[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及胰岛β细胞特异性敲除Osgep基因的小鼠模型的构建方法及应用。

[0002] O‑唾液酸糖蛋白内肽酶(O‑sialoglycoprotein endopeptidase, Osgep)，其定位于小鼠第14号染色体上NC_000080.7 (51152831..51162350, complement)，转录本NM_133676.2全长1608 bp，包含11个外显子，编码蛋白质的CDS序列全长1008bp，编码的蛋白质
6
包含335个氨基酸残基。目前对OSGEP研究最多的功能是催化tA37修饰，在真核细胞中将苏氨酰氨基甲酰基腺苷酸(Threonylcarbamoyl adenylate, TC‑AMP)的TC基团转移至tRNA 
6
NNU (N = A、T、G、C)第37位腺苷上完成tA37修饰。OSGEP基因在三大物种(细菌、古生菌和真核生物)进化中高度保守，早在 2004 年，科学家们就将 OSGEP 列为 “十大功能未知基因 ”之首(Nucleic Acids Res, 2004. 32(18): p. 5452‑63)。在蛋白质翻译过程中，tRNA 修饰对保证翻译的准确性和效率起着至关重要的作用，而第37位腺苷被修饰的程度最高，约占所有修饰的70%。证据表明，在酵母、果蝇细胞中，Osgep表达缺失导致显著的蛋白翻译保真度下降，使错误翻译蛋白在细胞中积累，诱导未折叠蛋白质应激反应(Unfolded protein response, UPR)，触发内质网应激通路。

[0003] 糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，发展严重的患者常伴随严重的并发症，包括视网膜病变、神经病变和肾病等。随着社会经济发展和人们生活方式改变，糖尿病患病率持续增长，已成为危害民众健康的重大公共卫生问题。胰岛素的绝对和/或相对不足被认为是诱发糖尿病的直接原因。胰岛素是机体分泌的唯一降血糖的激素，由胰岛β细胞合成分泌，以维持机体血糖的正常水平。胰岛素原肽链在内质网中合成3个进化保守的二硫键，完成初始折叠，正常情况下约有20%的肽链发生错误翻译无法保持正确构象，细胞将通过UPR通路处理这部分错误折叠蛋白。然而在代谢需求大量增加的情况下，胰岛素发生错误翻译的频率增加，这会进一步加剧蛋白错误折叠的程度，给内质网造成了巨大负担，一旦打破细胞处理的平衡，将导致胰岛β细胞功能障碍。现有技术中尚且没有将Osgep和胰岛β细胞关联的研究。

[0032] 下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法和技术，通常按照所属领域的常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。以下所有实验均在符合生物实验的道德与伦理规定的前提下进行。实施例1

[0033] Osgep‑flox小鼠的构建1) 本发明中涉及的基因Osgep转录本NM_133676.2全长1608 bp，包含11个外显子，其中编码蛋白质的CDS序列为1008bp  (如SEQ ID NO.1所示)。编码的蛋白质NP_
060277.1包含335个氨基酸残基(如SEQ ID NO.2所示)。

[0034] SEQ ID NO.1： Osgep转录本NM_133676.2中CDS序列：ATGCCCGCGG TGCTGGGGTT CGAAGGCAGC GCCAACAAGA TCGGCGTGGG CGTGGTCCGC GACGGCACGG TGCTGGCGAA CCCGCGGCGC ACTTACGTCA CGGCCCCGGG CACCGGATTC CTTCCAGGTG ACACGGCCAG GCACCATCGA GCTGTTATCC TAGACCTACT GCAGGAGGCG CTAACAGAGG CAGGATTGAC CTCCAAGGAC ATTGATTGTA TTGCTTTCAC CAAAGGTCCT GGCATGGGAT CCCCATTGGC TTCTGTAGCT GTTGTTGCCC GTACAGTGGC CCAGTTGTGG AATAAGCCTT TGCTTGGCGT GAACCACTGC ATAGGCCACA TTGAAATGGG CCGTCTCATC ACTGGAGCCG TTAACCCAAC TGTCCTGTAT GTGAGCGGAG GAAATACCCA GGTGATTTCC TACTCAGAAC ATCGTTATCG CATCTTTGGA GAAACTATTG ATATCGCCGT GGGAAACTGC CTGGATCGTT TTGCTCGGGT GCTGAAGATT TCCAATGACC CCAGTCCAGG CTACAACATT GAGCAGATGG CAAAGCGAGG CAAGAAGCTA GTCGAGCTGC CATACACTGT AAAGGGGATG GATGTCTCGT TTTCAGGGAT TCTGTCTTTC ATTGAGGATG CAGCGCAGCG AATGCTGGCC ACTGGAGAGT GTACTCCTGA AGACCTGTGT TTCTCCTTAC AGGAAACCGT GTTTGCAATG CTAGTGGAAA TCACGGAGCG AGCCATGGCA CACTGTGGCT CCAAGGAAGC CCTCATCGTC GGAGGAGTTG GATGTAACCT GAGGCTGCAG GAGATGATGG GGACAATGTG CCAGGAGCGG GGAGCCCAGC TCTTTGCAAC AGATGAGAGA TTCTGCGTTG ACAATGGAGC CATGATAGCC CAAGCTGGTT GGGAGATGTT TCAGGCTGGG CACAGGACTC CTCTCAAAGA TTCTGCAATT ACTCAGAGGT ATAGGACAGA TGAAGTGGAA GTGACATGGA GGGACTAA
SEQ ID NO.2：Osgep编码蛋白NP_060277.1氨基酸序列：
mpavlgfegs ankigvgvvr dgkvlanprr tyvtppgtgf lpgdtarhhr avildllqea ltesgltsqd idciaytkgp gmgaplvsva vvartvaqlw nkplvgvnhc ighiemgrli tgatsptvly vsggntqvia ysehryrifg etidiavgnc ldrfarvlki sndpspgyni eqmakrgkkl velpytvkgm dvsfsgilsf iedvahrmla tgectpedlc fslqetvfam lveiterama hcgsqealiv ggvgcnvrlq emmatmcqer garlfatder fcidngamia qagwemfrag hrtplsdsgv tqryrtdeve vtwrd
2) 根据Osgep基因的结构确定敲除区域为intron 2‑exon 2‑intron 3‑exon3‑intron 4，敲除区域共1574bp，如示意图1所示，在敲除序列的两端分别插入flox片段。体外合成片段：flox1‑intron 2‑exon 2‑intron 3‑exon3‑intron 4‑flox2，序列如SEQ ID NO.3所示，加粗字母为exon编码序列，加粗下划线字母为flox序列。并将该片段插入到Donor质粒中；以上序列的设计均为发明人多重优化后的设计，之后将设计的序列委托和元生物技术(上海)股份有限公司合成(合成方法参考Mol Cell Probes. 2018;37:32‑38.)。

[0035] SEQ ID NO.3：flox1‑intron 2‑exon 2‑intron 3‑exon3‑intron 4‑flox2 (加粗字母为exon编码序列，加粗下划线字母为flox序列)：GTGATTATCG AATATTTGAA AACAGCTGAA AAGTTAAAAT GAAACAAAAC AAAAAAACCC TCAGTAAGTT GATGCCTCAT AAACAGACTG AAAATCGAAC AGCCATTGTT TTCAGTTCTC ATGCATGAAC CATTTCTCAG ATTGTGATGA CAACAAGTAG ACTGTACAGG AAAACTAGTC ACAGCCAGCT TAGTGGCTGG ACTGAGAAGC CCCAAAGCCA GACTTTCACC AAAAACAGTC CAGTCACTGG TGGTCTGCTG CTGCTCTGAC CCACTACAGC TTTCTGAATC CCAGAGAAAC CATGGCATCT GAGAAGGGTA CCCAGCAGAT CATTGAGATG CACCAAAACT GTAACTCCTG AAGTCAGCAG AAAGAGCCCT ATTCAGAGCA ATGCCTGACT GCATGTGGCA TAACCAGTGC TTCAAATCTG AATGACCAAA GTGGAGCTTT GCTTTATCCA CCACATTTAC CCGACCTCTC ATCAGCTGAA TCCGGGGGTA CCGCGTCGAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATATGTTC TTGCCCAAGG TCAGTTGGGA GCTCTCTAGA AAAGGGTGTC TTCAGAACCT TGACAACTTC TCTCAGGGAA AACATTTCCA CTACAAGCAG TATGCAGAGA GAGCATGCTT TCCCACCGCA AGCAGTATGC AGGGAGAGCA TGCTTTCCCA CAGTGAGCGG TATGCAGAGC ATGCTTTCCA AGAGTTTGTT AAAACTTTGG TTTGTTGCAG GAATAAACTC ATCTTTTTGG CTTATTTGTG TGTTTGTTAG TTTGTTTGAA ACAAGGTCAA CAAATCCCTG GCTGTCCTAC TCTGTAGACC AGGCTAACCT CAGACTCATG GAGATCCACC TGCTTCTGCC TTGCTGGGAT TAAAGCTTTG CACCACCACC ACCCAACTAA CTGGTTTGTT GGCAAAGTGT GTTAAAGTGG TTTGTATTTT GATGAATAAA AATGTATTGG CACACGCCTT TAATCCCAGC ACTCAGGAGG CAGAGACAGG CGGATTTCTG AGTTTGAGGC CAGCCTGGTC TGCAAAGTGA GTTCCCGAAA GCCAGGGTTA TTCAGAGAAA CCGTGTCTCG AAAAAACAAA ACAAAACAAA AAAAATTAGT GATTTAAGGT TCATAGCCCC ATATCACAGA TCCCTTTGCA CCAGCCTAGC ACCTGCCTTC TTGTAGTTCA TGTTCTATAT GCCTTTCCTT AGGATTCCTT CCAGGTGACA CGGCCAGGCA CCATCGAGCT GTTATCCTAG ACCTACTGCA GGAGGCGCTA ACAGAGGCAG GATTGACCTC CAAGGACATT GATTGTATTG CTTTCACCAA AGGTAAGTCT GGGAGAGTTG TCAGCAAGGG CAGTATGTGG GTGGTGGGTA CAGACCACCA CCATTACACA TTTTCAAATC TACTTTCTCT ACATACTTTT CCTAATTTCT AGGATTCTAA CCACATTTGT ACGCTGTCAG GTCCTGGCAT GGGATCCCCA TTGGCTTCTG TAGCTGTTGT TGCCCGTACA GTGGCCCAGT TGTGGAATAA GCCTTTGCTT GGCGTGAACC ACTGCATAGG CCACATTGAA ATGGGCCGTC TCATCACTGG AGCCGTTAAC CCAACTGTCC TGTATGTGAG CGGAGGAAAT ACCCAGGTAC TTAAGAGGAC TCTTTGTATT CCATCTTAAT GCTAAGGTAT TCTACCTGAG TTATAGGAGC TGCAAGAGCA AAACCAGGCT CATTCAGACC TAAGATATTA TAGAGAATAC AACAGAGATA TGAAGTTGCA AGCTCTGGAG ACAAATTAGA ATATTTGAAC TTTATACATA CAGCTAGAAT TTCTCATTTA AAAAGAAAAG AATGTGGGTT TCTTAACTTC AAGATAATGT CTCTCTCTTT TTACTTGTGT GGGTGTTTTG CCTGAATGCA CATAGGAGCT TCAGGAAGAC AGAAGAGGTT ATGAGATCCC TGGGAACTGG AGTTATAGAC AGTTGTGAGC CACTGTGTGG GTGCAGGGAA TCAAACCCAG GTCCTTTGGA ACAGCGGTTA GTGCATTTAA CTATTGGACC ATCTCTCCAG CCCTAGCATC GCATTGTCTG AGTAGGTGAT AACTTCGTAT AATGTATGCT ATACGAAGTT ATTCTGAGGC GGAAAGAACC AGGAGCTCGA ATTCATATTC ATTTATCCAC CCTGCTCTCC CTCTTTTCTA AAAGTCAGGG TCTCCAGATA ACCCAGCCCC AAAGTTGTGG TTCTCCTTCC TCAGCCTAAG CAACTGGGAT CACAAGCTAC TGTGTGATGT GACTGTGGCA GGGACTCAAT GCAGTAGACA GCTTCCCTTG TACTATTTTG ATCTTCTGAA CTCCTCCCAC GTGCTGGGAT TACAGACTTG CACCACCATG CCTGGCTCAC CTTTTTCTAT TTCTGACGGA ATGTCTGTGT AGGTCACCAC AACAAACTCA GTTTTGCCTG TTTTAAATTC TTTTTTTGTT AGTTTGGGTT TGGTTTTTTT GTTTGTTTTG GTTTGGTTTT TGTTGGTTTT TTTGTTGTTG TTGTTTTTTG TTTTTGTTTT TTAGACAGGG TTTCTCTGTA
3) 根据Osgep基因的敲除区域的上游序列和下游序列分别设计sgRNA，用于引导cas9酶剪切基因组中的Osgep基因的敲除区域。所述的敲除区域上游的sgRNA分别为；
SEQ ID NO.4：TCAAGGTTCTGAAGACACGG TGG；
SEQ ID NO.5：GAGCAGGGTGGATAAATGAA GGG。

[0036] 由于敲除区域的可选择性较多，根据不同的敲除区域事实上能分别设计得到多对sgRNA (即上游一条，下游一条)。但由于不同的敲除区域会影响敲除结果的可行性和基因组中下游基因的表达，因此，部分设计的sgRNA并不能得到理想的敲除结果或存活的小鼠。而SEQ ID NO.4‑5所示的sgRNA的效果较优。

[0037] 4) 取4‑6周龄C57BL/6J小鼠健康雌鼠3只，向雌鼠腹腔内注射孕马血清促性腺激素(PMSG)，约46‑48小时后再注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)，12小时后即可诱发排卵；供体雌鼠给予hCG后与成熟雄性小鼠进行合笼，交配后第四天收集供体雌鼠子宫中的囊胚，在显微镜下将sgRNA、cas9酶和Donor质粒显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，构建形成特定的小鼠胚胎细胞(受精卵)；5) 体外培养1‑2小时后将存活的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管，出生的小鼠记为F0代小鼠，通过PCR技术对F0代小鼠进行鉴定，确定插入位点，从后代中筛选得到flox阳性的小鼠。

[0038] PCR过程体系配比以及反应流程(适用于本发明中所有的PCR反应)：表1 PCR反应体系

[0039] 表2 PCR反应运行程序

[0040] 对exon2上游的flox位点做PCR鉴定，所用引物序列为：SEQ ID NO.6: 2658‑Osgep‑wt‑tF1‑GCATGTGGCATAACCAGTGCTTC；
SEQ ID NO.7: 2658‑Osgep‑wt‑tR1‑CTCTCCCTGCATACTGCTTGC。

[0041] 检测结果如图3所示。结果显示了Osgep‑flox杂合子小鼠基因型鉴定结果，flox位点扩增片段288bp (flox)，野生型扩增片段为197bp (WT)。

[0042] 对exon3下游的flox位点做PCR鉴定，所用引物序列为：SEQ ID NO.8: Zmk‑2F4‑GCATCGCATTGTCTGAGTAGGTG
SEQ ID NO.9: 2658‑Osgep‑F0‑3tR1‑GCAGCCATGCTGGTCTACACAG
检测结果如图4所示。结果显示了Osgep‑flox杂合子小鼠基因型鉴定结果，flox位点扩增的片段为1166bp (flox)。

[0043] 6) 由于F0代小鼠不一定具备稳定遗传的能力，需要进行传代以获得可稳定遗传的F1代小鼠。

[0044] 将F0代小鼠与C57BL/6J小鼠杂交获得F1代小鼠，对F1代小鼠用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7引物进行flox位点PCR鉴定，共可能产生两种基因型小鼠，根据PCR结果判断：野生型：PCR获得197bp片段一条带。

[0045] 杂合子：PCR获得197bp片段和288bp片段两条带。

[0046] 获得F1代flox阳性小鼠，即为F1代Osgep‑flox杂合小鼠。实施例2

[0047] Osgep胰岛β细胞特异性敲除小鼠构建将F1代Osgep‑flox杂合小鼠与胰岛β细胞特异性转基因Ins2‑cre小鼠(购自江苏flox/‑ Cre
集萃药康公司)交配，可以得到Osgep ×Ins 杂合子(Osgep胰岛β细胞特异性敲除小鼠模型的构建示意图如图2所示)。再将其与F1代Osgep‑flox杂合小鼠交配，即可以得到胰岛βflox/flox Cre
细胞特异性敲除的Osgep ×Ins 小鼠，简称Osgep KO小鼠，其基因组中包含flox和cre两个标签，需分别进行鉴定。

[0048] 使用引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5对flox位点做PCR鉴定，PCR体系和流程如上所述。鉴定结果如图5所示，野生型扩增片段为197bp；纯合子扩增片段为288bp；杂合子扩增片段为两个：197bp和288bp。

[0049] 另外，为了得到Osgep KO小鼠，还需对标签cre进行基因型鉴定，所使用的引物对是：SEQ ID NO.10: Ins2‑Pro‑tF‑ CTCTGGCCATCTGCTGATCC；
SEQ ID NO.11: Ins2‑Pro‑tR‑CGCCGCATAACCAGTGAAAC。

[0050] 鉴定结果如如图6所示，Ins2‑cre转基因扩增的PCR产物片段为550bp；野生型无扩增片段。实施例3

[0051]  Osgep胰岛β细胞特异性敲除小鼠(Osgep KO)体重升高，血糖代谢紊乱flox/flox选取同窝出生的对照组小鼠(以WT表示，Osgep 基因型小鼠)以及Osgep胰岛flox/flox Cre
β细胞特异性敲除小鼠(以KO表示，Osgep ×Ins 基因型小鼠)，每组6只，从12周龄开始每周记录小鼠体重变化。结果如图7所示，与对照组小鼠比较，KO组小鼠体重增长速度更快，40周时体重平均49.4g，比对照组增加30.7%。

[0052] 进一步检测小鼠空腹血糖水平，自上午8:00撤去饲料共禁食6小时，在小鼠尾巴尖部采集新鲜静脉血，使用罗氏活力型血糖仪及配套的血糖试纸检测血糖值。结果如图8所示，KO组小鼠空腹血糖水平显著升高。

[0053] 腹腔注射葡萄糖耐量实验(Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, IPGTT)可以考察小鼠对葡萄糖的耐受性，具体操作步骤为：小鼠经16小时禁食不禁水后，腹腔注射2g/kg (葡萄糖重量/小鼠体重)的葡萄糖溶液，于小鼠尾巴尖部检测注射葡萄糖0、15、30、
60、120分钟的血糖水平并绘制血糖变化曲线。IPGTT实验结果如图9所示，结果证明，KO小鼠表现葡萄糖耐受性受损，机体对葡萄糖的处置清除能力下降。
实施例4

[0054] 高脂饮食诱导的Osgep胰岛β细胞特异性敲除小鼠(Osgep KO)血糖代谢紊乱程度加剧对成年小鼠用含60% fat Kcal%的高脂饲料(High‑fat diets, HFD)喂养16周是flox/flox
糖尿病领域常用的造模方法。我们选取6周大小的对照组（Osgep 基因型小鼠）和flox/flox Cre
Osgep胰岛β细胞特异性敲除小鼠（Osgep ×Ins 基因型），每组6只，持续喂养16周，依照实施例3中的实验操作检测两组小鼠的体重变化、空腹血糖和IPGTT。

[0055] 结果发现，KO小鼠和WT组在高脂饮食诱导后，指标显示均为糖尿病小鼠。相比较而言，KO小鼠体重较WT组升高10g (图10)，空腹血糖水平也显著高于WT组(图11)，葡萄糖耐量受损程度加剧(图12)。实施例5

[0056] 腺相关病毒递送Osgep改善高脂饮食诱导的血糖代谢紊乱为了给临床糖尿病提供新的治疗思路，本发明分析了Osgep基因过表达是否有成药的可能性。委托和元生物技术(上海)股份有限公司构建包装包含Osgep基因的腺相关病毒。详细如下：构建包含Osgep CDS序列全长(如SEQ ID NO.1所示)的重组质粒pAAV‑ CMV‑Osgep‑MCS‑EF1‑GdGreen‑WPRE，与腺相关病毒包装质粒pAAV‑RC、pHelper共同转染HEK293细胞，培养72小时后，收集病毒上清液，经超速离心制备包被了Osgep基因CDS序列的腺相关病毒颗粒 (具体构建过程参考现有技术Hum Gene Ther Methods. 2017;28(1):49‑59.)。

[0057] 对高脂饮食诱导后的小鼠随机分成两组，每组有6只小鼠，分别通过腹腔注射对照组病毒(以CON表示)或Osgep过表达病毒(以OE‑Osgep表示)。依照实施例3中的实验操作检测两组小鼠的体重变化、空腹血糖和IPGTT。

[0058] 结果发现Osgep可以明显减缓小鼠体重增长(图13)，降低空腹血糖水平(图14)，改善受损的葡萄糖耐受性(图15)，提示过表达Osgep可以有效治疗糖尿病小鼠。

[0059] 以上所述为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明权利要求的保护范围之内。