技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及Desi1蛋白在水稻抗纹枯病中的应用。
相关背景技术
[0002] 水稻作为我国主粮食作物，在国家粮食生产中占有举足轻重的地位。水稻纹枯病(Rice sheathblight)是一种世界性病害，由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起。环境适宜的条件下，纹枯病可引起水稻减产高达50％，给生产带来严重威胁。目前，病害防控手段以化学防治为主，但化学防治成本高、污染环境，且易产生抗药性。因此，采用经济、环境友好型防治措施尤为迫切。选育和栽培抗病品种是水稻纹枯病最为经济、安全和有效的防治策略。
[0003] 蛋白质SUMO化修饰(SUMOylation)是一种广泛存在于真核生物细胞中的翻译后修饰SUMO化修饰调控蛋白‑蛋白互作、底物蛋白的亚细胞定位、活性或稳定性等。SUMO化修饰始终处于动态平衡之中，其水平受SUMO蛋白酶的调控。目前已经报道植物中有两类SUMO蛋白酶，分别是类泛素蛋白酶(Ubiquitin‑like protease,ULP)和去SUMO化异肽酶(DeSumoylating isopeptidase,Desi)。与ULP类SUMO蛋白酶相比，Desi类SUMO蛋白酶在胞内的功能以及底物报道甚少。SUMO蛋白酶可通过与SUMO化修饰后的底物蛋白相互作用，将所修饰的SUMO分子切割，使该蛋白被去SUMO化修饰(deSUMOylation)，被切下的SUMO分子仍可以循环参与SUMO化修饰(Morrell and Sadanandom,2019)。SUMO修饰参与调控众多的生物过程，包括应激反应、信号转导、细胞周期、蛋白质运输、转录、翻译、DNA损伤反应、染色质完整性和核转运(Hannoun et al.,2016；Seeler et al.,2003；vandenBurg et al.,2010；Wohlschlegel et al.,2004)。在植物和动物中SUMO修饰主要参与免疫反应的调节(Hannoun et al.,2016；van den Burg et al.,2010)。近年来，大量研究表明SUMO化修饰在调节植物免疫反应中发挥着至关重要的作用。然而，SUMO化修饰是否参与调控水稻与纹枯病菌之间的相互作用尚未见报道。
具体实施方式
[0018] 本发明提供了Desi1蛋白在调控水稻抗纹枯病抗性中的应用，所述Desi1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：MAEEGYKVVLNVYDLSNGLARQLSTSFLGKPIEAIWHTGVVVYGNEYFFGGGIQSLAAGRTPYGRPVRVVEMGETHIPREVFEDYLRDISPRYTAETYRLLSHNCNNFSNEVAQFLVGAGIPDYILNLPAEVMSSPMGPLIMPMIQNLESTLRTNAAPQATQFVPSSVPPPPPPQNKPGEGSSSSKQEDKAAKAKQGSAADPLGGARGKVQEEVMREFAAIMASGTLRASEAAALAMRRVMERHGNATMQQS*。
[0019] 本发明所述Desi1蛋白的氨基酸序列共包含252AA，为Desi1(LOC_Os02g56900)基因中核苷酸序列中759bp，所述Desi1的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：ATGGCGGAGGAAGGGTACAAGGTTGTTCTTAACGTGTACGACCTCAGCAACGGCCTCGCGCGGCAGCTCTCCACCTCCTTCCTCGGCAAGCCAATCGAGGCCATCTGGCATACGGGCGTGGTGGTGTACGGGAACGAGTACTTCTTCGGCGGCGGGATCCAGTCGCTGGCGGCGGGGAGGACGCCGTACGGGCGGCCGGTGCGGGTGGTGGAGATGGGCGAGACGCACATCCCGCGGGAGGTGTTCGAGGACTACCTCCGCGACATCTCGCCGCGGTACACGGCGGAGACGTACCGGCTGCTCAGCCACAACTGCAACAACTTCAGCAACGAGGTGGCGCAATTCCTCGTCGGCGCCGGCATCCCCGACTACATCCTCAACCTCCCCGCCGAGGTCATGTCCAGCCCCATGGGCCCCCTCATCATGCCCATGATTCAGAACCTCGAGTCCACGCTCCGGACCAACGCCGCGCCGCAGGCCACGCAGTTCGTCCCCTCGTCCGTGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCAGAACAAGCCCGGCGAGGGCTCGTCTTCCTCGAAGCAAGAAGACAAGGCGGCCAAAGCGAAGCAGGGCTCGGCGGCTGACCCGCTCGGCGGCGCGAGGGGGAAGGTGCAGGAGGAGGTGATGCGGGAGTTCGCGGCGATCATGGCGAGCGGGACGCTGCGGGCGAGCGAGGCGGCGGCGCTGGCGATGCGGCGGGTCATGGAGCGGCACGGCAACGCCACCATGC AGCAGAGCTAG。
[0020] 本发明的一个具体实施方式中，所述调控包括：敲除编码所述Desi1蛋白的基因后，增强水稻对纹枯病的敏感性；过表达编码所述Desi1蛋白的基因后，增强水稻对纹枯病的抗性。
[0021] 本发明提供了Desi1基因在创制与水稻纹枯病抗性相关的水稻种质中的应用，所述Desi1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0022] 本发明的一个具体实施方式中，可通过基因编辑的方法对水稻基因组进行基因敲除，可获得对水稻纹枯病更敏感的种质；还可通过过表达的方法将水稻基因组中Desi1基因进行过表达，从而获得对水稻纹枯病高抗性的种质。
[0023] 本发明提供了一种与水稻纹枯病抗性相关的水稻种质的创制方法，包括对水稻基因组中Desi1基因进行敲除或过表达，所述Desi1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0024] 本发明的一个具体实施方式中，所述敲除的方法包括CRISPR/Cas9基因编辑方法，所用的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示：CGACATCTCGCCGCGGTACA。
[0025] 本发明的一个具体实施方式中，包括将含所述sgRNA插入CRISPR‑Cas9载体中，得基因敲除载体，本发明使用的CRISPR‑Cas9载体构建试剂盒购自杭州百格生物科技有限公司(Cat#BGK01)。
[0026] 本发明的一个具体实施方式中，所述过表达包括将所述Desi1基因克隆入植物表达载体PGA1611载体中获得过表达载体，利用所述过表达载体转染目标水稻品种，得过表达种质。
[0027] 本发明提供了利用上述创制方法得到的水稻种质在抗水稻纹枯病中的应用。
[0028] 为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的Desi1蛋白在水稻抗纹枯病中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0029] 实施例1
[0030] CRISPR/Cas9基因编辑转基因水稻植株desi1的获得
[0031] 1、转基因水稻的获得
[0032] 提供SEQ ID No.2所示序列的Desi1基因序列给公司，由武汉伯远生物科技有限公司进行靶位点序列设计、引物设计、载体构建及转化，转化水稻品种ZH11。最终得到T0代转基因水稻。
[0033] 2、转基因水稻的鉴定
[0034] 得到的转基因植株进一步经测序分析验证，如图1所示。通过对阳性植株测序分析发现，5#植株在Desi1编码基因序列的第263和264位碱基间插入了碱基T，19#植株在Desi1编码基因序列的第264位缺失了碱基C，造成OsDesi1基因编码的氨基酸序列出现移码现象，使OsDesi1基因功能丧失(图1)，将基因编辑植株分别命名为desi1‑5和desi1‑19。
[0035] 实施例2
[0036] Desi1过表达转基因水稻植株的获得
[0037] 1)用于过表达Desi1基因的重组载体构建
[0038] Desi1(LOC_Os02g56900)基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示，编码的蛋白为OsDesi1，氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。
[0039] 扩增序列片段克隆入植物表达载体PGA1611载体(Piao HL,XuanYH,Park SH,Je BI,Park SJ,Park SH,Kim CM,Huang J,Wang GK,Kim MJ,Kang SM,Lee IJ,Kwon TR,Kim YH,Yeo US,Yi G,Son D,Han CD.OsCIPK31,a CBL‑interacting protein kinase is involved in germination and seedling growth under abiotic stress conditions inriceplants.Mol Cells.2010,30:19‑27；公众可从韩国国立庆尚大学获得)骨架连接，得到OsDesi1基因的过表达载体(图2中A)。
[0040] 2)过表达OsDesi1基因转基因水稻的获得
[0041] 将上述获得的PGA1611‑OsDesi1过表达载体转入农杆菌LBA4404，并转化水稻品种ZH11，潮霉素筛选，获得T0代转PGA1611‑OsDesi1水稻，即为OsDesi1‑OX过表达转基因株系，命名为Desi1‑OX。具体操作由武汉伯远生物科技有限公司完成。
[0042] 3)Desi1‑OX转基因水稻植株分子鉴定
[0043] 对上述获得的T0代Desi1‑OX转基因水稻和野生型水稻ZH11进行分子鉴定，提取各种水稻根的总RNA经反转录后，用如下引物进行qRT‑PCR方法鉴定：
[0044] OsDesi1‑F(SEQ ID No.4):ACCACCATACATTCGACGCG；
[0045] OsDesi1‑R(SEQ ID No.5):GGGTTATCGTTATCCATCCATCGG；
[0046] 内参基因为Ubiquitin，内参引物为：
[0047] Ubiquitin‑F(SEQ ID No.6):CACGGTTCAACAACATCCAG；
[0048] Ubiquitin‑R(SEQ ID No.7):TGAAGACCCTGACTGGGAAG；
[0049] 结果如图2中B所示，T0代Desi1‑OX转基因水稻中Desi1的平均相对表达量明显高于野生型水稻ZH11中Desi1的平均相对表达量。
[0050] 实施例3
[0051] desi1转基因水稻和Desi1‑OX转基因水稻接种纹枯病后表型观察
[0052] 采用活体接种纹枯病菌的方法进行抗性鉴定。
[0053] 活体接种：用喷壶将待接菌的水稻叶鞘部位喷湿。用无菌镊子取长满纹枯病菌菌丝的木皮，插入水稻植株下数第三片叶子的叶鞘中。再次用喷壶喷湿夹有木皮的叶鞘部位，用保鲜膜缠住接菌部位进行保湿，置于正常生长条件下继续培养。72h后取下保鲜膜。每个处理3次重复。接种10～15d后调查统计。
[0054] desi1突变体植株接种结果显示，desi1突变体植株的病斑明显大于野生型病斑，这些突变体表现更感病(图3)。Desi1‑OX转基因植株接种结果显示过表达植株的病斑长度明显小于野生型(图3)，说明过表达植株更抗病。
[0055] 尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
