼠，每只小鼠的免疫剂量为100μg，间隔三周后通过皮下注射进行加强免疫，加强免疫时将等量抗原与弗氏不完全佐剂混合乳化，每只小鼠的免疫剂量为100μg。免疫五次后对小鼠进行尾部采血，并离心取血清。
[0023] b) 测定抗体效价将阿莫西林包被原用0.01M pH7.2的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液进行溶解，配成浓度为1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL的包被浓度，每种包被浓度加入96孔酶标板的一列，每孔加样量为100μL，将其放入37℃烘箱中孵育2h，然后用含0.5%Tween-20的0.01M pH7.4的PBS缓冲液洗涤三次，甩干后用 1% 的明胶作为封闭液在37℃封闭2h，取出洗涤三次甩干。将抗血清稀释1000、3000、9000、27000倍，每种稀释倍数的抗体加入到四条酶标板的一横行，每个孔加100μL，37℃孵育30min后洗涤干净，再加入1:3000的羊抗鼠二抗100μL/孔，37℃孵育30min后洗涤干净，再用100μL/孔的显色液显色15min，最后加入50μL/孔的终止液，用酶标仪测定480nm处的吸光值。
[0024] c) 间接ELISA的测定用1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL的阿莫西林包被原包被3条酶标板100μL/孔，将其放入
37℃烘箱中孵育2h，然后用含0.5%Tween-20的0.01M pH7.4的PBS缓冲液洗涤三次，甩干后用 1% 的明胶作为封闭液在37℃封闭2h后，取出洗涤三次甩干。将阿莫西林标准品配成
50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、1ng/mL的6个浓度梯度，3条酶标板的第一行加入50μL/孔的0.01M pH7.2的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，从第二行开始每行依次加入从低浓度到高浓度的阿莫西林标准品50μL/孔，然后再加入50μL/孔的1:1000稀释的阿莫西林抗血清，37℃孵育30min后洗涤干净，再加入1:3000的羊抗鼠二抗100μL/孔，37℃孵育30min后洗涤干净，再用100μL/孔的显色液显色15min，最后加入50μL/孔的终止液，用酶标仪测定
480nm处的吸光值。从下表中看出，得到的抗体对阿莫西林的抑制效果明显。
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