[0001] 本发明属于免疫学技术领域，具体涉及的是一种涕灭威半抗原、抗原、抗体及涕灭威检测试纸条和应用。

[0002] 涕灭威属于氨基甲酸酯类农药，是20世纪40年代发现并发展起来的，具有选择性强、高效、广谱、低毒、易分解、残毒少等优点，已被广泛用于农业、林业、畜牧等领域。该农药一般为白色结晶粉末，难溶于水，易溶于有机溶剂，遇碱即可分解，受光线和温度等作用可降解。因涕灭威半衰期短，故对食品污染相对较轻。涕灭威进入人体后，可抑制胆碱酯酶的活性，会导致人体出现流涎、流泪、颤动、瞳孔缩小等症状。对中度较低的中毒者有短暂的麻醉性，而大剂量的中毒者则会出现严重的麻痹，并伴随严重的呼吸困难。国际癌症研究机构在2007年把涕灭威列为2A类致癌物。根据我国农业部门有关禁限用农药的有关规定，我国已明令禁止在蔬菜、瓜果、茶叶、菌类、中草药材上等作物使用涕灭威。2021年发布实施的《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》(GB2763—2021)标准中规定涕灭威在果蔬中的最大残留限量为0.02‑0.1mg/kg，2020年版《中华人民共和国药典》中规定板蓝根等药用植物中的最大残留限量为0.1mg/kg。

[0003] 目前，涕灭威检测方法主要为仪器检测和酶联免疫分析法(ELISA)。仪器检测常用的包括气相色谱法、液相色谱法和气相色谱‑质谱法等，具有很高的灵敏度和特异性，但仍存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备，时间长以及熟练的技术人员。ELISA是将抗原抗体反应的特异性与酶高效催化反应的专一、敏感性相结合的一种标记免疫学技术。但是ELISA方法存在以下缺点：(1)ELISA法检测一般需要3‑4h才能出结果，检测时限长；(2)ELISA由于加样量不一致，加样时间长短不一，洗涤条件，操作人员不一致，会导致测定重复差值大，重复性差；(3)ELISA法检测时需要使用多种仪器设备或试剂操作步骤相对复杂，需经过相关实验仪器培训的人员操作；(4)ELISA法制作成本高，制作耗材、使用样本量、试剂用量及试剂种类等相对较多且价格昂贵；(5)ELISA法的储运温度2‑8℃，要求较高；(6)ELISA加样相对复杂，容易发生孔间污染，从而导致假阳性结果，影响测试的准确性。

[0004] 基于上述方法存在的缺点，胶体金免疫层析法因其测试时间短、准确度好、重复性好、操作简单、成本低等优点得到广泛应用。胶体金免疫分析技术(CGIA)是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应的一种新型标记免疫分析技术，胶体金具有很大的比表面积及良好的生物相容性，可以与被标记物通过物理吸附进行非共价结合，其标记技术具有简单快速和无污染等优点，且结果检测不需昂贵的激光检测仪器，只需普通光学仪器，甚至通过肉眼即可辨别鉴定。凭借以上优点，基于胶体金的检测技术一度成为研究的热点，尤其是胶体金免疫层析试纸条已被广泛使用。但是，如何提高检测结果的精确度和降低其检测限值是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

[0042] 本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

[0043] 下述制备工艺条件中如无特殊说明，均为现有技术中常规操作。

[0044] 下述制备工艺中的试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0045] 下述实施例中涉及的试剂如下：

[0046] 重悬液：10％(w/v)蔗糖，1％(w/v)BSA，0.1％(v/v)Triton X‑100，其pH为7.4；

[0047] 第一缓冲液：10mM Na2HPO4·12H2O，3％(w/v)BSA，0.1％(v/v)Triton X‑100，0.01％(v/v)Proclin 300；

[0048] 第二缓冲液：20mMNa2B4O7·10H2O，1％(w/v)BSA，0.8％(w/v)NaC1，0.05％(v/v)SDS‑L，0.01％(v/v)Proclin 300，表面活性剂S9：0.5％(v/v)，Tween‑20：0.1％(v/v)；

[0049] 包被液：20mMNa2HPO4·12H2O，表面活性剂S9：0.5％(v/v)。

[0050] 实施例一、涕灭威半抗原和单克隆抗体的制备

[0051] 1.涕灭威半抗原制备

[0052] 合成过程如下：

[0053] 灭多威肟(1mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中,先后加入三乙胺(1.1mol)，异氰酸酯(1mmol)，室温搅拌2小时反应完成，水洗，无水硫酸钠干燥，旋干得粗品，得到A粗品。粗品(0.33mmol)溶于四氢呋喃/水(5m/1mL)中，加入一水氢氧化锂(1mol)，室温搅拌2小时反应，旋干除去四氢呋喃，冰浴下滴加稀盐酸(1M)至弱酸性(pH＝3)，二氯甲烷萃取后TLC及HPLC纯化得终产物为涕灭威半抗原。

[0054]

[0055] 其核磁数据如图1所示，可从核磁数据中进一步得到所述的涕灭威半抗原结构。

[0056] 合成得到的涕灭威半抗原结构式如式(Ⅰ)所示：

[0057]

[0058] 2.免疫抗原的制备

[0059] 将合成得到的涕灭威半抗原(9mmol)、N‑羟基琥珀酰亚胺(18mmol)及1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(18mmol)溶解于300μL无水N，N‑二甲基甲酰胺中，搅拌反应，得到活化的半抗原溶液，即A液；将匙孔血蓝蛋白(0.0015mmol)用碳酸盐缓冲溶液稀释，得到B液；将A液缓慢加入到B液中进行反应，得到反应液；反应完成后用磷酸盐缓冲液透析反应液，得到免疫抗原。

[0060] 3.包被抗原的制备

[0061] 将合成得到的涕灭威半抗原(5.28mmol)、N‑羟基琥珀酰亚胺(15.84mmol)及1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(15.84mmol)溶解于300μL无水N，N‑二甲基甲酰胺中，搅拌反应，得到活化的半抗原溶液，即A液；将牛血清蛋白(0.088mmol)用碳酸盐缓冲溶液稀释，得到B液；将A液缓慢加入到B液中进行反应，得到反应液；反应完成后用磷酸盐缓冲液透析反应液，得到包被抗原。

[0062] 4.涕灭威单克隆抗体的制备和腹水纯化

[0063] (1)动物免疫的获得

[0064] 将制备得到的免疫抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18‑21天；通过间接竞争酶联免疫法(ic‑ELISA)观测本次设计半抗原和之前文章中设计半抗原小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制，选择血清测定结果最佳的小鼠进行融合。

[0065] 对比半抗原：

[0066]

[0067] 表1间接竞争酶联免疫法测定不同半抗原免疫的小鼠血清结果

[0068]

[0069] 结果如表1所示，在工作点区间范围内(1.000～1.800)，涕灭威浓度为20ng/mL的情况下，本研究所设计半抗原的抑制率高于对比半抗原，故对本研究所用半抗原免疫出的小鼠进行细胞融合。

[0070] (2)细胞融合并筛选

[0071] 在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合。第7天筛选细胞，筛选分两步：第一步先用ic‑ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用涕灭威为标准品，用ic‑ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对涕灭威标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。

[0072] 按上述方法进行至少三次亚克隆，最终获得涕灭威单克隆细胞株，所述的单克隆细胞株将其命名为单克隆细胞株BXMD，并于2024年4月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45913，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，电话：010‑64807355，传真：010‑64807288，电子邮件：cgmcc@im.ac.cn。

[0073] (3)单克隆抗体的制备

[0074] 取8‑10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔6
注射1×10涕灭威杂交瘤细胞株BXMD，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸‑饱和硫酸铵法进行抗体纯化。

[0075] 在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀，再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M的磷酸缓冲溶液(pH 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的涕灭威单克隆抗体置于‑20℃保存。

[0076] 实施例二、涕灭威胶体金层析检测试纸条的制备

[0077] 1、胶体金‑单克隆抗体复合物的制备

[0078] 将粒径为15nm的胶体金溶液用0.1M K2CO3调节pH为8.2，将10μg涕灭威单克隆抗体用重悬液稀释后加入到胶体金溶液中，静置45min，加入10％的BSA溶液，混匀后静置2h，之后在4℃、9500rpm的条件下离心45min后，弃去上清，得到的沉淀用重悬液重悬。

[0079] 2、金标微孔的制备

[0080] 将胶体金‑单克隆抗体复合物使用第一缓冲液稀释5倍后加入到96微孔板上，每孔50μL，于冻干机上冻干，铝箔纸密封干燥保存备用。

[0081] 3、样品垫的制备

[0082] 将玻璃纤维膜放入第二缓冲液中浸泡5h，取出后于37℃干燥过夜，得样品垫，铝箔袋密封干燥保存，备用。

[0083] 4、包被膜的制备

[0084] 如图2所示，将包被抗原稀释至不同的浓度，用喷膜仪以喷量为0.8pL/cm的条件将其在硝酸纤维素膜上划两条线，干燥箱内37℃干燥12h，得两条检测线T1和T2。经测试后，浓度为0.3mg/mL(T1)和0.1mg/mL(T2)显色显均一，因此选择0.3mg/mL(T1)和0.1mg/mL(T2)制备包被膜；采用包被液将羊抗鼠多克隆抗体稀释至0.1mg/mL，采用喷膜仪以0.8mL/cm的条件将其在硝酸纤维素膜上划线，该线与两条检测线平行，然后在干燥箱内37℃干燥12h，得控制线。

[0085] 5、试纸条的组装

[0086] 将吸水垫、样品垫、硝酸纤维素膜粘在PVC底板上，且硝酸纤维素膜的上端与吸水垫有部分重叠，下端与样品垫有部分重叠，然后切条组装。组装好的试纸条结构如图3所示。

[0087] 6、检测原理

[0088] 胶体金层析试纸条的检测原理为T线的包被抗原与样品中的目标分析物竞争结合胶体金标记的单克隆抗体。当样品中没有目标分析物时，胶体金标记的单克隆抗体仅与T线上的包被抗原结合，T线呈现较深的颜色。当样品中含有目标分析物时，胶体金标记的单克隆抗体首先与样品中的目标分析物结合，与T线上的包被抗原结合减少，是T线呈现较浅的颜色。随着目标分析物的增加，T线逐渐变浅。使用胶体金分析仪读数可以得到T线和C线的颜色强度，通过OriginPro 8.5做图，以(T1+T2)/C为纵坐标，目标分析物浓度为横坐标，获得胶体金层析试纸条标准抑制曲线，如图5，图7所示。

[0089] 实施例三、涕灭威胶体金层析试纸条性能检测及实际应用

[0090] 1、检测限实验

[0091] 在PBS缓冲液中分别添加涕灭威标准品至最终浓度为(0，20，50，100和200ng/mL)，再取实施例2中制备好的试纸条进行检测，每个样本重复测试三次。

[0092] 将150μL样品溶液加入到金标微孔中37℃孵育3min，取100μL反应液垂直滴加到样品垫上，反应8min。

[0093] 试纸条检测结果如图4所示，随着涕灭威浓度的增加，试纸条上的涕灭威检测结果的检测线颜色逐渐变浅；

[0094] 通过对不同的浓度梯度进行检测后得到的PBS缓冲液中涕灭威检测的标准曲线如图5所示，当涕灭威浓度为0时，以y‑3SD对应的涕灭威浓度作为最低检测限，该曲线对应的检测涕灭威农药残留最低检测限是3.152ng/mL，满足检测要求。

[0095] 2、稳定性试验

[0096] 采用实施例2中制备好的涕灭威胶体金层析试纸条装入密封袋内，内置干燥剂，于45℃烘箱内保存，分别于3天、7天、14天、21天、28天、30天取出，利用PBS稀释涕灭威标准品溶液，后进行检测试纸条的稳定性。

[0097] 对比30天后，检测结果均无明显变化。45℃保存30天，相当于常温保存12个月。

[0098] 实施例4、中草药板蓝根中的涕灭威农药残留中的检测分析

[0099] 称取10g(±0.1g)均质样品至50mL塑料离心管中，每个样品分为两组，分为阴性样品和阳性样品，阴性样品不做任何处理，阳性样品则加入涕灭威标准品至0，20，50，100，200和500μg/kg。随后在阴性样品和阳性样品中都加入3mL的甲醇，继续涡旋震荡3min，3500rpm/min下离心5min。取1mL上清液于5mL离心管中，40℃氮吹，之后用100μL甲醇溶液复溶，再用含1％870的PBS溶液稀释10倍。

[0100] 取实施例2中制备好的试纸条进行检测，将150μL样品溶液加入到金标微孔中37℃孵育3min，取100μL反应液垂直滴加到样品垫上，反应8min，每个样本重复测试三次。结果通过胶体金分析仪读数可以得到准确数据。可以用OriginPro 8.5做图，获得板蓝根样本中涕灭威胶体金层析试纸条标准抑制曲线。

[0101] 如图6、7所示，通过胶体金层析试纸条标准抑制曲线检测结果，该曲线对应的结果表明此方法检测涕灭威农药残留最低检测限10.525μg/kg。并通过此方法，可以定量分析板蓝根实际样本中涕灭威的残留限量。说明本发明的涕灭威检测方法对于实际样品的检测结果也是可以满足要求。

[0102] 综上所述：

[0103] (1)本发明提供了一种涕灭威半抗原，所述的涕灭威半抗原是发明人自行研发，并委托合成公司合成得到，所述的半抗原可用于制备涕灭威抗原，涕灭威抗体以及检测试剂；

[0104] (2)本发明另提供了一种涕灭威抗原，所述的涕灭威抗原是由所述的涕灭威半抗原与载体蛋白偶联得到，所述的涕灭威抗原可以用于制备涕灭威抗体和涕灭威检测试剂；

[0105] (3)本发明还提供了一株分泌涕灭威单克隆抗体的杂交瘤细胞株BXMD，所述的细胞株是由涕灭威抗原免疫动物获得，可以用于制备涕灭威抗体；

[0106] (4)本发明还提供了涕灭威单克隆抗体，所述的涕灭威单克隆抗体由杂交瘤细胞株BXMD分泌获得。

[0107] (5)本发明还提供了一种涕灭威检测试纸条，所述的试纸条具有特异性强，敏感性高，检出最低限量可达到3.152ng/mL；还具有简便、快速、时效性强，使用胶体金层析检测试纸条，无需任何其它大型仪器可现场操作，试纸条加入被检样品液后，在10min内即可判定检测结果。

[0108] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。