[0001] 本申请涉及医疗器械领域，尤其涉及一种用于富集和分离循环肿瘤细胞的微流控装置。

[0002] 循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells)简称CTCs，是由原发肿瘤组织脱落进入血液循环系统的肿瘤细胞，是肿瘤经由血液循环系统发生转移的核心途径。随着对肿瘤的深入研究和治疗水平的提高，CTCs作为关键的肿瘤诊断标志物和病理分析的重要介质，具有重要的学术价值和临床医疗前景。

[0003] 循环肿瘤细胞的特点是数量稀少(在近10亿血细胞中只有数十个)，其分离与富集极具挑战性。目前用于分离CTCs主要有物理过滤，流控芯片黏附，密度梯度分离，电场分离和流体力学分离等方式。其中，基于微流控芯片的流体力学分离是目前的主要方法。

[0004] 目前的弯曲微流道分离法是基于传统的微流控芯片工艺，制作高度约50微米，宽度约100微米的弯曲流道，依据多相流体力学原理，微小弯曲管中随流体流动的颗粒在一定的流速下，在流体粘性拖曳力、惯性升力、趋壁力等的共同作用下，依据尺寸大小在管壁附近聚集的原理，分离比红细胞、白细胞和血小板尺寸大的CTCs。

[0005] 当前的弯曲流道微流控芯片制作基于昂贵的硅板超净光刻技术，并且只能制作矩形的管道。矩形流道内二次流动受边界非轴对称性影响，分离效果对血液粘性和流量敏感，对患者血样采用同一分离程序容易造成误判；在相同的流动驱动压力下，矩形流道的有效面积小于横截面周长相同的圆形流道，受壁面边界的影响易于在四个角形成缓慢的流动缓滞区(流动边界)，流动边界层分布不均匀因而易于产生血液凝固。

[0006] 因此，当前的矩形弯曲流道微流控芯片CTCs富集技术需要对患者的血样进行前处理，将红细胞采用物理化学方法裂解。这带来两个问题：

[0007] 1)首先，这种方法无法处理全血，失去了将红细胞和适量的白细胞、血小板回输给患者的可能性很小；

[0008] 2)在红细胞裂解的过程中还可能对CTCs的细胞膜产生影响，造成CTCs细胞膜的变性和CTCs丢失。尽管此方法能获得带有生物活性的CTCs，对细胞膜的物理化学处理仍然存在影响细胞基因变化的可能性。

[0044] 以下基于实施例对本申请进行描述，但是本申请并不仅仅限于这些实施例。在下文对本申请的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本申请。为了避免混淆本申请的实质，公知的方法、过程、流程和元件并没有详细叙述。

[0045] 此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的附图都是为了说明的目的，并且附图不一定是按比例绘制的。

[0046] 1.PDMS微管的制备

[0047] 参照附图1，对穿过PDMS池的金属导线通电，导线产生的热量使得导线邻近区域的PDMS从液态转变为固态。然后将导线从PDMS容器池中抽出，已在金属线周围固化的PDMS将随导线一起被抽出PDMS容器池，附在金属导线上的PDMS经过导线移动上方的加热线圈，进一步受热固化。受PDMS粘性和表面张力的影响，附着在金属线的PDMS外将形成以金属线直径为内径的PDMS管状结构，然后将金属线从固化的PDMS中抽出，形成PDMS微管。

[0048] 2.PDMS微管端口扩张部的制备

[0049] 参照附图2，利用毛细玻璃吸管，通过拉针器和锻针仪制作成前端可细达2微米的PDMS接头模具如图2A。将毛细微针插入PDMS微管如图2B，在模具的辅助下浇筑PDMS并固化，然后抽出毛细微针，形成渐扩的管道如图2C。PDMS微管两端分别以此方法处理，形成如图2D所示的两端能与常用商业设备相接的内径较大的器件。

[0050] 3.直管分离装置

[0051] 如图4所示，在直径100微米的PDMS微管两端，采用毛细微管建立光滑渐扩流道作为装置进口和出口，将全血从入口处采用柱塞泵泵入，在出口处以45度增加上下两个通道，收集红细胞以及白细胞和CTCs。

[0052] 以分离装置为核心，采用普通实验室用商业柱塞泵作为流体动力来源，显微镜和高速摄像仪作为观测和实验结果记录设备，离心管收集分离后细胞。

[0053] 正常生理条件下，全血的血细胞体积比在45％左右。在本分离芯片中，维持管道中血流的红细胞体积比在24％以上时，从全血中分离CTCs效果已经非常明显。红细胞体积比越大，CTCs、白细胞等近壁效应越明显。

[0054] 如图5所示，在本发明中，采用内径为100微米的PDMS微管构成的直管分离器，管内流量达到100微升每分钟时即可形成连续分离，并可实现长时相分离并不产生凝血现象。随着流量的增大，分离效率更高凝血可能性更低。

[0055] 考虑到白细胞、CTCs等在圆形截面管中沿轴线360度分布，我们还设计了往复分离系统，如图8所示。每次分离出口处大直径细胞在血流中的比例都会大幅度提高，这部分血流被重新抽吸到分离芯片中，经过几轮循环，能够实现血液和CTCs的完全分离。

[0056] 相比于传统的采用超净光刻技术制作的矩形微流控芯片通道，采用圆形通道从全血中分离细胞技术简单直接，制造成本大大降低，而且血流环境与人体相当，不易形成凝血。全血分离后的血细胞和血清还可以直接或者经过进一步处理后，返回给患者。

[0057] 4.三维螺旋分离装置分离富集聚乙烯颗粒

[0058] 本实施例采用三维立体螺旋分离装置将25微米的聚乙烯球形颗粒从海量的6微米颗粒中的分离富集。

[0059] 此应用实例以从人体血液红细胞中分离白细胞和循环肿瘤细胞为应用参照，实例中大直径颗粒的数目极少，6微米和25微米两种颗粒的数密度比约为3000：1，与人体血液中红细胞和白细胞的比例相当。两种颗粒的直径比也与红细胞和循环肿瘤细胞的比例大体相当。

[0060] 采用内径为75微米的PDMS微管，长度大于10厘米，采用毛细玻璃微管制作PDMS微管与常用商业实验室设备的接头，并将PDMS微管部分围绕直径约为3毫米的立柱形成3维螺旋结构，出口处以45度增加上下两个通道，如图6所示。

[0061] 如图7所示，在分离前25微米颗粒均匀分布在数密度为3000倍的6微米颗粒中。分离后，25微米颗粒仅位于螺旋弯道内圈附近的出口近壁区，而6微米的颗粒在每一个出口都散布存在。

[0062] 为了进一步提高分离后目标颗粒的纯度，我们设计了能够对富集目标颗粒的混合液往复富集的系统如图8所示。初次分离的某处出口汇集了目标颗粒，但可能还混杂其他颗粒，此时，采用两个单向过滤阀，一次分离结束后，采用柱塞泵复吸初步富集的混合液，再推进分离芯片中进行再次分离。如此往复多次，达到彻底分离的目的。

[0063] 实验证明，采用内径75微米的PDMS微管三维螺旋分离装置，能够在200微升每分钟至1000微升每分钟的流量范围内从海量的小尺寸6微米颗粒中分离25微米颗粒。分离精度和分离能力均远远高于现有的微流控芯片。

[0064] 5.三维螺旋分离装置分离富集上皮MDCK细胞

[0065] 本实施例采用三维立体螺旋分离装置将直径约为12～16微米的上皮MDCK细胞进行分离富集。

[0066] 采用内径为75微米的PDMS微管，长度大于10厘米，采用毛细玻璃微管制作PDMS微管与常用商业实验室设备的接头，并将PDMS微管部分围绕直径约为3毫米的立柱形成3维螺旋结构，出口处以45度增加上下两个通道。如图6所示。

[0067] 采用同样的分离系统，在流量为600微升每分钟至1000微升每分钟的流量范围内对直径约为18微米的上皮MDCK细胞进行了富集。

[0068] 如图9所示，细胞富集后处于弯曲管道内侧。

[0069] 上述实例显示本发明的微流控装置，尤其是采用了三维螺旋结构微流控装置具有优异的分离效果，并且很小的体积。

[0070] 以上所述仅为本申请的优选实施例，并不用于限制本申请，对于本领域技术人员而言，本申请可以有各种改动和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。