[0001] 本发明涉及一种七叶莲总三萜提取纯化工艺。

[0002] 七叶莲为五加科鹅掌柴属植物Schefflera arboricola Hayata，产于福建、台湾、广东、云南等地，是我国传统的民间中草药，含有多种化学成分，包括：挥发油类；有机酸类；三萜类；生物碱类；酚类；蛋白质类；人参炔醇等，具有广泛的药理活性如抗炎、镇痛、镇静催眠和松弛支气管平滑肌等和临床疗效，临床上用于跌打损伤、风湿关节痛等治疗。

[0003] 市售的七叶莲片具有祛风除湿，活血止痛功能。目前临床上常见抗炎镇痛药均为化学合成药物，副作用大，有些还有严重的成瘾性。而七叶莲制剂相对来说，抗炎镇痛疗效显著，对治疗三叉神经痛见效快，毒性小。然而目前七叶莲制剂多以粗提物入药，七叶莲片的生产工艺系以七叶莲生药直接打粉入药，使得药片规格偏大，患者服用量多，药品的质量和药效有较大提升空间。

[0004] 目前文献中还没有关于七叶莲总三萜的提取和纯化的相关方法。在一些专利文献中有关于其他中药材中总三萜的提取和纯化方法，如授权公告号CN 101785799 B，名称为“香青兰总三萜提取物及其制备方法和用途”的中国发明专利，其公开了香青兰总三萜化合物提取方法，包括如下步骤：

[0005] (1)将香青兰乙醇提取液浓缩，回收乙醇后得浸膏，浸膏加水煮沸洗涤，过滤；

[0006] (2)浸膏以碱水液溶解，过滤，取滤液；

[0007] (3)滤液加浓盐酸，搅拌均匀，过滤，得不溶物；

[0008] (4)不容物以蒸馏水洗脱至水洗液呈中性；

[0009] (5)不溶物以乙醇溶解，脱色剂脱色；

[0010] (6)脱色后的乙醇液上聚酰胺吸附树脂柱，以不高于30％的乙醇冲洗色谱柱，收集

[0011] 30％乙醇洗脱部分，浓缩，干燥，即得，所得提取物中总三萜的重量百分含量不低于50％。

[0012] 该方法虽然可以用来提取香青兰的总三萜，然而用以七叶莲中总三萜的提取时，效果不佳。

[0013] 再如，申请公布号CN 104189021 A，名称为“一种牛樟菌牛樟芝总三萜提取方法”中国发明专利申请，其公开了一种牛樟芝总三萜提取方法，包括以下步骤：

[0014] (1)样品预处理：称取牛樟芝10-20g，烘干至恒重，粉碎过筛，加入10-20倍水溶解，制得待测样品溶液；

[0015] (2)在步骤(1)中的制得的待测样品溶液溶于溶剂中，并加入活性炭，微孔滤膜过滤，取滤液备用；

[0016] (3)在步骤(2)中制得的样品滤液中加入乙醚10-20ml超声混匀中，提取，提取操作重复2次，加入正丁醇25-40ml，超声混匀，提取操作重复3-5次，得样品粗提液；

[0017] (4)将步骤(3)中制得的样品粗提液浓缩、离心、静置10-20min,将沉淀采用水淋洗2-4次，过滤得沉淀；

[0018] (5)将步骤(4)中制得的沉淀加入50ml量瓶中，加入溶剂定容，加入碳酸氢钠溶液5-10ml萃取3-4次，离心取沉淀，干燥得样品总三萜类物质提取物。

[0019] 该方法用以七叶莲总三萜的提取，提取效果也难以令人满意。在现有技术中还记载其他中药材中总三萜的提取方法，然而由于不同的中药材中含有各种不同化学成分，在提取过程中添加的不同试剂以及采用不同的工艺参数均可能使这些化学成分相互作用，从而影响提取的纯度以及提取效果。总三萜在不同中药材的提取受到药材本身性质的影响。

[0020] 目前，还未有关于七叶莲中总三萜的提取和纯化方法，鉴于此，本案发明人对七叶莲中总三萜的提取和纯化工艺深入研究，遂有本案产生。

[0038] 为了进一步解释本发明的技术方案，下面结合实施例进行详细阐述。

[0039] 实施例一

[0040] A、取七叶莲药材，粉碎制成七叶莲粉末，准确称取9份七叶莲粉末，每份20g，分别置圆底烧瓶中；

[0041] B、再往此圆底烧瓶中加入一定浓度和体积的乙醇，进行水浴加热，水浴加热温度为90℃；

[0042] C、然后进行回流提取，将提取液进行过滤得到滤液；

[0043] D、将滤液进行减压浓缩得到浓缩物，将浓缩物进行干燥得到粗提取物。

[0044] 其中，七叶莲由福建省泉州中侨集团股份有限公司药业公司提供，经鉴定为S.arboricola Hayata的干燥根茎叶。减压浓缩采用RE 52-86A型旋转蒸发仪进行。

[0045] 采用上述步骤，进行正交试验：选取乙醇浓度、料液比、提取时间3个影响提取物3
总三萜量的主要因素，每个因素设3个水平(见因素水平表)，进行L9(3)正交试验。

[0046] 其中乙醇浓度为体积浓度；

[0047] 料液比为加入1g的七叶莲粉末，加入的相应乙醇的体积，单位为g/mL；

[0048] 总三萜的含量采用UV-2450型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)进行测量，选用香草醛-冰醋酸-高氯酸作为比色法测定七叶莲总三萜量的显色剂。

[0049] 因素水平表

[0050] Tab.Factors and levels

[0051]

[0052] 正交试验结果如下：

[0053] 正交试验结果

[0054] Tab.Results of orthogonal test

[0055]

[0056]

[0057] 其中，K1、K2、K3表示各因素各水平下提取物总三萜含量的总和，R表示极差。进行方差分析，分析结果如下：

[0058] 方差分析结果

[0059] Tab.Results of variance analysis

[0060]

[0061] 注：在方差分析中，F0.05(2,2)＝19.00，*P<0.05。(“*”是方差分析表中显著性的标示，表示经过方差分析该因素P<0.05，有统计学意义，故因素A对结果有显著性影响)。

[0062] 综合七叶莲中总三萜的提取量和提取效率，确定了本发明的提取工艺：采用浓度为95％的乙醇，料液比为10g/mL，回流提取时间为60分钟。

[0063] 称取一定量树脂(北京索莱宝科技有限公司的AB-8大孔吸附树脂)，用95％乙醇(体积浓度)浸泡24h充分溶胀后，倒出乙醇及漂浮物，进行湿法装柱。用95％乙醇反复冲洗至洗脱液与蒸馏水混合(以体积比1:4混合)不出现白色混浊，再用蒸馏水平衡柱子至树脂排列均匀、无气泡，洗脱液无醇味，备用。

[0064] 通过如下步骤进一步进行粗提取物的纯化：

[0065] E、称取上述步骤D中的粗提取物，配置成浓度为0.884mg/mL的上样液；

[0066] F、将相当于干树脂5g的AB-8大孔吸附树脂，通过湿法装柱装入直径为20mm、高度为300mm的柱体形成树脂柱，用蒸馏水洗脱树脂柱进行除杂；

[0067] G、将步骤E中的上样液上树脂柱，先用蒸馏水洗脱除杂，而后加入体积浓度为80％的乙醇进行洗脱，乙醇洗脱流速为1BV/h，其中1BV＝30mL，乙醇洗脱用量为8BV，其中
1BV＝30mL，收集乙醇洗脱液，将该洗脱液蒸干得到成品。

[0068] 本发明具体是通过以下试验确定最佳工艺：

[0069] 1、大孔树脂的静态吸附与解吸

[0070] 1.1、静态吸附性能考察：准确称取预处理干燥过的3种不同干树脂(D101大孔吸附树脂、X-5大孔吸附树脂、AB-8大孔吸附树脂)各2.0g，置于100mL具塞三角瓶中，加入20mL样液(由上述的粗提取物配置而成的，总三萜浓度为0.884mg/mL)，置于振荡器，振荡器采用海门市其林贝尔仪器制造有限公司的TS-1型振荡器，在室温下，以120r/min振荡
24h，充分吸附后过滤，测定剩余溶液中总三萜的浓度。按式1计算树脂对总三萜的吸附量Q(mg/g)，式1：Q＝(C0-Ce)×V/W，结果见表1。

[0071] 1.2、静态解析性能考察于吸附饱和的3种大孔树脂加入95％乙醇溶液20mL，置于振荡器，在室温下，以120r/min振荡24h，过滤，测定95％乙醇溶液中总三萜的浓度。按式2计算总三萜解析率B(％)，式2：B＝(Cb×Vb/QW)×100％，结果见表1。

[0072] 其中，式1、式2中：Q：吸附量，mg/g；C0：初始浓度，mg/mL；Ce：剩余浓度，mg/mL；V：溶液体积，mL；W：干树脂的质量，g；B：解吸率；Cb：95％乙醇溶液中总三萜的浓度，mg/mL；
Vb：95％乙醇溶液的体积，mL。

[0073] 表1

[0074] 3种大孔树脂吸附量和解吸率测定结果

[0075] Tab 1The static adsorption capacity and elution ratio by the three types of macroporous resin

[0076]

[0077] 由表1结果可知，与D101、X-5两种非极性树脂相比，弱极性树脂AB-8大孔吸附树脂对七叶莲总三萜成分的吸附解析性能相对较好。

[0078] 其中，D101大孔吸附树脂由国药集团化学试剂有限公司提供。

[0079] 其中，X-5大孔吸附树脂由沧州宝恩科技有限公司提供。

[0080] 1.3、静态吸附动力学曲线：准确称取AB-8大孔吸附树脂干树脂2.0g，置于100mL的具塞锥形瓶中，加入样液20mL，置于振荡器，室温120r/min振荡，每隔一段时间测定溶液中总三萜的浓度，计算树脂在t时刻的吸附量Q，以时间为横坐标，吸附量为纵坐标作图，结果见图1。

[0081] 由图1可知，1h前吸附速率较快，随着吸附时间的延长，吸附速率下降，2h时吸附基本达到平衡，因此选定2h为静态吸附时间，在测定等温吸附曲线时选用平衡吸附时间为2h。可见AB-8大孔吸附树脂树脂对七叶莲总三萜具有良好的吸附动力学特性，可较快达到吸附平衡，适于工业化生产。

[0082] 1.4、AB-8大孔吸附树脂吸附等温线测定准确称取5份AB-8大孔吸附树脂干树脂各2.0g，置于5个100mL的具塞锥形瓶中，分别加入5个不同浓度的七叶莲总三萜粗提物样液20mL，置于振荡器，室温120r/min振荡2h，过滤，测定溶液中总三萜的浓度。根据吸附平衡后吸附量与溶液中总三萜浓度之间的关系，得到该树脂的吸附等温线，横坐标表示平衡浓度，单位为mg/mL，纵坐标表示平衡吸附量，单位mg/g，结果见图2。

[0083] 在静态吸附实验中测量吸附等温线可以预测在动态吸附实验中大孔树脂的吸附行为。由图2可知，吸附等温线是渐进线，吸附行为符合Langmuir吸附等温线，可认为AB-8大孔树脂对七叶莲三萜类化合物的吸附是单分子层吸附，故应采用较低的上样浓度，增加上样液浓度并不能很大地提高吸附量，反而会造成三萜类化合物的损失。

[0084] 2.大孔树脂的动态吸附与解吸

[0085] 2.1、上样液浓度对吸附性能的影响:准确称取一定量AB-8大孔吸附树脂(相当于2.5g干树脂)，湿法装柱(1BV＝15mL)，95％乙醇洗脱，蒸馏水洗脱至无醇味。由上述粗提取物分别制备总三萜浓度为0.221、0.442、0.663、0.884、1.105mg/mL的上样液各30mL，收集流出液，测定总三萜浓度，计算吸附量，结果见图3，其中横坐标表示上样液总三萜浓度，单位mg/mL，纵坐标表示吸附量，单位mg/g。

[0086] 由图3可知，随着上样液浓度的增大，AB-8大孔吸附树脂对总三萜的吸附量逐渐增大，当浓度为0.884mg/mL时，吸附量最大，浓度再增加时，吸附量降低。结合样品的水溶性随浓度增加而降低，确定上样液浓度以0.884mg/mL为宜。

[0087] 2.2、上样液pH值对吸附性能的影响准确称取一定量AB-8大孔吸附树脂(相当于2.5g干树脂)，湿法装柱(1BV＝15mL)，95％乙醇洗脱，蒸馏水洗脱至无醇味。取上样液(pH值为5.11)6份各90mL，用1％HCl或5％NaOH溶液调节5份样液的pH，分别调为：3.10、
4.11、6.09、7.10、8.11。将6份样液以流速1BV/h分别上柱，收集流出液，测定总三萜浓度，计算吸附量，结果见图4。

[0088] 由图4可知，AB-8大孔吸附树脂对不同pH样液的总三萜成分的吸附量相差不大，七叶莲样液的pH对大孔树脂吸附三萜成分影响不大，故选择在样液本身的pH进行过柱纯化即可。

[0089] 2.3、最大上样量的考察准确称取一定量AB-8大孔吸附树脂(相当于5.0g干树脂)，湿法装柱(1BV＝30mL)，95％乙醇洗脱，蒸馏水洗脱至无醇味。将240mL上样液以流速1BV/h上柱，分段收集流出液，每10mL毫升收集1份，共24份。测定流出液总三萜浓度，以流出液体积为横坐标，流出液中总三萜浓度为纵坐标，绘制动态吸附曲线，结果见图5。

[0090] 由图5可知，以总三萜浓度为0.884mg/mL的上样液上柱，前5BV的流出液总三萜的浓度相对上样液浓度处于较低水平，此时树脂对三萜类化合物的吸附效果较好，泄露量较少。上柱流出液6BV时，流出液总三萜浓度为上样液浓度的10.05％，此时达到泄露点，总三萜开始泄漏，故确定最大上样量为180mL。其中，大孔吸附树脂的泄漏点也称上柱终点，在上样液不断加到树脂柱上时，树脂开始吸附目标物，上样液加至一定体积时，树脂吸附达到一定饱和，吸附量减小。检测方法为分段收集流出液，测定其中目标物含量，并绘制体积-浓度曲线，当某处泄露液的浓度为上柱前上样液浓度值的10％即为泄露点。

[0091] 2.4、最适洗脱剂浓度的考察取180mL上样液上柱(AB-8大孔吸附树脂干重5.0g，1BV＝30mL)，分别用蒸馏水、20％、40％、60％、80％、95％、100％的乙醇进行洗脱，洗脱流速1BV/h，收集不同浓度乙醇的洗脱液，水浴蒸干，称重。精密称取各洗脱物5.00mg，测定总三萜含量，确定最佳的洗脱剂浓度。结果见表2。

[0092] 表2 不同浓度乙醇对树脂洗脱效果的影响

[0093] Tab 2Effect of ethanol concentrations on desorption quantities of macroret ieular resis

[0094]

[0095]

[0096] 由表2结果可知，用60％、80％、95％乙醇洗脱所得产物的总三萜含量较高，其他浓度所得产物的总三萜含量较低。选用何种洗脱剂除了根据洗脱产物的总三萜含量，同时要结合洗脱物量，95％乙醇洗脱所得产物的总三萜含量虽然最高，但洗脱物量较少，故综合考虑，选择80％乙醇。

[0097] 2.5、洗脱剂用量的考察取180mL上样液上柱(AB-8大孔吸附树脂干重5.0g，1BV＝30mL)，先后用蒸馏水洗脱树脂柱，再用10BV的80％乙醇洗脱树脂柱，洗脱流速1BV/h，收集洗脱液，每10mL毫升收集1份，共30份。测定洗脱液总三萜浓度，结果见图6，图中横坐标表示柱体积，单位BV，纵坐标表示总三萜浓度，单位mg/mL。

[0098] 由图6可知，当80％乙醇洗脱用量为8BV时，累积固形物的质量已达到总流出液固形物质量的99％，可将98％以上的总三萜含量高的组分洗脱下来。结合薄层色谱层析，以1％香草醛浓硫酸乙醇液为显色剂指示终点，洗脱基本完全，故选定80％乙醇洗脱用量为8BV。

[0099] 3.验证试验：配制总三萜浓度为0.884mg/mL的样液3份各180mL，以1BV/h流速过AB-8大孔吸附树脂柱(AB-8大孔吸附树脂干重5.0g，1BV＝30mL)。先用蒸馏水洗脱树脂柱除杂，而后用80％乙醇洗脱，洗脱流速1BV/h，洗脱量8BV，收集洗脱液，水浴蒸干，称重。精密称取3份洗脱物各5.00mg，测定总三萜质量分数。结果得，3份样品过柱后的洗脱率分别为47.43％、49.22％、47.78％，平均洗脱率为48.14％；所得3份洗脱物的总三萜质量分数分别为45.36％、44.24％、48.34％，平均质量分数为45.98％。

[0100] 本发明通过静态吸附与解吸实验，发现AB-8大孔吸附树脂对七叶总三萜化合物具有较好的静态吸附、解吸性能，适用于七叶莲总三萜成分的纯化，AB-8大孔吸附树脂纯化七叶莲总三萜具有选择性高、吸附能力强、操作简单易行等特点。通过动态吸附与解吸实验，确定AB-8大孔吸附树脂纯化七叶莲总三萜的工艺为：将5g的干AB-8大孔吸附树脂装入直径为20mm、高度为300mm的柱体内，以自然pH条件下的上样液上样，上样液浓度为0.884mg/mL，上样量6BV，用8BV的80％乙醇进行洗脱。在此该工艺条件下，产品的洗脱率达48.14％，总三萜的质量分数达45.98％。

[0101] 在本发明的实施例中，除了“大孔树脂的静态吸附与解吸”这部分实验所用的树脂是经过预先干燥后，成为干树脂，直接称取，其他部分实验所用树脂为湿树脂，实验中采用的是直接购得的含水量约68％的树脂。

[0102] 在本发明中，树脂柱床体积(BV)值的大小与实验所用树脂量的多少有关，在具体实施方式中“2.1、上样液浓度对吸附性能的影响”和“2.2、上样液pH值对吸附性能的影响”部分，准确称取一定量AB-8大孔吸附树脂(相当于2.5g干树脂)，其对应的树脂柱体积1BV＝15mL，其他部分树脂柱体积1BV＝30mL则与一定量AB-8大孔吸附树脂(相当于5.0g干树脂)对应。