[0001] 本发明属于血管药物技术领域，具体涉及鹰不扑总皂苷及其在制备治疗血管损伤后再狭窄的药物中的应用。

[0002] 由于血管损伤多发生在管腔内，关于损伤后血管再狭窄的研究几乎都着重与内膜和中膜，虽然获得了大量研究成果，但目前确切机制目前尚不明确，大多学者达成一个共识：在血管损伤后，内膜和中膜的增殖和迁移是血管损伤后再狭窄的重要因素。

[0003] 目前关于治疗血管损伤后再狭窄的种类很多，例如公开号为CN104174010A的专利公开了采用SHPS1基因敲除可以明显促进内膜新生和细胞增殖；转化生长因子β1参与血管损伤后再狭窄形成中起作用；复方花刺参粘多糖对血管损伤后再狭窄的家兔中血管内膜增殖与凋亡的作用；再例如基质金属蛋白酶参与动脉损伤后再狭窄的过程。

[0004] Wnt信号通路在血管再狭窄中的调控作用是一新的研究领域。有组织胚胎发育研究显示，在血管平滑肌细胞(VSMC)早期形成阶段Wnt信号通路呈激活状态，Quansnichka等研究发现抑制Wnt经典通路后CyclinD1表达下降，使VSMC增殖减少；wang等研究显示大鼠颈动脉受损伤后有β‑catenin信号的激活。还有研究者发现Wnts/Fzds、Dvl、GSK‑3B等上游信号分子也参与了血管受损后的平滑肌细胞增殖。因此，由上述可知Wnt/β‑catenin信号通路可能参与了血管发育或受损伤后的增殖。

[0005] 鹰不扑是一种在壮族地区常见的植物，根皮被广泛用作传统药物治疗心血管疾病及慢性肾炎、前列腺炎、水肿、风湿痹痛等疾病。然而现有技术中，还没有关于鹰不扑具有心血管保护作用的报道。

[0027] 本发明提供了一种鹰不扑总皂苷，由以下步骤制备得到：鹰不扑干燥根皮粗粉和体积浓度70％～80％的乙醇水溶液混合，回流提取，收集提取液浓缩得到浸膏，浸膏复溶于水后用石油醚萃取，收集水相，去除脂溶性的成分后与水饱和的正丁醇混合萃取，取上清液去除正丁醇，蒸干得到鹰不扑总皂苷。

[0028] 本发明以鹰不扑干燥根皮为提取材料提取鹰不扑总皂苷，与鹰不扑药材其他部位相比，鹰不扑干燥根皮在提取鹰不扑总皂苷的总提取率有明显优势。鹰不扑干燥根皮粗粉的粒径优选为10～50目，更优选为24目。所述鹰不扑干燥根皮粗粉有利于提高的药材中活性成分的提取率。本发明对所述鹰不扑干燥根皮的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的鹰不扑干燥根皮的商品材料即可。在本发明实施例中，所述鹰不扑干燥根皮的来源购自广西仙茱中药科技有限公司。

[0029] 本发明以体积浓度70％～80％的乙醇水溶液作为提取溶剂。与其他提取溶剂(例如水)相比，本发明以乙醇水溶液提取鹰不扑总皂苷，具有提取率高的特点。同时本发明具体限定了乙醇水溶液的体积浓度优选为75％～80％，该浓度下能尽可能的将药材中鹰不扑总皂苷充分提取。所述鹰不扑干燥根皮粗粉的质量和乙醇水溶液的体积比优选为1g：6～10mL，更优选为1g：7～9mL，最优选为1g：8mL。

[0030] 在本发明中，所述回流提取的温度优选为60～80℃，更优选为70℃。所述回流提取的时间优选为1～1.5h，更优选为1.2h。所述浓缩优选为减压浓缩。本发明对所述减压浓缩的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的减压浓缩的方法即可。减压浓缩一方面去除提取液中多余的水分，另一方面有利于去除提取液中挥发性成分。所述减压浓缩优选至所述浸膏在60℃条件下相对密度达到1.15～1.20时结束。

[0031] 在本发明中，得到浸膏后，将所述浸膏复溶于水后用石油醚萃取。所述水的用量为每200g的鹰不扑干燥根皮粗粉制备的浸膏用500mL的水复溶。复溶后的浸膏用石油醚萃取。所述石油醚萃取有利于去除提取物中色素成分。所述萃取优选采用分液漏斗进行。

[0032] 在本发明中，萃取后，收集的下层水相去除脂溶性的成分。所述去除脂溶性的成分的方法优选为采用二氯甲烷或三氯甲烷萃取。

[0033] 在本发明中，去除脂溶性的成分后与水饱和的正丁醇混合萃取，取上清液去除正丁醇，蒸干得到鹰不扑总皂苷。所述二氯甲烷或三氯甲烷与所述水、石油醚和水饱和的正丁醇的体积比优选为1：1：1：1。水饱和的正丁醇的作用有二：一是有利于萃取极性较大的皂苷类成分；二是用水饱和的正丁醇能增加正丁醇的溶解度，便于分出，不易乳化。采用水饱和的正丁醇萃取优选重复操作两次。将两次得到的萃取液合并后，优选采用旋转蒸发回收溶剂，优选采用水浴蒸干萃取液，得到干燥提取物为鹰不扑总皂苷。所述鹰不扑总皂苷的储存优选在棕色瓶中保存。采用本发明上述制备鹰不扑总皂苷，具有较高的提取率，提取率不低于7％。将所述鹰不扑总皂苷采用UPLC Q‑Exactive Orbitrap MS技术检测，所得数据通过CD2.1(Thermo Fisher)完成初步整理后进行数据库检索比对(mzCloud，mzVault，ChemSpider)，共鉴定出299种化合物，其中8种齐墩果酸型三萜皂苷和1种强心苷类化合物的结构式。

[0034] 本发明提供了所述鹰不扑总皂苷在制备治疗血管损伤后再狭窄的药物中的应用。

[0035] 在本发明中，鹰不扑总皂苷给药组能明显改善受损血管严重的内膜增生，内膜修复不完整，不连续的内弹力板，管腔内表面粗糙，大量平滑肌细胞由中膜向内膜迁移增生，内膜明显增厚，有大量基质积累，管腔明显变窄；而且还能显著降低血管栓塞比例。这表明鹰不扑总皂苷能够抑制血管损伤诱导的新生内膜增生。

[0036] 鹰不扑总皂苷可抑制受损血管新生内膜中VSMCs由收缩表型向合成型转化，从而抑制血管内膜的增生。同时通过检测反映细胞增殖的重要生物学指标PCNA的表达情况和免疫组化的半定量分析结果表明，鹰不扑总皂苷组平均光密度与模型组有显著性差异(P<0.05)，提示鹰不扑抑制血管损伤后内膜细胞增殖，从而减轻管腔狭窄。

[0037] VSMC的过度生长被认为是导致血管损伤再狭窄的主要因素。通过检测CCK‑8含量，以确定鹰不扑总皂苷对VSMCs细胞增殖的抑制作用。

[0038] 通过伤口愈合试验评估鹰不扑总皂苷对VSMC迁移的影响，结果表明鹰不扑总皂苷减缓单层细胞的创面愈合。

[0039] 采用RT‑qPCR方法检测血管平滑肌细胞Wnt信号通路关键蛋白分子的表达情况，结果表明鹰不扑总皂苷抑制wnt3α/Dvl‑1/β‑catenin通路相关基因表达水平。本发明从多方面、多角度证明鹰不扑总皂苷治疗血管损伤后再狭窄的显著作用，因此，以鹰不扑总皂苷作为唯一活性物质能够实现血管损伤后再狭窄的治疗。

[0040] 基于上述实验结果，本发明提供了所述鹰不扑总皂苷在制备抑制血管内膜增生的药物中的应用。本发明还提供了所述鹰不扑总皂苷在制备抑制血管平滑肌细胞的增殖和/或转移的药物中的应用和所述鹰不扑总皂苷在制备抑制Wnt信号通路中蛋白分子的表达的抑制剂中的应用。

[0041] 下面结合实施例对本发明提供的鹰不扑总皂苷及其在制备治疗血管损伤后再狭窄的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0042] 实施例1

[0043] 取鹰不扑干燥根皮，粉碎成粗粉，精密称取200g，加2000ml 80％乙醇，回流提取，减压浓缩得到浸膏，加500ml双蒸水充分溶解，移至分液漏斗中，再加500ml石油醚萃取，于分液漏斗中取下层水相溶液，计算水相体积，再加等体积的三氯甲烷，充分摇匀后静置，取上层溶液于分液漏斗中，加等体积正丁醇，轻微振摇，取上层溶液，重复正丁醇萃取2次，合并萃取液，旋转蒸发回收溶剂，水浴蒸干，得到14g干燥提取物。计算得到，提取的鹰不扑总皂苷的提取得率为7％。装入棕色玻璃瓶中备用。

[0044] 将鹰不扑总皂苷采用UPLC Q‑Exactive Orbitrap MS技术检测，所得数据通过CD2.1(Thermo Fisher)完成初步整理后进行数据库检索比对(mzCloud，mzVault，ChemSpider)，共鉴定出299种化合物，其中8种齐墩果酸型三萜皂苷和1种强心苷类化合物的结构式(如图1所示)。

[0045] 实施例2

[0046] 不同提取溶剂对鹰不扑总皂苷的提取方法及比较

[0047] 取2份鹰不扑根皮粗粉，各200g，一份用70％乙醇水溶液回流提取，按照实施例1的方法进行提取，另一份用水提(10倍量水，提取2次，每次1h，其余步骤同实施例1)，最后称量、检测提取得到的总皂苷。

[0048] 醇提取方案中得到12.0g总皂苷，提取率为6％；水提取方案中提取得到3.0g总皂苷，提取率为1.5％。

[0049] 实施例3

[0050] 1.大鼠股动脉损伤模型及分组

[0051] 将32只SD大鼠分笼饲养，适应性喂养1W，自由饮食和饮水。随机取24只大鼠建立股动脉内皮剥脱模型，参照文献简述如下：大鼠异氟烷吸入麻醉，切开下肢皮肤，游离并切开股动脉分支，将一直径为1.00mm的介入导丝(Micro Therapeutics，Inc)插入股动脉，来回抽拉3次造成动脉内皮层脱落，操作完成后结扎动脉切口，缝合皮肤。假手术组，仅做皮肤和动脉切口，并不插入介入导丝。造模成功的大鼠随机分为模型组、鹰不扑总皂苷低剂量组(40mg/kg)和鹰不扑总皂苷高剂量组(80mg/kg)。药物组灌胃给予相应的药液，正常组和模型组灌胃给予相应体积生理盐水(10mL/kg)，1次/d，共4W。干预期间观察各组大鼠的一般状态，包括体质量、进食饮水、大小便、毛发等。

[0052] 2.血管梗塞比例的测定及结果

[0053] 给药结束后，动物在麻醉状态下，用中性福尔马林以恒压体循环灌注15min，截取股动脉，以生理盐水冲洗干净，浸泡在福尔马林中固定24h，将股动脉及其周围组织切成2mm长的节段，常规酒精脱水，石蜡包埋，制成5μm厚的血管横断面连续切片。组织切片行HE染色，显微镜观察血管形态，Image‑Pro plus 6.0图像分析软件测量血管内腔周长，换算出血管内腔等效圆形的面积，然后测量血管内膜面积，继而按式I计算血管梗塞比例(infarction ratio)。测量采用单盲法，测量者为与本实验无关者。

[0054] 血管梗塞比例＝血管内膜面积/血管内腔等效圆形面积×100％  式I

[0055] 经典的组织学HE染色分析显示，与假手术组相比，模型组有明显的血管结构变化，血管腔明显变窄。如图2a所示，模型组中观察到严重的内膜增生，内膜修复不完整，不连续的内弹力板，管腔内表面粗糙，大量平滑肌细胞由中膜向内膜迁移增生，内膜明显增厚，有大量基质积累，管腔明显变窄。给药组的病理改变明显减轻，内外弹力板保存相对完整。用Image Pro plus 6.0软件对血管形态计量分析，结果显示，假手术组血管梗塞比例很小约为12.37％，模型组明显增加高达97.14％，与假手术组相比具有极显著性差异(P<0.01)。鹰不扑高、低剂量组血管梗塞比例分别为71.48％和81.75％，高剂量组与模型组相比具有显著性差异(P<0.05)。说明鹰不扑总皂苷能够抑制血管损伤诱导的新生内膜增生。鹰不扑总皂苷改善股动脉机械损伤模型所致的内膜增生。

[0056] 实施例4

[0057] 免疫组织化学检测α‑SMA、PCNA、GSK‑3β、β‑catenin蛋白的表达

[0058] 取实施例3制备的组织切片，采用SABC方法，进行免疫组化染色。分别以抗α‑SMA、PCNA、GSK‑3β、β‑catenin抗体为一抗，其他操作按照试剂盒说明书进行。用新配的DAB显色，显微镜下控制染色程度。用PBS替代一抗做阴性对照。每张切片随机选取5个不同视野，利用Image‑Pro plus 6.0图像分析软件测量AOI面积(area of AOI)及阳性染色积分光密度(integrated optical density,IOD)，计算平均光密度(IOD/AOI)评价区域染色程度。

[0059] 大量研究表明，由收缩型分化成合成型的VSMCs通过细胞迁移和增殖促进血管重构的发生发展而导致血管内膜的增生，本实验检测了受损血管新生内膜中VSMCs收缩表型标志蛋白α‑SMA的表达情况(如图2a所示)。与假手术组比较，模型组大鼠新生血管内膜中α‑SMA表达显著降低，说明模型组大鼠血管新生内膜中VSMCs发了由收缩型向合成型的表型转化。与模型组比较，鹰不扑总皂苷组的α‑SMA表达有所增高，提示鹰不扑总皂苷可抑制受损血管新生内膜中VSMCs由收缩表型向合成型转化。

[0060] PCNA是反映细胞增殖的重要生物学指标，为探讨鹰不扑总皂苷的抗增殖作用，本实验检测了PCNA在受损血管中的表达情况。免疫组化结果显示(如图2a所示)，假手术组未见PCNA染色阳性细胞，模型组血管新生内膜的平滑肌细胞排列紊乱呈弥散性增厚，PCNA阳性细胞大量表达，染色较深，鹰不扑总皂苷组血管内膜增厚程度比模型组显著减轻，且仅在靠近管腔的新生内膜处可见少量PCNA阳性细胞，其染色程度较浅。通过免疫组化的半定量分析发现，鹰不扑总皂苷组平均光密度与模型组有显著性差异(P<0.05)，提示鹰不扑抑制血管损伤后内膜细胞增殖，从而减轻管腔狭窄。

[0061] 实施例5

[0062] 1.血管平滑肌细胞培养及药物处理

[0063] 用酶消化法从大鼠主动脉分离培养。麻醉动物，打开胸腔，从左心室用灌注将主动脉内的血液冲洗干净，剔除血管周围脂肪和结缔组织，取出胸主动脉，放入用Hanks平衡盐配置的混合酶消化液中(HBSS，包含Collagenase II 1mg/ml,Elastase 0.744U/ml，Soybean Trypsin Inhibitor 1mg/ml，和BSA 2mg/ml)，37℃孵育15min后，用镊子小心撕去外膜，用棉签轻轻擦去内膜，所得的中膜组织剪成碎片，加入新鲜的混合酶消化液，37℃孵育2～3h，将消化后的组织轻轻吹打成细胞悬液，1000rpm离心5min收集细胞，加入含10％FBS的DMEM培养液重新悬浮细胞，接种于培养瓶中，细胞长满后，用0.125％胰蛋白酶/EDTA消化传代。培养的平滑肌细胞在倒置相差显微镜下进行形态学观察，用抗α‑SMA的单克隆抗体与Alexa Fluor 594标记的二抗进行免疫细胞化学染色，荧光显微镜下观察阳性细胞数。第5～9代细胞用于实验。

[0064] 2.细胞增殖测定

[0065] 取对数生长期VSMCs，以每孔1.0×104个细胞密度接种于96孔培养板，饥饿培养24h，进行如下分组：正常对照组(control)；鹰不扑总皂苷各剂量组(1.875、3.75、7.5、15、
30μg/ml)；5％FBS组；鹰不扑总皂苷各剂量组(1.875、3.75、7.5、15μg/ml)+5％FBS组。按上述分组分别处理12h，24h，36h。处理完成后每孔加入10μl CCK‑8溶液，摇床震荡后置于培养箱内孵育2h，酶标仪450nm波长处测定各组吸光度值(OD)，同时设置空白对照孔，OD值＝测定孔‑空白孔。实验至少重复三次。

[0066] VSMC的过度生长被认为是导致血管损伤再狭窄的主要因素，因此，通过检测CCK‑8，以确定鹰不扑总皂苷对VSMCs细胞增殖的抑制作用。首先检测了鹰不扑总皂苷对正常生长的VSMCs的细胞毒性，结果如图3a所示，除鹰不扑总皂苷剂量组(30μg/ml)具有细胞毒之外，其余各组均能未显示出明显的细胞毒性。因此，选择检测鹰不扑总皂苷1.875、3.75、
7.5、15μg/ml这4个剂量对15％FBS诱导的VSMC增殖的抑制作用，结果如图3b。鹰不扑总皂苷能有效抑制血清诱导的VSMCs细胞增殖，且该抑制作用呈现出良好的时‑效、量‑效关系。

[0067] 实施例6

[0068] 划痕实验

[0069] VSMCs接种于6孔板(3.0×105cells/well)，细胞贴壁后用100μl枪头轻划线后用PBS洗两次。选择细胞毒性较小且能有效抑制15％FBS诱导增殖的2个鹰不扑总皂苷剂量(7.5、15μg/ml)处理24h。各孔划痕在显微镜(Olympus，Japan，100×)下观察拍照分别拍照，记录划痕0h和24h划痕平均宽度，并按照式II计算划痕愈合度。实验至少重复三次。

[0070] 划痕愈合度＝初始0h划痕平均宽度‑24h划痕平均宽度  式II

[0071] 通过伤口愈合试验评估鹰不扑总皂苷对VSMC迁移的影响，如图3c所示，鹰不扑总皂苷显著性抑制血清诱导的VSMC在受伤后24小时伤口愈合，7.5、15μg/ml的鹰不扑总皂苷的划痕愈合度分别为578.85和420.97，与模型组比较均具有显著性差异(图3d)。

[0072] 实施例7

[0073] RT‑qPCR检测

[0074] 利用TRNzol Universal试剂(购自TIANGEN公司)常规提取VSMC总RNA，infinite TECAN酶标仪(型号：M200PRO)测定D(λ)260/D(λ)280，若为1.8～2.0则保存备用。取1μg总RNA合成cDNA(Fast Reverse Transcription Master Mix购自BIOTECHINC公司)；反应体系先在42℃下5min去除残留DNA，然后在42℃下15min进行逆转录，95℃下5min灭活逆转录酶。取1.2μl逆转录反应产物进行实时荧光PCR反应，按照AB HS Green qPCR Mix试剂盒(购自BIOTECH INC公司)，采用两步法热循环，反应条件为：95℃×3min预变性1循环，95℃×10s变性、60℃×30s退火，重复40循环；所有样品加样于96孔PCR板中，每一样品重复3孔，所有反应在Roche LightCycler Sequence Detection System中进行。引物序列见表，相对定量的方法采用比较Ct法，以GAPDH为内参，采用△Ct(Ct目的‑Ct内参)法进行相对定量分析，以作为目的RNA的相对表达量。

[0075] 表1实时RT‑qPCR的引物信息

[0076]

[0077] 鹰不扑总皂苷抑制wnt3α/Dvl‑1/β‑catenin通路相关基因表达水平

[0078] RT‑qPCR检测结果显示(图3e)，鹰不扑总皂苷高剂量组(15μg/ml)显著抑制由15％FBS诱导的血管平滑肌细胞Wnt信号通路关键蛋白分子(Wnt3α、β‑catenin、Gsk‑3β、Dvl‑1、Cyclin D1)mRNA的高表达。

[0079] 实施例8

[0080] western blot

[0081] 消化收集经上述药物处理的细胞，按照蛋白质抽提试剂盒说明提取蛋白，所得提取物以BCA法测定蛋白浓度后储存于‑80℃备用。取适量蛋白样品，经10％SDS‑PAGE电泳后，按照免疫印迹方法将胶内蛋白转移至PVDF膜上，用5％脱脂奶粉溶液4℃封闭过夜，次日分别加入Wnt3α、β‑catenin、Gsk‑3β、Dvl‑1、Cyclin D1及GADPH抗体室温孵育4h，TBST洗膜3次，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1h，TBST洗膜3次后即可按照ECL的方法依次加入发光底物、曝光、显影定影，并用Image软件分析条带。

[0082] 统计学分析方法

[0083] 应用SPSS 19.0进行统计学处理。数值用 表示。两两比较，符合正态性时采用Independent‑Samples T检验；多组间比较先进行方差齐和正态性比较，方差齐且符合正态性时采用LSD‑t或Dunnett‑t检验，不符合正态性时采用Nonparametric T检验，符合正态性但方差不齐时采用Dunnett’s T3或Tamhane’s T2检验。P≤0.05表示有统计学意义，P≤0.01表示所检验的差别有非常显著性意义。

[0084] Western blot检测结果显示(图4a、图4b)，鹰不扑总皂苷能较好的抑制15％FBS诱导的Wnt信号通路分子蛋白(Wnt3α、β‑catenin、Gsk‑3β、Dvl‑1、Cyclin D1)的高表达，特别是对β‑catenin、Cyclin D1、Gsk‑3β的高表达具有显著性的抑制作用。相同的结论在免疫组化实验中也得到证实，如图2c所示，鹰不扑总皂苷能抑制受损血管处β‑catenin、Gsk‑3β的表达水平，与模型组比较均具有显著性差异(p<0.05)。鹰不扑总皂苷抑制wnt3α/Dvl‑1/β‑catenin通路相关蛋白表达水平。

[0085] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。