本发明涉及一种新型的哺乳动物钙蛋白酶CAPN11，其合成方法及其应用。 钙蛋白酶是相关蛋白质的超家族，据证实其中的一些起钙依赖的半胱氨酸蛋 白酶的作用。在哺乳动物中鉴定出了八种不同的钙蛋白酶。 钙蛋白酶构成胞内钙依赖性半胱氨酸蛋白酶的一个家族。人们鉴定出的哺乳 动物钙蛋白酶同系物的数量不断增加，而且各成员可根据物理结构和推测的性质 分成四类。A类，“经典的钙蛋白酶”CAPN1，CAPN2，CAPN3(p-94)；CAPN8 (nCL-2)和CAPN9(nCL-4)大约全部皆是具有蛋白酶活性和Ca2+依赖性的。它们 由一大小可变的(80kDa)和一不变化的小亚基(30kDa)组成。B和D类的钙蛋 白酶，CAPN5(6，15)和CAPN7(8)具有蛋白酶活性，但是很可能是Ca2+非依赖 性的，C类的钙蛋白酶，CAPN6，可能不具有蛋白酶活性。钙蛋白酶可根据其表达 模式分类，其中CAPN3，CAPN6，CAPN8和CAPN9具有一些组织特异性。钙蛋白 酶的功能还不清楚，虽然它们与很多生理过程和病理状态有关(文献17中的综 论)。为了弄清它们的功能和进化历程，必须鉴定钙蛋白酶家族成员的总谱。 本发明涉及新型的多肽CAPN11，在SEQ.ID.No.2中公开了其氨基酸序列。 该新的钙蛋白酶CAPN11具有典型的钙蛋白酶特性，包括潜在的蛋白酶和钙 结合域。它具有较强局限性的组织分布并主要在睾丸中表达。籍助放射杂交作图 (strahlungs-Hybrid-Kartierung)，已将该基因定位在染色体6上指定为p12 的区域中。系统发生分析表明，哺乳动物中的CAPN11与CAPN1和CAPN2最密切 相关。 然而，推测的CAPN11序列在可获得的钙蛋白酶序列中与鸡钙蛋白酶μ/m具 有最大同源性。因此，CAPN11可能是μ/m钙蛋白酶的人体直向进化同源物 (orthologon)。此新型钙蛋白酶的发现着重说明了钙蛋白酶家族的复杂性，其 成员可根据蛋白酶活性，钙依赖性及组织表达加以区分。 CAPN11基因的cDNA核苷酸序列含有2338个核苷酸(SEQ.-ID.-No.1)。 cDNA序列源于单一mRNA，借助侧翼引物由人体睾丸cDNA成功扩增整个推断编码 区而获得的。对多个cDNA克隆进行了完全测序，以便排除任何PCR假象。 其中有一个大的开放阅读框，编码具有702个氨基酸的蛋白质(Mr80kDa) (图1)。氨基酸序列与钙蛋白酶家族成员的大亚基相似(图1)。该蛋白质可分 成四个钙蛋白酶典型性的结构域。结构域II具有蛋白酶结构域的特性，其推测的 氨基酸序列具有作为半胱氨酸蛋白酶活性位点部分的三个氨基酸基团 (Cys102，His259和Asn283)(2)。对CAPN2报导的所有五个Ca2+结合序列(4， 12)的氨基酸序列在一定程度上保守(图1)。因此，这种蛋白质可能具有蛋白 酶特性和钙结合特性。推测的氨基酸序列与全部其它的钙蛋白酶相比表明，它与 小鸡钙蛋白酶μ/m具有最大的序列同源性(57.5％)。在哺乳动物钙蛋白酶中， 与人体CAPN1具有最大相似性(54.3％同源性)。具有最小相似性的人体钙蛋白 酶是CAPN6，其同源性只有18.7％。对应于此cDNA的基因被人类基因命名委员会 称为CAPN11。 对全部被鉴定的人体钙蛋白酶的完整氨基酸序列进行了系统发生分析。其结 果可将人体钙蛋白酶分成四个主要进化组(图2)。第一组的代表为CAPN5，CAPN6， CAPN7和CAPN8，第二组的代表为CAPN1和CAPN2，第三组的代表为CAPN3和 CAPN9，而第四组包括CAPN11。因此，系统发生分析暗示CAPN11可能代表另外 的钙蛋白酶亚家族。 通过Northern和RNA斑点印迹分析对人体组织中CAPN11的表达进行了研 究。在50种被研究的组织RNA中，CAPN11 mRNA在睾丸中表达最强(图3A)。 这种信号的特异性已被Northern印迹分析证实，其对应于大约3kb大的mRNA(图 3D)。在胸腺和乳腺中测出了弱得多的信号。但是这个发现的意义并未弄清，因 为在通过Northern印迹分析对胸腺RNA进行的进一步研究中，虽然曝光时间较 长仍未给出任何信号(图3D，数据未给出)。一种可能的解释是，这种弱信号归 咎于与相关mRNA的交叉杂交。因此睾丸是CAPN11的主要表达位置，但我们不能 排除该基因在其它尚未研究的组织中表达的可能性。 我们已经确定人体CAPN11基因定位在哪条染色体上。籍助PCR，用对人体 CAPN11核苷酸序列特异的引物以及人/啮齿动物体细胞杂交作图板，我们已将该 基因定位到染色体6上(Correll细胞文库)。籍助放射杂交作图，使用中等分 辨的Stanford-G3板(Research Genefics Inc.)和Stanford Human Genome Center(Shgc-www.Stanford.edu)的数据库，已将该基因定位在该染色体上，距 离标志物SHGC-32834有5centiray(LOD Score12.87)。这个标记物位于微 卫星标记D6S1616(59.6cM)和D6S427(73.9cM)之间的间隔中(7)，该间隔中的 一个标记物D6S269按细胞遗传定位在6p12上(5)。因此，CAPN11位于染色体 6上p12附近。在此染色体上未定位任何其它的钙蛋白酶基因。 小鸡μ/m钙蛋白酶是欲克隆的钙蛋白酶家族的第一个成员(16)。开始时它 被称为m钙蛋白酶但在其它的鸡钙蛋白酶被鉴定出之后被重新分类，它们很可 能是哺乳动物μ和m钙蛋白酶的直向进化同源物(18)。但是尚未测定到哺乳动 物μ/m钙蛋白酶。由于CAPN11与小鸡μ/m钙蛋白酶的同源性比其它哺乳动物钙 蛋白酶的大，它可能是其直向进化同源物。 迄今有五种钙蛋白酶具有一定程度的组织特异性-CAPN3(骨骼肌)，CAPN6 (胎盘)，CAPN8(可能是平滑肌)，CAPN9(胃和小肠)和CAPN11(睾丸)。 人们已经在睾丸中鉴定出多种蛋白酶，推测它们参与一些过程例如组织重组等 (20)，精子发生调控(14)，精子渗入透明带(10)和受精(13)。但是这些 活性中有许多与分泌蛋白酶有关，而APN11可能是胞内定位的。在睾丸中它可能 参与其它组织中的钙蛋白酶参与的一些过程，例如生殖细胞凋亡(3)或睾丸特异性 转录因子的调控。 本发明的另一主题涉及多肽CAPN11用于鉴定能抑制这种多肽酶活性的物质 (即所谓的钙蛋白酶抑制剂)的用途，特别是对CAPN11具有选择性的这类钙蛋 白酶抑制剂。选择性意味着，这类钙蛋白酶抑制剂抑制CAPN11的活性比抑制其 它上面提及的钙蛋白酶更强，优选至少强10倍，更优选强25倍，或更多。CAPN11 的酶活性是一种Ca依赖性的蛋白酶活性。 本发明的另一主题涉及一种鉴定可抑制权利要求1多肽的酶活性的化合物的 方法，包括： (a)将在该化合物存在时CAPN11的酶活性程度与无该化合物存在时CAPN11 的酶活性程度进行比较，和 (b)选择与无该化合物存在时CAPN11的酶活性相比改变了CAPN11酶活性 程度的化合物。 按上面提及的方法鉴定出的抑制性化合物适宜于治疗由于CAPN11活性非生 理性提高所致或与此相关的疾病，例如男人的不育症。 这种抑制剂的剂量和治疗方案应通过对其它蛋白酶抑制剂已知的常规方法 确定。 参考文献 1.Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.and Lipman，D.J. 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图3是CAPN11的表达。将具有人体CAPN11cDNA编码序列的800碱基对区 段的32P-标记DNA探针Master印迹(A)，带50种不同人体组织的RNA斑点 印迹的尼龙膜或者Clontech-多组织Northern-印迹(D)上杂交。对膜进行高 严谨度(6×SSC，65℃)的洗涤。不同的RNA在斑点印迹膜上的准确位置用图表 示(C)。Northern印迹上的RNA在相应的泳道上方给出。斑点印迹和Northern 印迹用人遍在蛋白(B)和β-肌动蛋白的DNA探针进行再杂交，以便测定所上样 的poly(A+)RNA的量。对于Northern印迹给出了分子量标记物(以千碱基计) 的位置。曝光时间为：A，72小时.；B，24小时.；D，48小时。PBL＝外周血白细胞。 序列表 <110>BASF Aktiengesellschaft <120>Hoden-spezifisches Calpain <120>睾丸特异性钙蛋白酶 <130>OZ0050/ <140> <141> <160>2 <170>PatentIn Ver. 2.0 <210>1 <211>2338 <212>DNA <213>人(Homo sapiens) <220> <221>5′UTR <222>(1)..(103) <220> <221>CDS <222>(104)..(2212) <220> <221>3′UTR <222>(2213)..(2338) <400>1 ctccccaggg ccgagtcttc cggagtcagc agagagcctg gatggatcac aggaggataa 60 gcctcggggc tcatgtgcgg agcccacttt tactgatacg gga atg gtg gct cac 115 Met Val Ala His 1 ata aac aac agc cgg ctc aag gcc aag ggc gtg ggc cag cac gac aac 163 Ile Asn Asn Ser Arg Leu Lys Ala Lys Gly Val Gly Gln His Asp Asn 5 10 15 20 gcc cag aac ttt ggt aac cag agc ttt gag gag ctg cga gca gcc tgt 211 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Leu Ser Leu 680 685 690 gaa cag tgg ctg cag atg acc atg tgg gga tag aggcgctgta ggagcctggt 2232 Glu Gln Trp Leu Gln Met Thr Met Trp Gly 695 700 catctctacc agcagcagca gcagcgaggt tctagcccag gagggtgggg tgcttcttgt 2292 agccctcagc tctccagtct ctgctgatga aatgggatcc aggtgg 2338 <210>2 <211>702 <212>PRT <213>人(Homo sapiens) <400>2 Met Val Ala His Ile Asn Asn Ser Arg Leu Lys Ala Lys Gly Val Gly 1 5 10 15 Gln His Asp Asn Ala Gln Asn Phe Gly Asn Gln Ser Phe Glu Glu Leu 20 25 30 Arg Ala Ala Cys Leu Arg Lys Gly Glu Leu Phe Glu Asp Pro Leu Phe 35 40 45 Pro Ala Glu Pro Ser Ser Leu Gly Phe Lys Asp Leu Gly Pro Asn Ser 50 55 60 Lys Asn Val Gln Asn Ile Ser Trp Gln Arg Pro Lys Asp Ile Ile Asn 65 70 75 80 Asn Pro Leu Phe Ile Met Asp Gly Ile Ser Pro Thr Asp Ile Cys Gln 85 90 95 Gly Ile Leu Gly Asp Cys Trp Leu Leu Ala Ala Ile Gly Ser Leu Thr 100 105 110 Thr Cys Pro Lys Leu Leu Tyr Arg Val Val Pro Arg Gly Gln Ser Phe 115 120 125 Lys Lys Asn Tyr Ala Gly Ile Phe His Phe Gln Ile Trp Gln Phe Gly 130 135 140 Gln Trp 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Ile Lys Phe Lys Ser Phe Lys Thr Lys Gly Phe Gly Leu Asp 565 570 575 Ala Cys Arg Cys Met Ile Asn Leu Met Asp Lys Asp Gly Ser Gly Lys 580 585 590 Leu Gly Leu Leu Glu Phe Lys Ile Leu Trp Lys Lys Leu Lys Lys Trp 595 600 605 Met Asp Ile Phe Arg Glu Cys Asp Gln Asp His Ser Gly Thr Leu Asn 610 615 620 Ser Tyr Glu Met Arg Leu Val Ile Glu Lys Ala Gly Ile Lys Leu Asn 625 630 635 640 Asn Lys Val Met Gln Val Leu Val Ala Arg Tyr Ala Asp Asp Asp Leu 645 650 655 Ile Ile Asp Phe Asp Ser Phe Ile Ser Cys Phe Leu Arg Leu Lys Thr 660 665 670 Met Phe Thr Phe Phe Leu Thr Met Asp Pro Lys Asn Thr Gly His Ile 675 680 685 Cys Leu Ser Leu Glu Gln Trp Leu Gln Met Thr Met Trp Gly 690 695 700