[0001] 本申请涉及DNA数据存储技术领域，尤其是涉及核酸存储微流控芯片。

[0002] 随着当代信息技术的飞速发展，数据信息的含量呈指数级增长，这种增长趋势将很快超越现有存储介质的承受能力。为满足数据快速增长的存储需求，亟需寻找一种新的
数据存储介质。DNA作为一种新兴的数据信息载体，与传统电子信息存储相比，具有超高存储密度、超长存储时间、低能耗维护、环境友好等优势，这些优良特性使得DNA成为信息存储的理想选择并成为全球研究的热点。

[0003] Zielinski等人使用喷泉码实现鲁棒性和高效性的DNA数据存储，最多可将215PB的数据存储至1g DNA中，展示了DNA数据存储的美好蓝图。然而，DNA数据存储技术是一种合成生物学和信息技术等多学科深度交叉发展的新技术，仍然有许多难题需要攻克。例如，高昂的存储成本、较低的读写效率以及DNA数据的长期保存、访问、索引等功能的分散化、存储步骤复杂耗时使得DNA存储效率较低，难以得到广泛应用。近些年，随着编码技术的发展、DNA合成成本以及测序成本的降低，DNA数据存储的长期保存成为DNA数据存储的最为关键
的问题之一。DNA分子物理和化学的完整性决定了保存数字信息的完整性，因而发展有效的DNA数据保护方法对于DNA数据存储至关重要。

[0004] DNA分子本质还是生物分子，天然未受保护的DNA容易被水解、烷基化和氧化，造成DNA序列的损坏和存储信息的丢失。目前现有的保存方法包括水溶液、脱水、低温、稳定剂以及封装等。在这些保存技术中，将DNA封装在硅壳中被认为是最持久的保存方法，在温度为9.4℃的情况下，半衰期近2000年。然而，以这种方式保存DNA需要四天时间形成保护DNA的硅壳，并且在读取时需要通过剧毒的氢氟酸来溶解硅壳以释放DNA。因此，开发一种更快的用于DNA存储的微流控芯片对于加速DNA作为数据存储介质的工业应用至关重要。
实用新型内容

[0005] 本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种更快的用于DNA存储的核酸存储微流控芯片。

[0006] 本申请的第一方面，提供一种核酸存储微流控芯片，该核酸存储微流控芯片包括封装层生成部，封装层生成部用于对纳米球进行封装，纳米球的表面固定有至少一条核酸
片段，封装层生成部包括：

[0007] 封装入口，封装入口用于注入封装试剂和纳米球；

[0008] 封装流道，封装流道与封装入口相连通，用于供纳米球与封装试剂反应，从而在纳米球的表面形成封装层，得到已封装纳米球；

[0009] 封装出口，封装出口与封装流道相连通，用于输出已封装纳米球。

[0010] 根据本申请实施例的核酸存储微流控芯片，至少具有如下有益效果：

[0011] 本申请实施例所提供的核酸存储微流控芯片通过微流控的方法，将封装试剂与纳米球混合，从而在纳米球的表面形成封装层，完成快速封装。

[0012] 在本申请的一些实施方式中，封装流道为螺旋状。以螺旋状的流道作为反应通道可以提供有效的剪切力，使其中的封装试剂与纳米球的混合更为均匀，提高封装效果，从而让其中的核酸片段获得更高效的保护。

[0013] 在本申请的一些实施方式中，封装流道包括至少一个双向螺旋型流道。以双向螺旋型流道作为反应通道，反应过程中的横向剪切力更强，封装试剂与纳米球的混合更加彻
底，自组装形成的金属有机框架的封装层更加均匀。

[0014] 在本申请的一些实施方式中，封装流道包括多个相互连接的双向螺旋型流道。

[0015] 在本申请的一些实施方式中，核酸存储微流控芯片还包括封装层去除部，封装层去除部用于除去已封装纳米球的表面的封装层，封装层去除部包括：

[0016] 去封装入口，去封装入口用于注入去封装试剂和已封装纳米球；

[0017] 去封装流道，去封装流道与去封装入口相连通，用于供已封装纳米球与去封装试剂反应，从而移除已封装纳米球的表面的封装层，得到去封装纳米球；

[0018] 去封装出口，去封装出口与去封装流道相连通，用于输出去封装纳米球。

[0019] 在核酸存储微流控芯片中通过设置去封装部集成封装和去封装的两种功能，在芯片中能够快速生成纳米材料封装纳米球以达到持久的数据保护作用，而在需要获取数据
时，可同时在同一个芯片中快速去除封装层。

[0020] 在本申请的一些实施方式中，去封装流道为蛇形流道。

[0021] 在本申请的一些实施方式中，核酸存储微流控芯片还包括核酸提取部，核酸提取部用于从去封装纳米球上提取核酸片段，核酸提取部包括：

[0022] 提取入口，提取入口用于注入去封装纳米球和提取试剂；

[0023] 提取流道，提取流道与提取入口相连通，用于供去封装纳米球与提取试剂反应，使核酸片段由去封装纳米球上游离出来；

[0024] 提取出口，提取出口用于收集游离出的核酸片段。

[0025] 在核酸存储微流控芯片中通过进一步添加核酸提取部集成封装‑去封装‑提取三种功能，从而能够在同一微流控芯片中实现存储有核酸数据的纳米球的快速封装保护及快
速数据提取。

[0026] 在本申请的一些实施方式中，提取流道为螺旋状。

[0027] 在本申请的一些实施方式中，提取流道包括至少一个双向螺旋型流道。

[0028] 在本申请的一些实施方式中，提取流道包括多个相互连接的双向螺旋型流道。

[0029] 在本申请的一些实施方式中，封装流道、去封装流道、提取流道的宽度为1～2mm，高度为0.01～0.1mm。

[0030] 在本申请的一些实施方式中，封装入口、去封装入口、提取入口分别独立设置有多个注入口。

[0031] 本申请还涉及核酸的封装方法，该封装方法包括以下步骤：取有机配体、金属离子与表面固定有至少一条核酸片段的纳米球混合，有机配体和金属离子反应生产金属有机框架并在纳米球的表面形成封装层，得到已封装纳米球。

[0032] 根据本申请实施例的封装方法，至少具有如下有益效果：

[0033] 本申请以纳米球作为核酸片段的载体，通过有机配体、金属离子来进行金属有机框架的封装，在载体表面快速形成封装层，从而实现对封装于其中的核酸片段的保护，对于自由基、紫外线等具有良好的防护作用，整个封装过程耗时短、操作简单，并且在随后的去封装过程中无需使用剧毒物质对封装层进行处理，使得整个封装和去封装过程更加安全。

[0034] 该封装方法可以采用前述的核酸存储微流控芯片进行。

[0035] 其中，金属有机框架是指Metal Organic Frameworks(MOFs)，通常情况下是以金属离子为连接点、以有机配体为框架自组装形成的三维材料，其具有比表面积大、孔径大小可调、热稳定性和化学稳定性性能优异、生物相容性高等特点，在本申请实施例中通过有机配体和金属离子的原料在纳米球表面自组装形成金属有机框架的封装层(保护层)，从而在
保证其保存效果的同时大大压缩了生成保护层的时间。

[0036] 在本申请的一些实施方式中，金属离子为过渡金属离子，有机配体为咪唑类配体，金属有机框架为ZIFs。ZIFs(Zeolitic Imidazolate Frameworks)材料是一类由过渡金属与咪唑及其衍生物配位构成的一类具有铝硅酸盐沸石分子筛类似结构的MOFs。ZIFs具有优
异的晶体生长和成型特性，能够在室温、水相或有机相中快速合成。在本申请的实施例中优选使用这种ZIFs作为封装保护层以进一步简化反应条件、压缩反应时间。

[0037] 在本申请的一些实施方式中，过渡金属离子选自锌离子、钴离子中的至少一种。

[0038] 在本申请的一些实施方式中，咪唑类配体选自咪唑、2‑甲基咪唑、2‑乙基咪唑、2‑硝基咪唑、2‑甲酰咪唑、4,5‑二氯咪唑、苯并咪唑、5‑氯苯并咪唑中的至少一种。

[0039] ZIFs的微观结构进一步取决于咪唑类配体、过渡金属离子和反应过程中的溶剂，根据上述原料和条件的差异，ZIFs进一步包括但不限于ZIF‑2、ZIF‑3、ZIF‑4、ZIF‑8、ZIF‑
10、ZIF‑11、ZIF‑14、ZIF‑20、ZIF‑21、ZIF‑23、ZIF‑60、ZIF‑62、ZIF‑64、ZIF‑65、ZIF‑67、ZIF‑
69、ZIF‑70、ZIF‑71、ZIF‑73、ZIF‑74、ZIF‑90等。

[0040] 在本申请的一些实施方式中，咪唑类配体为2‑甲基咪唑，过渡金属离子为锌离子。以锌离子和2‑甲基咪唑形成的ZIF‑8是ZIFs材料中最具有代表性的一种。ZIF‑8在水和氢氧化钠水溶液中是稳定的，但在酸性条件下会很快分解，因此，在采用ZIF‑8作为封装层的情况下，可以通过改变已封装纳米球的pH条件从而实现快速的去封装。其它同样具有对酸性
环境敏感特征的ZIFs例如ZIF‑90、ZIF‑67等也可以同样作为ZIF‑8的替代使用。

[0041] 在本申请的一些实施方式中，咪唑类配体的浓度为1～500mM，过渡金属离子的浓度为1～100mM。

[0042] 在本申请的一些实施方式中，咪唑类配体的浓度为50～400mM，过渡金属离子的浓度为20～80mM。

[0043] 在本申请的一些实施方式中，咪唑类配体的浓度为100～200mM，过渡金属离子的浓度为30～50mM。

[0044] 有机配体、金属离子与纳米球混合反应形成封装层的方式可以采用任选的不影响其中固定的核酸片段性质的MOFs材料的合成方式，以ZIFs材料为例，包括溶剂热法、室温
法、电化学法、机械化学法、超声化学法、微波辅助法、微流控法等方式，而本申请实施例中，混合反应的方式优选利用微流控的方式控制其形成封装层的过程，例如可以通过控制反应
温度、各种原料的比例和流速等方式调节封装层的形貌、尺寸等，以获得更好的封装效果。

[0045] 在本申请的一些实施方式中，有机配体、金属离子和纳米球被分配于螺旋状的微流道中混合反应。通过螺旋状的微流道，为其中的有机配体、金属离子和纳米球提供相适应的剪切力，以提高在微流道中的混合效果，从而使得封装层能够更加均匀，对封装于其中的核酸片段的保护作用也就更好。

[0046] 在本申请的一些实施方式中，微流道为双向螺旋型。通过设置双向螺旋型的微流道，为其中的原料提供更强的横向剪切作用，使得内部的混合更强烈更均匀，因而封装效果和由此带来的保存效果也就更好。

[0047] 在本申请的一些实施方式中，核酸片段通过静电吸附、化学键合、生物素‑亲和素中任一种方式固定到纳米球。其中，化学键合的方式包括但不限于氨基与羧基成键、金属与巯基成键、氨基与醛基成键、金属与核酸形成的配位键等。

[0048] 在本申请的一些实施方式中，纳米球是指具有纳米尺度大小的微球，其优选为二氧化硅微球，例如单分散球形二氧化硅，其比表面积大、分散性好，并且具有良好的光学性能和稳定性。作为载体使用可以固定更多的核酸片段从而提高数据载量，而良好的分散性
可以保证在封装过程中金属有机框架在各个纳米球表面都能够自组装形成封装层，避免聚
集影响封装和保护效果。此外，通过对纳米球本身的粒径、荧光标记修饰等手段控制固定有不同核酸片段的纳米球的参数作为后续读取过程中的索引条件，从而进行定向读取。例如，对封装后的纳米球通过流式细胞仪分选，选择特定粒径、荧光标记的纳米球进行去封装和
数据读取，从而避免需要整库访问的缺陷。

[0049] 本申请还涉及按照上述的封装方法得到的已封装的纳米球。采用上述方法得到的已经封装过的纳米球可以为其中的核酸片段提供良好的保护，抵抗外界恶劣环境如紫外
线、自由基的侵害，保证核酸片段的完整性，也保护了数据信息的完整性，从而可以作为数据存储介质使用。

[0050] 在本申请的一些实施方式中，已封装纳米球包括纳米球和包裹在纳米球外围作为壳体的封装层，在封装层内、纳米球的表面还固定有至少一条核酸片段。

[0051] 在本申请的一些实施方式中，核酸片段以特定的编码方式存储有数据信息，例如通过直接转换、线性分组码、喷泉码、卷积码等方式进行存储。核酸片段可以是DNA或RNA，出于后续读取的便捷性以及可重复性考虑，核酸片段优选为双链DNA。

[0052] 本申请还涉及核酸的去封装方法，该去封装方法包括以下步骤：取去封装试剂与前述的已封装纳米球混合反应，去除封装层，得到去封装纳米球。

[0053] 利用金属有机框架材料的可降解特性，通过任选能够破坏其配位键的试剂进行去封装，从而将纳米球从封装层中释放出来，对其上固定的核酸片段进行进一步的处理。

[0054] 该去封装方法可以采用前述的核酸存储微流控芯片进行。

[0055] 在本申请的一些实施方式中，去封装试剂为酸性试剂。对于部分ZIFs材料，其在中性和碱性条件下具有较强的稳定性，但对酸性、例如微酸条件敏感，因此，可以通过与酸性试剂混合改变已封装纳米球表面的酸碱环境，达到快速去除封装层的目的。可以理解的是，酸性试剂应当不会对纳米球上固定的核酸片段造成破坏，避免存储数据信息的丢失或损坏；也不具备毒性、易燃易爆等危害可能。

[0056] 在本申请的一些实施方式中，酸性试剂为酸性缓冲液。由于ZIFs材料对酸性敏感，因而优选使用酸性缓冲液作为去封装试剂使用，在保证安全的情况下，避免除去封装层后大幅的pH变动影响核酸片段的稳定性。

[0057] 在本申请的一些实施方式中，酸性试剂为柠檬酸盐缓冲溶液，柠檬酸盐缓冲溶液的pH小于7。

[0058] 在本申请的一些实施方式中，柠檬酸盐缓冲溶液的pH为4～5。

[0059] 本申请的实施例还提供核酸的提取方法，该提取方法包括以下步骤：取提取试剂与前述的去封装纳米球混合反应，将核酸片段至少部分从去封装纳米球上游离出来，分离
即得。

[0060] 其中，提取试剂是指任选能够使去封装纳米球上的核酸片段变性，从而游离出至少部分的单链的试剂，例如NaOH、甲酰胺等，其中NaOH在大多数条件下都可以使DNA完全变性，是提取试剂的最有效选择。

[0061] 在上述方法中，通过封装层的去除和化学变性方法获得DNA单链，然后经PCR等方式扩增后进行高通量测序，测序后序列再经过解码即可获得数据信息，而作为母版的纳米
球上仅剩的单链可以通过聚合酶反应退火和延伸从而恢复原始数据，实现写入‑读取‑恢复的闭合DNA数据存储链，且可进行多次无损读取，避免了基于PCR方法整库访问带来的破坏。

[0062] 本申请还涉及前述的核酸存储微流控芯片在DNA数据存储、读取中的应用。

[0063] 本申请实施例中通过功能集成式的微流控芯片，利用封装、去封装和提取方法可在15min之内完成对DNA纳米球的保护层封装、保护层的去除及DNA数据的提取。经过实验验证，生成的封装层对于紫外线、自由基均有较好的保护作用，可保证DNA信息的完整复原。用该方法可快速对DNA数据存储进行有效的保存，且在需要提取信息时，可在同一芯片上快速完成DNA数据的提取。整个过程耗时短、操作简单、成本低且功能集成，大大增加了DNA信息存储的实用性。

[0064] 本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

[0071] 以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施
例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。

[0072] 下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

[0073] 在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

[0074] 本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

[0075] 参考图1，示出了本申请的实施例中核酸存储微流控芯片的结构，核酸存储微流控芯片1包括封装层生成部100，封装层生成部100包括封装入口110、封装流道120和封装出口
130，三者相互连通，由封装入口110注入封装试剂和纳米球，随后在压力作用下流经封装流道120进行充分混合，封装试剂中的原料在纳米球的表面自组装形成封装层，得到已封装纳米球，并最终由封装出口130排出。在其中一些具体的实施方式中，封装流道120为螺旋状，通过螺旋状流道赋予其中的流体更强的剪切力，从而使其中的封装试剂和纳米球可以混合
得更为均匀，这样，在纳米球表面形成的封装层的保护效果也就越好。在其中一些优选的实施方式中，封装流道120为双向螺旋型，这种双向螺旋型流道可以提供更强的横向剪切力以使其中的原料在自组装形成封装层时可以更为均匀完整，从而有效包裹纳米球。在其中一
些实施方式中，由于封装试剂包括多种，因此设置多个不同的注入口分别注入这些原料，例如，封装入口110包括三叉式的第一注入口111、第二注入口112、第三注入口113，将纳米球由第二注入口112注入到核酸存储微流控芯片1中，同时在第二注入口112和第三注入口113
注入不同的封装试剂原料，随后在封装流道120中充分混合。

[0076] 参考图1，在其中一些实施方式中，核酸存储微流控芯片1还包括封装层去除部200。封装层去除部200包括依次连通的去封装入口210、去封装流道220和去封装出口230，由封装层生成部100完成封装后得到的已封装纳米球由封装出口130后可以投入另外的封
装容器中保存或直接将封装出口130与去封装入口210相连接导入到封装层去除部200进行
去封装，或者经预先分选过的部分已封装纳米球重新注入去封装入口210移除其表面的封
装层进行数据读取。与封装层生成部100类似的，考虑到去封装试剂可能有不止一种，去封装入口210也可以设置多个不同的注入口分别注入不同的去封装试剂原料，例如去封装入
口210包括三叉式的第四注入口211、第五注入口212、第六注入口213。在其中一些具体的实施方式中，去封装流道220采用折返的蛇形流道，通过这种结构设置，在加长反应通道、保证封装层被完整移除的同时，大大节省芯片长度。

[0077] 参考图1，在其中一些实施方式中，核酸存储微流控芯片还包括核酸提取部300。核酸提取部300包括依次连通的提取入口310、提取流道320和提取出口330。完成去封装后的纳米球直接由提取入口310进入核酸提取部300，通过提取入口310注入的提取试剂使纳米
球表面的核酸片段变性从而游离出其中的至少一部分，进而从提取出口330回收核酸数据
及纳米球的混合液，通过离心等方式，取上清液即可完成核酸数据的提取。进一步将提取到的核酸数据进行测序，例如可以是NGS测序、纳米孔测序等方式完成对核酸片段数据的读
取。其中，二代测序所用模板通常是原始的核酸片段扩增后的产物，因此在本申请的实施例中还需要通过诸如PCR的方式对提取得到的核酸片段进行扩增。

[0078] 本申请实施例还涉及一种核酸的封装方法，该方法将有机配体、金属离子与纳米球混合反应，生成由金属有机框架构成的封装层，从而完成对纳米球的封装。该封装方法中涉及一种纳米球，该纳米球的表面固定有至少一条核酸片段。通过这种方式，在纳米球的表面形成金属有机框架的封装层，对固定在纳米球表面的核酸片段进行封装保护。

[0079] 本申请实施例还涉及一种核酸的去封装方法，该去封装方法将封装完成的纳米球与去封装试剂混合，发生反应从而移除纳米球表面的封装层，得到去封装纳米球。利用金属有机框架材料的可降解特性，对其配位键进行破坏，将纳米球从封装层中释放出来，因而可以对其上固定的核酸片段进行进一步的处理。

[0080] 本申请实施例还涉及一种核酸的提取方法，该提取方法将移除封装层后的纳米球与提取试剂反应，使纳米球上的核酸片段的至少部分从其上游离出来，完成提取。通过封装层的去除和化学变性方法获得DNA单链，然后经PCR等方式扩增后进行高通量测序，测序后
序列再经过解码即可获得数据信息，而作为母版的纳米球上仅剩的单链可以通过聚合酶反
应退火和延伸从而恢复原始数据，实现写入‑读取‑恢复的闭合DNA数据存储链，且可进行多次无损读取，避免了基于PCR方法整库访问带来的破坏。

[0081] 以下结合具体的实施例对本申请进行说明：

[0082] 实施例1

[0083] 本实施例提供一种核酸存储微流控芯片，该核酸存储微流控芯片1具有生成封装层、移除封装层及DNA数据获取的多功能集成。

[0084] 参考图1，核酸存储微流控芯片1包括封装层生成部100、封装层去除部200和核酸提取部300。封装层生成部100包括相互连通的封装入口110、封装流道120和封装出口130，封装入口110包括三个并联的三叉式的第一注入口111、第二注入口112、第三注入口113，封装流道120为两个相连的双向螺旋型流道，其中，双向螺旋型流道是指两个反向的螺旋型流道部分相连通，在其中一个螺旋型流道部分中顺时针方向流动而在另一个螺旋型流道部分
中逆时针方向流动。封装层去除部200包括去封装入口210、去封装流道220和去封装出口
230，去封装入口210包括三个并联的三叉式的第四注入口211、第五注入口212、第六注入口
213，去封装流道220为不断折返的蛇形流道结构。核酸提取部300包括相互连通的提取入口
310、提取流道320和提取出口330，提取入口310与去封装出口230直接连通，并设有两个相对的第七注入口311和第八注入口312，提取流道320的结构与封装流道120相同。

[0085] 该微流控芯片整体的长度H为92mm，宽度W为24mm，流道宽度d为1.2mm，流道高度为0.06mm。其中，封装层生成部100中的封装流道120的长度为103mm，其重复的双向螺旋型流道可以有效将反应试剂进行充分混匀，从而在纳米球的表面形成充分包裹的封装层，封装
后的纳米球通过封装出口130可以流出到另行设置的封存管中冻干保存以进行存储。当需
要对已封装纳米球中的核酸片段上的DNA数据进行访问读取时，关闭封装层生成部100中的
所有阀门(图中未示出)，加水溶液到封存管中涡旋混匀后，泵至封装层去除部200。封装层去除部200的去封装流道220的长度为62mm，其折返的蛇形结构设置在拉长反应流道的同
时，可以大大节省芯片整体长度。核酸提取部300的提取流道320的长度为99mm，结构与封装流道120相同，同样为双向螺旋型，以此能够充分保证纳米球表面的核酸片段与提取试剂充分反应，使其从纳米球表面脱离。在提取出口330回收游离出纳米球的核酸片段以及纳米球的混合液，通过离心等方式，完成提取。

[0086] 实施例2

[0087] 本实施例提供一种DNA的封装方法，分别利用实施例1所提供的核酸存储微流控芯片进行封装，与不使用该微流控芯片进行芯片外的封装。

[0088] 本实施例中涉及一种表面固定有至少一条核酸片段的纳米球，该纳米球的制备方法如下：

[0089] 1.将编码有数据信息的DNA单链通过引物(其中一条的5′端修饰有氨基)扩增为双链。

[0090] 通过如下引物对PCR扩增DNA oligos库(0.5ng/μL)：

[0091] CTTTCCCTACACGACGCTCT(SEQ ID No.1)；

[0092] TCTGCACACGAGAAGGCTAG(5′端氨基修饰)(SEQ ID No.2)；

[0093] PCR反应体系为：

[0094]

[0095] PCR反应程序如下：

[0096] (1)95℃，2min；

[0097] (2)95℃，30s；

[0098] (3)58℃，20s；

[0099] (4)72℃，15s；

[0100] 重复(2)‑(4)30次，扩增完毕。

[0101] 使用PureLink PCR kit(Invitrogen)纯化产物，获得氨基修饰的双链DNA。

[0102] 本实施例中的DNA oligos库包括3210条单链核苷酸，每条核苷酸长度为140nt，以下示例性地给出其中10条：

[0103] CTTTCCCTACACGACGCTCTAAGAAAGGGAAGGAAAGTCATTCGAACCGCTAACTTGACGAAGATTCAAAGACGGAGCCGGACAACCGCCACGCTTACCTCGGGTAAGGCATTCTCTGCCCTAGCCTTCTCGTGTGCAGA(SEQ 
ID No.3)；

[0104] CTTTCCCTACACGACGCTCTCCCAACCAATACCAAACCAAACCGGGCTGCCCGCCAGCGGATCTGAGATAGTTTCTTGCGCAAGATAGGCGGTACATATTGTGATACCTTCCTATAGAGTCTAGCCTTCTCGTGTGCAGA(SEQ 
ID No.4)；

[0105] CTTTCCCTACACGACGCTCTCCAACCAATACCTACCAGTTATAGCCAGTAAGGAGGGACGCTGGTTAAGTTACCATAGACATTAAATCGTTTAGGTAGGAGCACCGGCCTATCGTTGGTACTAGCCTTCTCGTGTGCAGA(SEQ 
ID No.5)；

[0106] CTTTCCCTACACGACGCTCTGGAAGGACGAGTGAGGTGGATCTTCGAGCTAACGACGGACCTGTTGGCACTGAACTACGTCATCCGTGACGAACTTGCCAGTGTGCGAACATGAGGCTTTCTAGCCTTCTCGTGTGCAGA(SEQ 
ID No.6)；

[0107] CTTTCCCTACACGACGCTCTGAAGGACGAGTTGGAGTGCCGTGTGACTGGAGAAGTCTATGTTCACAGAGTCTCTCCGATGAATAAAGTCGGCGCCGAACGGCGGGTGAAGAGACAGATCCTAGCCTTCTCGTGTGCAGA(SEQ 
ID No.7)；

[0108] CTTTCCCTACACGACGCTCTGGACGAGTTTAAAGAATACGTATGGATTGTGTAAAGTCATTTCTCGCAACGGTCCTAGATTGACCGCAGATCTACTGACGCCCTTGTACGGGACTGTGTACTAGCCTTCTCGTGTGCAGA(SEQ 
ID No.8)；

[0109] CTTTCCCTACACGACGCTCTAATACCTTGAAGTCACACCTCGTCCCACTTAAGAGCGAAATCCTTTATCGGAGATGACTTAGACGTCGCGGTACTAGGTTACGCGGCAGCGGGACATGATCTAGCCTTCTCGTGTGCAGA(SEQ 
ID No.9)；

[0110] CTTTCCCTACACGACGCTCTACGAGTTTAACCGGAGGATAACGTGGTGAGGGTCGTGAGTACCGAGTGACTTCATGTTAGTCTTAACCGGTTCTATTTCATCCGACGCGTTAAACACCTCCTAGCCTTCTCGTGTGCAGA(SEQ 
ID No.10)；

[0111] CTTTCCCTACACGACGCTCTCGAGTTTAACCGGAGACTTCGAGGCTCGACATTCGCCTCCCTCGGGTGATATCCACGTTCGCCCTAGTATTTAGCTTTGTGAATCGAACTTACTGCCGAGCTAGCCTTCTCGTGTGCAGA(SEQ 
ID No.11)；

[0112] CTTTCCCTACACGACGCTCTGAGTTTAACCGGTGCCTATAATAGAGAAGAGGAGTCATGCTGTAGGGTCGTACAATTTCGATCGACAATAGTCATTGTCGGGCTGCAGCACTCACAATGACTAGCCTTCTCGTGTGCAGA(SEQ 
ID No.12)。

[0113] 2.将步骤1得到的双链DNA偶联到羧基化二氧化硅微球表面，得到表面固定有至少一条核酸片段的纳米球。

[0114] 其中，羧基化二氧化硅微球购买于西安瑞禧生物科技有限公司，浓度25mg/mL，尺寸为500nm。

[0115] 偶联方法如下：

[0116] (1)取羧基化二氧化硅微球100μL到1.5mL的ep管中，8000g离心5min，移液枪小心移弃上清液；然后使用1mL活化缓冲液(醋酸钠溶液，10mM，pH5.4)重悬并离心洗涤1次
(8000g，5min)，移液枪小心移弃上清液；然后使用100μL活化缓冲液(醋酸钠溶液，10mM，pH5.4)重悬并充分涡旋10min；然后迅速加入50μL现配的EDC溶液(100mg/mL)和50μL现配的NHS溶液(50mg/mL)并涡旋混匀，室温下缓慢倾斜旋转孵育30min；孵育完毕，样品使用活化缓冲液离心洗涤三次(8000g,5min)，并重悬于100μL活化缓冲液中。

[0117] (2)将步骤1中扩增纯化好的氨基修饰的双链DNA(100μL活化缓冲液稀释至0.0069‑6.94μM)加入到活化完毕的二氧化硅球溶液中，室温下缓慢倾斜旋转孵育30min；孵育完毕，使用1×TE buffer(pH＝7.4)进行离心洗涤三次(8000g，5min)，最后重悬于100μL1×TE buffer(pH＝7.4)中‑20℃保存待用，得到表面固定有至少一条核酸片段的纳米球。

[0118] 芯片外的封装方法为：

[0119] (1)配制封装试剂Ⅰ(2‑甲基咪唑的水溶液，160mM)，并取250μL加入到装有纳米球的1.5mL离心管中涡旋混匀，称为混合液Ⅰ；

[0120] (2)配制封装试剂Ⅱ(无水醋酸锌的水溶液，40mM)，并取250μL通过气泵正压进样方式以30μL/min的速度泵入混合液Ⅰ中，泵入过程中，离心管维持涡旋。

[0121] 芯片内的封装方法为：

[0122] (1)配制封装试剂Ⅰ(2‑甲基咪唑的水溶液，160mM)，并取250μL加入到装有纳米球的1.5mL离心管中涡旋混匀，称为混合液Ⅰ；

[0123] (2)配制封装试剂Ⅱ(无水醋酸锌的水溶液，40mM)，并取250μL至1.5mL离心管中；

[0124] (3)通过气泵正压进样方式以30μL/min的速度将混合液Ⅰ由第二注入口112泵入到核酸存储微流控芯片1中，同时通过气泵正压进样方式以30μL/min的速度将封装试剂Ⅱ由
第一注入口111泵入到核酸存储微流控芯片1中。在封装出口130处流出已封装纳米球。

[0125] 按照上述两种方式进行封装得到的纳米球的形貌如图2所示，其中，A为采用芯片外封装方式得到的纳米球，B为采用实施例1的核酸存储微流控芯片进行封装得到的纳米
球，两相比较，在芯片内生成的封装层更为均一且，表面无独立成核的现象。这是由于在横向剪切作用下，芯片内双向螺旋型流道的混合更强烈更均匀，从而生成为均匀的封装层，显示出螺旋形结构流道、特别是双向螺旋型流道的芯片在合成封装层的独特优势。图2中的C
为采用该微流控芯片封装前后纳米球的颗粒直径，比较两者的直径，生成的封装层厚度约
为24nm。此外，利用实施例1的微流控芯片进行封装时，整个过程可在10min内完成。

[0126] 实施例3

[0127] 本实施例提供一种利用实施例1的核酸存储微流控芯片进行去封装和提取的方法，步骤如下：

[0128] (1)配制去封装试剂Ⅲ(柠檬酸盐缓冲液，pH 4.5)，并取100μL泵入第四注入口211中，同时由第五注入口212泵入按照实施例2中的芯片内的封装方法实施的已封装纳米球100μL，两者通过正压进样方式以相同的速度40μL/min泵入其中。

[0129] (2)取提取试剂(氢氧化钠，450mM)100μL，正压进样方式以速度40μL/min由第七注入口311泵入，在5min之内即可完成封装层的去除和DNA数据的提取。

[0130] 图3中A～C分别为纳米球封装前、封装后以及去除封装层后的电镜图，比较A和B，封装后的纳米球表面有一层均匀的ZIF‑8封装层；比较B和C，纳米球的表面封装层被去除
后，裸露出原有的硅球形貌。

[0131] 实施例4

[0132] 分别取按照实施例2中的芯片内封装方式封装后的纳米球使用紫外箱(同时开启紫外线A、紫外线B及紫外线C灯)进行照射0、2、4、8h，然后按照实施例3的方式去除封装层并提取DNA数据，使用实时荧光聚合酶链式反应(qPCR)对DNA浓度进行定量分析，结果显示，经过封装层ZIF‑8保护的DNA纳米球相对于初始浓度降低至约75％。同种紫外照射处理条件
下，裸露的DNA由于未经封装保护，DNA相对于初始浓度浓度下降至15％左右，已无法进行数字信息的复原，结果如图4的A所示。

[0133] 将上述的紫外线照射更换为铜催化的自由基溶液处理，qPCR结果显示，经过封装层ZIF‑8保护的DNA纳米球的DNA最终浓度相对于初始浓度降低至75％左右，而裸露的DNA浓度则降低至15％以下。

[0134] 综上结果，以ZIF‑8作为封装保护层，可以有效保护DNA在一定程度上抵御紫外线和自由基的损害。

[0135] 实施例5

[0136] 本实施例用于说明固定在纳米球表面的DNA数据如何进行无损访问。一般在直接对编码了数据的DNA进行封装保护后，在需要访问DNA数据时，需要对整体进行保护层解除，然后提取所有的DNA进行PCR扩增后测序以读取数据，多次的PCR扩增会导致PCR偏见的积
累，最终导致DNA数据信息不完整。SiO2

[0137] 为保证数据的完整性，本方案中，编码了数据的DNA单链，通过引物(其中一条引物5′端氨基修饰)扩增为DNA双链，并以酰胺键方式偶联至羧基化的二氧化硅纳米球表面，然后封装保护。当需要访问时，如图5中的A所示，通过芯片将封装层去除，通过化学变性的方法获得DNA单链，然后经PCR扩增后进行高通量测序，测序后的序列再经过解码后即可获得
数据信息。而在母版硅纳米球上仅剩的单链通过聚合酶反应退火和延伸得以恢复原始数
据，实现了写入‑读取‑恢复的闭合DNA数据存储链，而且可进行多次无损读取，避免了基于PCR方法整库访问带来的破坏。

[0138] 此外，表面羧基化的二氧化硅纳米球的粒径及内部荧光可作为选择性访问的参数，例如通过流式细胞仪进行分选出特定参数的纳米球后，再通过微流控芯片去除封装层
和数据提取，因此，可以利用纳米球作为固定基底，进行索引读取和数据的拷贝。

[0139] 基于以上原理，对实施例3中去除封装层和提取后的纳米球进行回收，并通过聚合酶反应恢复为双链，重新按照实施例2和3的芯片内封装‑去封装‑提取的方式进行访问，重复10次，提取DNA单链的qPCR定量曲线图如图5的B所示，从图中可以看出，10次访问提取的DNA单链的分子数基本一致，因此可以进行无损读取。

[0140] 实施例6

[0141] 本实施例提供一种核酸的封装方法，与实施例2中芯片内的封装方法的区别在于，封装试剂Ⅰ为50mM的2‑甲酰基咪唑溶液，封装试剂Ⅱ为10mM的硝酸锌溶液，形成ZIF‑90构成的封装层。

[0142] 实施例7

[0143] 本实施例提供一种核酸的封装方法，与实施例2中芯片内的封装方法的区别在于，封装试剂Ⅰ为500mM的2‑甲基咪唑溶液，封装试剂Ⅱ为100mM的硝酸钴溶液，形成ZIF‑67构成的封装层。

[0144] 实施例6和实施例7对DNA纳米球的封装效果与实施例2的芯片内封装方法类似，在此不再赘述。

[0145] 上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各
种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。