[0001] 本发明涉及一种用于合成达巴万星的方法。

[0002] 达巴万星是一种半合成的脂糖肽(lipoglycopeptide)，并且通过破坏细胞壁生物合成来发挥其杀菌作用。它结合到生长中的肽聚糖链上的D‑丙氨酰‑D‑丙氨酰残基并且防止发生转肽作用，从而防止肽聚糖伸长和细胞壁形成。

[0003] 达巴万星是通过使选定的野野村菌属(Nonomuraea)菌株发酵以产生天然糖肽复合物A‑40926来制造的。然后，该前体在其糖部分的羧基处被选择性酯化，其肽基羧基被酰胺化，并且N‑酰基氨基葡萄糖醛酸羧基的酯被皂化。结果是两个密切相关的结构家族‑A和B‑的复合混合物，其可以被进一步细分为总共五个亚型(见下表)。

[0004]

[0005] 同源物 N‑酰基氨基葡萄糖醛酸的烷基侧链(R1) 氨基末端取代基(R2)A0 CH(CH3)2 H
A1 CH2CH2CH3 H
B0 CH2CH(CH3)2 H
B1 CH2CH2CH2CH3 H
B2 CH2CH(CH3)2 CH3

[0006] 存在用于将前体A‑40926转化为达巴万星的各种方法，所有方法都包括酯化、酰胺化和水解的步骤。

[0007] US 6900175描述了在0℃时使用硫酸在甲醇中的溶液的酯化步骤，然后通过用三乙胺进行pH调节来分离产物，以使产物的两性离子形式沉淀，然后进行离心和真空烘箱干燥。

[0019] 在本发明所述的方法中，达巴万星通过将A‑40926的两种羧基之一转化为(二甲基氨基)丙基酰胺，从天然存在的化合物A‑40926(如下式I所示)制备。

[0020] 在根据本发明的方法中，从式I中的化合物合成达巴万星：

[0021]

[0022]

[0023] 如从式I可见，A‑40926具有两种羧基，肽基羧基和N‑酰基氨基葡萄糖醛酸基团。为了获得达巴万星，将肽基羧基酰胺化。因此，需要进行N‑酰基氨基葡糖醛酸基团的选择性烷基酯化，以保护该基团免受酰胺化，并且合成方法的第一步是酯化步骤，从而获得式II的化合物。

[0024]

[0025] 通过向包含酸的醇溶液中加入A‑40926来进行酯化步骤，所述酸诸如，例如是酸HCl、HBr、H2SO4、H3PO4、HNO3、F3CCO2H、F3CSO3H、H3CSO3H或对甲苯磺酸中的任何一种。

[0026] 因此，根据所使用的酸，式II中的X可以是Cl、Br、HSO4、SO4、H2PO4、HPO4、PO4、NO3、F3CCO2、F3CSO3、H3CSO3或对甲苯磺酸根。

[0027] 术语“醇溶液”被理解为包含醇并且其中存在不超过2％的水的溶液。在一个实施方式中，存在不超过1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或0.05％。

[0028] 在一个实施方式中，醇溶液中的水量在0.05％至2％的范围内。

[0029] 醇可以是甲醇、乙醇或C3‑C6醇。

[0030] 根据所使用的醇，式II的R可以是C1至C6烷基。

[0031] 术语“C1‑C6烷基”是指诸如甲基、乙基、丙基、正丁基、正戊基、正己基、或它们的支链形式的化合物。

[0032] 在一个实施方式中，所使用的醇是甲醇、乙醇或丙醇，并且R分别是CH3、CH3CH2或CH3CH2CH2。

[0033] 在一个实施方式中，所使用的醇是甲醇，并且R是CH3。

[0034] 如上所述，醇溶液还可以包含酸，诸如，例如HCl、HBr、H2SO4、H3PO4、HNO3、F3CCO2H、F3CSO3H、H3CSO3H、或对甲苯磺酸。

[0035] 在一个实施方式中，酸可以以无水酸的形式加入到醇溶液中。

[0036] 然而，并不是所有酸都可用作无水酸。在一个实施方式中，酸可以通过向醇溶液中加入酰卤在醇溶液中原位生成。

[0037] 术语“酰基”是指包括C1‑C6直链或支链的烷基链。

[0038] 与添加含水酸相反，使用酰卤原位生成酸允许更快的反应，因为大量水的存在减慢了酯化反应。

[0039] 在一个实施方式中，卤化物是氯化物，并且通过向醇溶液中加入酰氯生成酸(HCl)。

[0040] 在一个实施方式中，酰基是乙酰基，并且通过向醇溶液中加入乙酰氯生成酸。

[0041] 在本发明的一个实施方式中，醇是甲醇，并且加入乙酰氯来原位生成HCl。

[0042] 在一个实施方式中，卤化物是溴化物，并且通过向醇溶液中加入酰溴生成酸(HBr)。

[0043] 在一个实施方式中，酰基是乙酰基，并且通过向醇溶液中加入乙酰溴生成酸。

[0044] 在本发明的一个实施方式中，醇是甲醇，并且加入乙酰溴来原位生成HBr。

[0045] 酯化步骤可以在‑20℃至10℃，诸如，例如‑15℃至5℃、‑14℃至5℃、‑13℃至5℃、‑12℃至5℃、‑11℃至5℃、‑10℃至5℃、‑10℃至4℃、‑10℃至3℃、‑10℃至2℃、‑10℃至1℃、‑
10℃至0℃、‑9℃至0℃、‑8℃至0℃、‑7℃至0℃、‑7℃至‑1℃、‑7℃至‑2℃、‑7℃至‑3℃、‑7℃至‑4℃的温度下进行。

[0046] 在一个实施方式中，反应在5℃、4℃、3℃、2℃、1℃、0℃、‑1℃、‑2℃、‑3℃、‑4℃、‑5℃、‑6℃、‑7℃、‑8℃、‑9℃或‑10℃的温度下进行。

[0047] 反应时间将取决于所使用的温度，并且可以是1小时至50小时，诸如，1小时至45小时、2小时至40小时、2小时至30小时、2小时至24小时、3小时至23小时、4小时至22小时和5小时至21小时。

[0048] 酯化步骤可以使用30:1至5:1，诸如，例如25:1至5:1、20:1至5:1、25:1至10:1和20:1至10:1的乙酰氯:A‑40926的摩尔比进行。

[0049] 在一个实施方式中，反应使用20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1或10:1的乙酰氯:A‑40926的摩尔比进行。

[0050] 在酯化反应之后，需要将所得中间体进行制备用于酰胺化步骤。在本领域已知的用于合成达巴万星的方法中，通过沉淀、分离所得固体和干燥以除去任何不需要的溶剂来制备来自酯化步骤的中间体，以用于酰胺化步骤。然而，这可能导致不需要的杂质，特别是降解产物甘露糖基苷元(MAG)和去甘露糖基衍生物(取决于pH)的形成增加。此外，本领域已知的涉及pH调节以使产物沉淀的方法可能导致不适于快速过滤的固体，并且显然需要在加热的真空烘箱中彻底干燥，以在随后的酰胺偶联之前去除所有痕量的水和醇溶剂。

[0051]

[0052] 本发明人惊奇地发现，通过使用适量的有机抗溶剂(例如叔丁基甲基醚(TBME)或二甲氧基乙烷(DME))来使式II的化合物沉淀，在过滤步骤之后，所得沉淀物可以直接用于随后的酰胺化反应，而不必在烘箱(例如真空烘箱)中进一步干燥沉淀物。本发明人已经发现，通过使用TBME或DME，形成了可易于过滤的沉淀物，其适用于更容易且具有时效性的过滤，从而避免了离心的需要。本发明人已经发现，产生可易于过滤的沉淀物的本方法特别适用于高级别合成工艺，并且已经在起始化合物A‑40926为500g以上的规模中成功使用。其他现有已知的方法可以产生沉淀物，该沉淀物可以在较小规模中过滤，但在较大规模中不可行或不实用。

[0053] 在本发明的一个实施方式中，使用TBME进行沉淀。用于酯化的醇与TBME的比例可以为约1至5.0，诸如，例如1至4.9、1至4.8、1至4.7、1至4.6、1至4.5、1至4.4、1至4.3、1至4.2、1至4.1、1至4.0、1至3.9、1至3.8、1至3.7、1至3.6、1至3.5和1至3.4、1至3.3、1至3.2、1至3.1、1至3.0、1至2.9、1至2.8、1至2.7、1至2.6、1至2.5、1至2.4、1至2.3、1至2.2、1至2.1和
1至2.0。

[0054] 可以在步骤iv之前对包含沉淀的式II的化合物的溶液进行过滤。

[0055] 可以仅通过使用重力来过滤包含沉淀的式II的化合物的溶液。

[0056] 因此，在一个实施方式中，在不向过滤器施加正压或负压的情况下进行过滤步骤。

[0057] 通过在过滤器上用气流(诸如，例如干燥氮气)处理酯化过程的产物，将其制备用于随后的酰胺化反应，从而可以完成过滤步骤，该过程是快速的并且可以在约一小时内完成，并且与例如在真空烘箱中干燥相反，该过程避免了降解产物的形成。

[0058] 可以使用Nutsche过滤器过滤包含沉淀的式II的化合物的溶液。在一个实施方式中，过滤在重力，和/或与过滤器之前施加干燥氮气的高压，和/或与Nutsche过滤器之后施加的低压下进行。

[0059] 在过滤含有沉淀的式II的化合物的溶液后，将沉淀物溶解在合适的溶剂中，该溶剂诸如，例如DMSO(二甲基亚砜)、DMF(二甲基甲酰胺)、DMA(二甲基乙酰胺)、THF(四氢呋喃)、NMP(N‑甲基‑2‑吡咯烷酮)或它们的混合物，并且将标准的胺偶联试剂和3‑(二甲基氨基)‑1‑丙胺加入到所获得的溶液中以获得式III的化合物。

[0060]

[0061] 其中R可以是C1至C6烷基，

[0062] 可以使用的胺偶联试剂的实例是DCC(二环己基碳二亚胺)、DIC(二异丙基碳二亚胺)、EDC(N‑乙基‑N'‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、HOBt(羟基苯并三唑)、HOAt(1‑羟基‑7‑氮杂苯并三唑)、PyBOP(苯并三唑‑1‑基‑氧基三吡咯烷基膦六氟磷酸盐)、HATU(O‑(7‑氮杂苯并三唑‑1‑基)‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸盐)。

[0063] 在胺偶联步骤之后，可以通过沉淀、过滤和任选的真空干燥获得式II的化合物。

[0064] 为了获得达巴万星，需要去除在酯化步骤中添加到N‑酰基氨基葡萄糖醛酸羧基中的烷基。这是通过酯水解步骤进行的。

[0065] 可以对通过本文所述的合成方法获得的达巴万星进行进一步纯化，以去除剩余的发酵相关杂质和/或合成及工艺相关杂质。

[0066] 说明书和权利要求中的所有数字都由术语“约”修饰。这意味着每个数字都包括如定义的所讨论数值或范围的±10％的微小变化。

[0067] 实施例1

[0068] (a)在0℃、干燥氮气气氛下将A40926(645g)以确保温度不超过4℃的速率逐份加入到盐酸甲醇(methanolic HCl)(0.55M，10.0L)的溶液中。然后将温度调节至4℃，并通过HPLC间隔地监测反应进展。当通过HPLC判断反应完全时，在约1小时的时段内加入TBME(32.0L)以使产物沉淀。使用Nutsche过滤器过滤固体材料，并用另外的TBME(3×5L)进行洗涤。使用干燥氮气流干燥滤饼(filter cake)，直到固体材料具有粉末状稠度。将半干燥的材料直接用于随后的反应中。

[0069] (b)将半干燥的材料(1当量)溶于DMF(75mM)中，冷却至0℃，并加入三乙胺(2.0当量)和HATU(1.0当量)。10分钟后，加入3‑(二甲基氨基)‑1‑丙胺(1.0当量)，并将混合物再搅拌30分钟。加入乙酸乙酯以使产物沉淀，将其过滤并用另外的乙酸乙酯洗涤。将固体材料在30℃在真空烘箱中干燥，并在不进行进一步纯化的情况下用于随后的反应中。

[0070] (c)将偶联产物(667g)在水(12.5L)中的浆液冷却至2℃，并在5分钟内加入含水氢氧化钠(2M，1.4L)，将温度保持在低于4℃。然后将温度调节至6℃，并将反应混合物在该温度下搅拌3小时。