[0001] 本发明涉及半导体设备领域和生物技术领域，具体地，涉及一种微流控芯片。

[0002] 微流控技术(Microfluidics)是一种精确控制和操控微尺度流体的技术，可以把生化分析过程中的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。微流控技术具有样品消耗少、检测速度快、操作简便、多功能集成、体积小和便于携带等优点，在生物、化学、医学等领域有着应用巨大潜力。

[0003] 现有技术中，尚没有基于控制微液滴的微流控芯片，不能在一张芯片上实现液体的移动、混合和分离等操作。

[0044] 以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

[0045] 现有技术中，尚没有基于控制微液滴的微流控芯片，不能在一张芯片上实现液体的移动、混合和分离等操作。

[0046] 为解决上述技术问题，本发明实施例提供一种微流控芯片。

[0047] 文库制备是基因测序流程中的重要步骤，其目的为增加待检测DNA脱氧核糖核酸的浓度，为后续的测序工作做准备。基于数字微流控芯片的文库制备技术可以大大减少文库制备时间，减少试剂的使用量，并且可大大提升自动化水平，因此数字微流控芯片越来越多的应用到了文库制备过程。由于具有较大的成本优势，无源数字微流控芯片是目前商业化的数字微流控芯片产品中主流芯片方案。通过数字微流控芯片方法，文库制备时间可从普通的方法的2天缩减到8小时左右，使得文库制备时间大大缩短。

[0048] 高通量测序(High‑Throughput Sequencing)又名下一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)，是相对于传统的第一代测序(Sanger Sequencing)而言的。不同NGS测序仪厂家技术路线有所差异，但原理上都包括将DNA打断为小片段、分子固连、独立扩增、每次复制一个碱基(A，C，T，G)并检测信号，信息学分析等步骤。高通量测序以其高输出量与高解析度的特性，不仅为我们提供了丰富的遗传学信息，而且使得测序的费用和时间大大缩短。

[0049] 本发明实施例以通过微流控芯片建立DNA库，对DNA库进行测序的场景进行下文论述。

[0050] 如图1和图2所示，所述微流控芯片包括盖板1、控制层2和基板3，所述盖板1、所述控制层11和所述基板3依次叠放设置；

[0051] 所述盖板1包括进样口11、试剂进口12和微液滴取出口13；

[0052] 所述控制层2包括储液槽21，每条储液槽21包括第一区域211、第二区域212，所述第一区域211和所述第二区域212相通，样品微液滴通过所述进样口11流入所述第一区域211，试剂微液滴通过所述试剂进口12流入所述第二区域212，所述第二区域212与所述微液滴取出口13相通；

[0053] 所述基板3包括微液滴驱动模块，所述微液滴驱动模块包括驱动电极31，所述微液滴驱动模块通过改变所述驱动电极31与微液滴之间的电势，以驱动微液滴在所述储液槽21中流动。

[0054] 本发明实施例提供的微流控芯片，在控制层2中设置储液槽21，通过基板3中的微液滴驱动模块驱动微液滴在储液槽21中流动。同时微流控芯片的盖板1中设置进样口11，样品微液滴通过进样口11流入控制层2中的第一区域211，试剂微液滴通过试剂进口12流入控制层2中的第二区域212，微液滴驱动模块驱动试剂微液滴与从第一区域211流出的微液滴进行混合反应，第二区域212生成的微液滴从微液滴取出口13流出。基于电介润湿原理实现对微液滴操控，在一张芯片上实现液体的移动、混合和分离等操作，样本消耗少，速度快，人工操作少，成本低。在胚胎干细胞研究、肿瘤异质性分析、临床诊断等领域，具有广泛的应用场景和技术、经济价值。

[0055] 在一些实施例中，如图2所示，微流控芯片的基板3中还包括玻璃基底32。玻璃基地32，尺寸为105毫米*65毫米，使用半导体工艺在玻璃基底32沉积并刻蚀，形成金属膜层，作为驱动电极31，驱动电极31包括第一区域电极，第二区域电极，第一检测区域电极和第二检测区域电极。盖板1为单层ITO材质，在盖板1特定位置激光加工锥形通孔作为进样口11、试剂进口12和微液滴取出口13，进样口11、试剂进口12和微液滴取出口13的锥度均为45°。盖板1和基板2之间通过PS材质生物兼容性膜以三明治结构实现永久键合，构成完整微流控芯片。盖板1还包括盖板玻璃顶层14、导电层15和亲水层16。

[0056] 介电润湿原理(Electrowetting on Dielectric，EWOD)，通过改变驱动电极与微液滴之间的电势驱动液滴沿特定方向移动。通过电压时序变化，操控离散的微液滴流动，代替传统移液枪的抽吸、分液、纯化等工作。该技术采用电学手段驱动纳升级液滴，移液精度误差小于3％，具有功能稳定，外设要求低，试剂消耗少，无交叉污染，系统集成性好，操作简便，成本低等特点，具有广泛的应用前景。

[0057] 本发明实施例中，上位机控制的操作系统将电压时序信号经FPC(柔性电路板)传递到驱动电极31上，实现基于介电润湿原理的控制微液滴在储液槽21移动的操作。例如，由储液槽21的进样口11处加入样品液滴，依靠信号时序生成占一个电极的包含多个细胞的样品微液滴，驱动样品微液滴在储液槽21中流动。

[0058] 作为本实施例中的一种可选实施方案，如图1所示，所述试剂进口12包括第一试剂进口121、第二试剂进口122和第三试剂进口123，所述第二区域212包括第一子区域2121、第二子区域2122和第三子区域2123，所述第一子区域2121与所述第二子区域2122相通，所述第二子区域2122与所述第三子区域2123相通，所述第一子区域2121与所述第一区域211相通，所述第三子区域2123与所述微液滴取出口13相通，所述第一试剂进口123与所述第一子区域2121相通，所述第二试剂进口122与所述第二子区域2122相通，所述第三试剂进口123与所述第三子区域2123相通。

[0059] 其中，第一试剂进口121为裂解微液滴进口，第二试剂进口122为缓冲液微液滴进口，第三试剂进口123为DNA扩增微液滴进口。试剂微液滴包括裂解微液滴、缓冲液微液滴和DNA扩增微液滴。裂解微液滴从第一试剂进口121流入第一子区域2121。缓冲液微液滴从第二试剂进口122流入第二子区域2122。DNA扩增微液滴从第三试剂进口123流入第三子区域2123。

[0060] 作为本实施例中的一种可选实施方案，所述第一区域211包括过滤结构2111，所述过滤结构2111用于滤掉所述样品微液滴中的不符合预设尺寸的物质。

[0061] 在一些实施例中，所述物质为细胞。过滤结构2111拦截所述样品微液滴中的细胞团体，并过滤掉所述样品微液滴中的不符合预设尺寸的细胞。样品微液滴通过过滤结构2111生成包含单细胞的微液滴。

[0062] 作为本实施例中的一种可选实施方案，所述过滤结构2111包括多个朝向盖板的微柱，相邻两个微柱之间存在间隔。

[0063] 作为本实施例中的一种可选实施方案，多个所述微柱排列为多列，所述微柱的列方向与所述第一区域和所述第二区域之间的连线方向相交，对于相邻两列微柱，前一列微柱中的间隔与后一列微柱中的微柱相对。也就是说，相邻两列微柱交错排列。如图3至图5所示，所述过滤结构2111包括第一过滤结构21111、第二过滤结构21112。第一过滤结构21111、第二过滤结构21112均为相邻两列微柱交错排列的过滤结构。

[0064] 第一过滤结构21111的作用为拦截样本微液滴内的物质。优选地，第一过滤结构21111的作用为拦截样本微液滴(即细胞源液)内的细胞团块，防止阻塞，造成筛选失效。

[0065] 第二过滤结构21112的作用为滤掉样品微液滴中的不符合预设尺寸的物质。优选地，第二过滤结构21112的作用为实现震荡和打散，保证通过该结构后的细胞呈独立悬浮状态；根据测序目标细胞的不同，通过调整微柱间距，优化待捕获的细胞体积范围，有助于后续结构的细胞捕获。

[0066] 如图3和图6所示，所述过滤结构2111还包括第三过滤结构21113和第四过滤结构21114。第一过滤结构21111、第二过滤结构21112、第三过滤结构21113和第四过滤结构
21114依次在第一区域211中顺序排列设置。

[0067] 第三过滤结构21113的作用为滤掉样品微液滴中的不符合预设尺寸的物质。优选地，第三过滤结构21113为类“凹”字型阵列，即翅型结构；由于尺度效应第三过滤结构21113仅能容纳一个细胞，其余细胞则随流体带走，留在微液滴内进入废液区；流出该第三过滤结构21113的是单细胞，完成单细胞捕获。

[0068] 第四过滤结构21114的作用实现细胞汇流，辅助第三过滤结构21113滤掉样品微液滴中的不符合预设尺寸的物质。优选地，第四过滤结构21114的作用为辅助第三过滤结构21113进行单细胞捕获。

[0069] 在一些实施例中，也可以通过设置第三过滤结构21113的尺寸，使得第三过滤结构21113能容纳多个细胞，实现多个细胞的捕获。

[0070] 在一些实施例中，相邻两个微柱之间的间隔为10微米至100微米。

[0071] 在一些实施例中，所述微柱的高度为50微米至250微米。

[0072] 例如，如图3和图4所示，第一过滤结构21111为两层包含圆柱的阵列，圆柱直径300微米、相邻两个圆柱的间距为100微米，圆柱高度250微米(与微流控盒厚一致)。第一过滤结构21111可以拦截细胞团体，流出该第一过滤结构21111的为单个细胞。

[0073] 例如，如图3和图5所示，第二过滤结构21112为三层包含圆柱的阵列，圆柱直径50‑100um，相邻两个圆柱的间距为15‑35微米，圆柱高度为250微米。第二过滤结构21112的圆柱之间间隔较小，圆柱直径也较小，可以过滤掉体积太大或太小的细胞，流出该第二过滤结构
21112的细胞为尺寸均匀的细胞。

[0074] 例如，如图6所示，第三过滤结构21113为两层包含圆柱的阵列，类“凹”字型，两层圆柱高度分别为200微米和50微米，相邻两个圆柱的间距为10微米。流出第三过滤结构21113的细胞为单细胞。

[0075] 例如，如图3和图6所示，第四过滤结构21114为两层包括长方体的阵列，长方体的长和宽分别为为200微米*400微米，长方体的高度为250微米，长方体与第三过滤结构21113的角度为45°。

[0076] 本发明实施例中，通过设置不同间距的微柱和不同尺寸的微柱，滤掉样品微液滴中的不符合预设尺寸的物质。在物质为细胞时，如图3所示，微液滴按照图3中的箭头方向流动，图3‑图6中的一个椭圆中包括一个小黑点的结构为细胞。通过第一过滤结构21111将成块的细胞团体打散，并通过第二过滤结构21112、第三过滤结构21113和第四过滤结构21114过滤掉不满足预设尺寸的细胞，捕获单细胞。

[0077] 下面结合附图3‑图7，详细论述第二区域212中进行的裂解过程、纯化过程和DNA扩增过程。

[0078] 在一些实施例中，如图3所示，第一子区域2121即为第三过滤结构21113。裂解微液滴从第一试剂进口121流入第三过滤结构21113。单一液滴的裂解微液滴在第一试剂进口121的储液槽处生成(由储液槽21的第一试剂进口121处加入裂解液滴，依靠信号时序生成占一个电极的裂解微液滴)，由控制时序将裂解微液滴移动至第一子区域2121，震荡混匀实现将包括单细胞的微液滴裂解为核酸微液滴。单细胞捕获的效果可在显微镜下观察，确认单细胞捕获成功后，将裂解微液滴驱动到第一子区域2121。图3中的阴影区域为微液滴。

[0079] 在一些实施例中，缓冲液微液滴包括Buffer(缓冲)，Stop solution(停止溶液)，PBS(phosphate buffer saline，磷酸缓冲盐溶液)微液滴等。

[0080] 纯化，即由多种物质的聚集体，通过物理、化学或生物方面的方法作用，变成一类或一种物质的过程。

[0081] 本发明实施例中，单一液滴的缓冲液微液滴在第二试剂进口122的储液槽处生成(由储液槽21的第二试剂进口122处加入缓冲液滴，依靠信号时序生成占一个电极的缓冲液微液滴)，由控制时序将缓冲液微液滴移动至第二子区域2122，缓冲液微液滴与核酸液滴混合，进行纯化，生成纯化后的微液滴。如图1所示，第二试剂进口122有多个，实现多次反复清洗。

[0082] 在一些实施例中，样品微液滴、核酸微液滴等储液槽21上流动的微液滴的体积都为0.8微升。作为本实施例中的一种可选实施方案，如图7所示，所述第三子区域2123包括第一温度区21231和第二温度区21232，所述第一温度区21231与所述第二温度区21232相通，所述第一温度区21231与所述第二子区域2122相通，所述第二温度区21231与所述微液滴取出口13相通，所述微液滴驱动模块能够驱动流经所述第三子区域2123的微液滴在所述第一温度区21231与所述第二温度区21232之间循环流动。

[0083] DNA扩增，是指某一个特定基因的拷贝数选择性地增加而其它基因的拷贝数并未按比例增加的过程。

[0084] 本发明实施例中，经顺序处理后的纯化后的微液滴包含待建库DNA，与DNA扩增微液滴混合后进行PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)热循环扩增。单一液滴的DNA扩增微液滴在第三试剂进口122的储液槽处生成(由储液槽21的第三试剂进口123处加入DNA扩增液滴，依靠信号时序生成占一个电极的DNA扩增微液滴)。外置的温控模块由陶瓷加热片给铝块加热，并经热电偶实现闭环温度控制。铝块与微流控芯片的基板3紧密贴合，并经过温度定标后实现外置模块加热功能。纯化后的微液滴通过时序控制在两个不同温度的区域，即第一温度区21231和第二温度区21232(例如，第一温度区21231的温度为98℃，第二温度区21232的温度为62℃)之间进行停留和往复移动。如图7所示，微液滴沿箭头方向进行流动，图7中的圆圈阴影区域为微液滴。DNA扩增后的微液滴进入第一检测区域213。

[0085] 需要说明的是，在第一温度区21231和第二温度区21232循环的次数不作限定，例如30次。

[0086] 需要说明的是，微流控芯片在使用状态下，微流控芯片与外置的温控模块连接时，第一温度区21231和第二温度区21232的温度不同。微流控芯片未在使用状态下第一温度区21231和第二温度区21232的温度相同。

[0087] 需要说明的是，DNA扩增微液滴包括MDA(multiple  displacement amplification，多重置换扩增)微液滴。

[0088] 本发明实施例中，在控制层2中设置储液槽21，通过基板3中的微液滴驱动模块驱动微液滴在储液槽21中流动。同时微流控芯片的盖板1中设置进样口11，样品微液滴通过进样口11流入控制层2中的第一区域211，裂解微液滴通过第一试剂进口121流入第一子区域2121，微液滴驱动模块驱动样品微液滴与裂解微液滴混合，生成核酸微液滴。缓冲液微液滴通过第二试剂进口122流入第二子区域2122，微液滴驱动模块驱动缓冲液微液滴与核酸微液滴混合，生成纯化后的微液滴。DNA扩增微液滴通过第三试剂进口123流入第三子区域
2123，微液滴驱动模块驱动DNA扩增微液滴与纯化后的微液滴混合，生成扩增后的DNA微液滴。微液滴驱动模块驱动DNA扩增后的微液滴流到微液滴取出口13，完成DNA建库，可以对生成的DNA库进行测序。

[0089] 需要说明的是，一条储液槽21生成一个DNA库，如图1所示，图1中的微流控芯片中包括5个储液槽21，可以生成5个DNA库。

[0090] 作为本实施例中的一种可选实施方案，所述储液槽21还包括相通的第一检测区域213和第二检测区域214，所述第一检测区域213与所述第二温度区21232相通。

[0091] 在一些实施例中，所述第一检测区域213包括透光孔，所述透光孔能够将所述第一检测区域中的光引导至所述微流控芯片外部的外置光学模组，所述微液滴驱动模块在接收到所述外置光学模组发送的信号之后，驱动流经所述第一检测区域的微液滴流到所述微液滴取出口。

[0092] 第一检测区域213中包括电极2131。优选地，电极2131为回字型。

[0093] 流经第一检测区域213的微液滴中的DNA包括荧光物质，由外置光学模组发出特定波长的激发光，激发微液滴中的荧光物质，并收集通过第一检测区域213中的透光孔的发射光，实现DNA浓度检测。外置光学模组由荧光激发模块和PMT(photomultiplier tube，光电倍增管)二极管模块组成，在确定第一检测区域213中的DNA浓度满足第一预设范围时，向微液滴驱动模块发送信号。

[0094] 在一些实施例中，所述第二检测区域214包括毛细管泳道，所述毛细管泳道的入口和出口均与所述第一检测区域213相通；所述微液滴驱动模块在接收到外置的分析模组发送的信号之后，驱动流经所述第二检测区域214的微液滴流到所述微液滴取出口13。

[0095] 电泳，在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可是实现分离。

[0096] 毛细管电泳分析，采用内径极小的毛细管进行电泳，电压高达数千伏。毛细管电泳分析的仪器简单、易自动化，分析速度快、分离效率快，操作简单、消耗少，应用范围广泛。

[0097] 本发明实施例中，第二检测区域214施加直流高压电压电源，驱动微液滴在刻蚀的毛细管泳道内运动，流经第二检测区域214的微液滴中的DNA在毛细管泳道中被分离成DNA片段，通过外部的分析模组实现DNA片段分析。最终经DNA浓度检测及DNA片段分析后，DNA浓度满足第一预设范围和/或DNA片段满足第二预设条件的包括DNA的微液滴经微液滴取出口13取出，进行后续的测序分析。

[0098] 需要说明的是，进行毛细管电泳分析的方法有多种，此处不作限定，都是外置的分析模组对DNA片段进行分析，确定哪些DNA片段满足第二预设条件。在外置的分析模组确定出第二检测区域214中的DNA片段满足第二预设范围时，向微液滴驱动模块发送信号。

[0099] 作为本实施例中的一种可选实施方案，所述微液滴驱动模块还包括介质层33和疏水层34，所述疏水层34、所述介质层33和所述驱动电极31依次叠放设置，所述介质层33隔绝所述疏水层34和所述驱动电极31，所述疏水层34位于所述微流控芯片的内部，所述微液滴驱动模块通过给所述驱动电极31加压改变所述疏水层34的亲疏水性，以改变所述驱动电极31与微液滴之间的电势。

[0100] 给介质层33下方的电极施加电压，改变上表面疏水层34的亲疏水特性，进而改变微液滴接触角。微液滴接触角的变化促使其内部产生压力差，驱动微液滴沿特定方向移动。

[0101] 本发明实施例中，利用介电润湿原理实现微液滴操控，并结合过滤结构进行细胞分选捕获，在一张微流控芯片内实现了单细胞捕获、裂解、纯化、DNA扩增、DNA浓度检测及DNA片段分析等全流程分析。单细胞捕获主要通过形状过滤法，通过设置不同间距的微柱和不同尺寸的微柱，将成块的细胞团体打散，过滤掉不满足预设尺寸的细胞，并设置只能容纳一个细胞的过滤结构，捕获单细胞。样品微液滴依次通过第一区域(实现单细胞捕获)、第二区域(单细胞裂解为核酸，核酸纯化、DNA扩增)、第一检测区域(DNA浓度检测)以及第二检测区域(DNA片段分析)。相比传统的大样本量建库并进行NGS的测序手段，单细胞测序将单一细胞分离后进行建库测序，能够实现更准确的细胞样本异质性分析。在胚胎干细胞研究、肿瘤异质性分析、临床诊断等领域，具有广泛的应用场景和技术、经济价值。

[0102] 除非另外定义，本发明实施例公开使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本发明实施例中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语一直出该词前面的元件或误检涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。“相通”或者“相连”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的相通，而是可以包括电性的相通，不管是直接的还是间接的。
“上”、“下”、“左”、“右”等仅用于表示相对位置关系，当被描述的对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也可能相应地改变。

[0103] 可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。