具体技术细节
[0006] 发明目的：本发明的目的是提供了一种兽用疫苗复合佐剂及其制备方法和应用。
[0007] 技术方案：本发明提供了一种兽用疫苗复合佐剂，所述疫苗复合佐剂中的活性成分为含锰复合物和Mincle激动剂。
[0008] 进一步地，所述含锰复合物中含二价锰离子。
[0009] 进一步地，所述含锰复合物包括氯化锰、溴化锰、碘化锰、硫酸锰、硝酸锰、高氯酸锰、醋酸锰、硼酸锰、氧化锰、二氧化锰、四氧化三锰、磷酸锰或碳酸锰中一种或几种。
[0010] 更进一步地，含锰复合物优选为氯化锰。
[0011] 进一步地，Mincle激动剂来源于Mincle识别的胞外配体，所述胞外配体包括海藻糖6,6'‑二霉酸酯、海藻糖6,6’‑二山嵛酸酯、甘油糖脂、甘露糖基脂肪酸偶联甘露醇、甘油单霉菌酸酯、β‑龙胆二糖甘油二酯、β‑葡萄糖甘油二酯、α‑葡萄糖基二酰基甘油、葡萄糖基‑2‑十四烷基十八酸酯(GlcC14C18)、甘露糖基‑2‑十四烷基十八酸酯、葡萄糖单霉菌酸酯、阿拉伯糖单霉菌酸酯、胆固醇硫酸酯、β‑葡萄糖神经酰胺一种或几种。
[0012] 更进一步地，Mincle激动剂优选为海藻糖6,6’‑二山嵛酸酯(TDB)。
[0013] 进一步地，所述Mincle激动剂浓度为0.2～2mg/mL，锰离子浓度为1.0～10mg/mL，锰离子和Mincle激动剂浓度比为2～10:1。
[0014] 进一步地，所述复合佐剂还包括用于递送疫苗复合佐剂的阳离子聚合物。
[0015] 进一步地，所述阳离子聚合物为氯化三甲基‑2,3‑二油烯氧基丙基铵、溶血卵磷脂、二甲基双十八烷基铵、溴化三甲基十二烷基铵、3β‑[N‑(N’,N’‑二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、聚胺类、聚酰胺‑胺类、聚甲基丙烯酸酯类、聚氨基酸类、聚酯类或天然多糖类中一种或几种。
[0016] 更进一步地，阳离子聚合物优选为二甲基双十八烷基铵(DDA)。
[0017] 进一步地，所述阳离子聚合物的浓度为1.0‑5.0mg/mL。
[0018] 本发明还提供了上述兽用疫苗复合佐剂的制备方法，包括以下步骤：用有机溶剂溶解阳离子聚合物和Mincle激动剂，充分混匀后去除有机溶剂，得到脂质薄膜；加入PBS使脂质薄膜水化，得到脂质体佐剂；将含锰试剂用PBS溶解后与脂质体佐剂混匀，即得兽用疫苗复合佐剂。
[0019] 具体的，制备步骤包括：
[0020] 1)取适量有机溶剂甲醇和氯仿按照1：9制成有机溶剂，分别溶解DDA与TDB；按照DDA与TDB的质量比为5:1加至西林瓶内，充分溶解混匀，置于通风橱内过夜风干，在瓶底部形成一层均匀脂质薄膜；
[0021] 2)加入适量PBS缓冲液，于60℃水浴条件下水化20分钟，其中，每隔5分钟取出并涡旋1分钟；使用超声波清洗仪进行2次超声，每次1分钟，得到DDA‑TDB脂质体佐剂；
[0022] 3)称取适量MnCl2·4H2O至PBS中，在室温下充分溶解，然后再与DDA‑TDB脂质体佐剂充分混匀，得到DDA‑TDB‑Mn复合佐剂。
[0023] 本发明还提供了一种兽用疫苗，所述疫苗包括上述的兽用疫苗复合佐剂和抗原。
[0024] 进一步地，所述的抗原浓度为0.2～2.0mg/mL。
[0025] 进一步地，所述抗原和兽用疫苗复合佐剂的体积比为1:1。
[0026] 进一步地，所述阳离子聚合物、Mincle激动剂、含锰复合物、疫苗抗原的质量比为5:1:5:1。
[0027] 本发明还提供了一种H7N9亚型禽流感灭活疫苗，所述疫苗中包括上述的兽用疫苗复合佐剂和H7N9亚型禽流感免疫原。
[0028] 进一步地，所述兽用疫苗复合佐剂中的含锰复合物为氯化锰，Mincle激动剂为海藻糖6,6’‑二山嵛酸酯，阳离子聚合物为二甲基双十八烷基铵。
[0029] 进一步地，所述H7N9亚型禽流感免疫原为灭活的A/chicken/Guangdong/GD15/2016H7N9亚型禽流感病毒。
[0030] 进一步地，所述疫苗组合物的使用方法为静脉注射、肌肉注射、皮内注射、皮下注射、点眼滴鼻中的一种或任意组合。
[0031] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明的兽用疫苗复合佐剂将Mn与TDB组合，使TDB佐剂的免疫增强效果。所述复合佐剂可以诱导强烈免疫应答反应，显著提升了免疫效果，且使用无残留损害。本申请中利用H7N9亚型禽流感灭活病毒为抗原，与复合佐剂混合后制备的H7N9疫苗与单独使用DDA‑TDB相比，能增强机体的体液免疫和细胞免疫应答反应，减少病毒载量，提高保护水平，免疫后完全保护SPF鸡对H7N9亚型禽流感病毒致死性攻击。为兽用疫苗的生产提供产品和技术支撑。
法律保护范围
涉及权利要求数量10：其中独权3项，从权-3项
1.一种兽用疫苗复合佐剂，其特征在于，所述疫苗复合佐剂中的活性成分为含锰复合物和Mincle激动剂。
2.根据权利要求1所述的兽用疫苗复合佐剂，其特征在于，所述含锰复合物中含二价锰离子。
3.根据权利要求1所述的兽用疫苗复合佐剂，其特征在于，所述Mincle激动剂浓度为
0.2～2mg/mL，锰离子浓度为1.0～10.0mg/mL，锰离子和Mincle激动剂浓度比为2～10:1。
4.根据权利要求1所述的兽用疫苗复合佐剂，其特征在于，所述复合佐剂还包括用于递送疫苗复合佐剂的阳离子聚合物。
5.根据权利要求4所述的兽用疫苗复合佐剂，其特征在于，所述阳离子聚合物的浓度为
1.0～5.0mg/mL。
6.权利要求1～5任一项所述的兽用疫苗复合佐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：用有机溶剂溶解阳离子聚合物和Mincle激动剂，充分混匀后去除有机溶剂，得到脂质薄膜；加入PBS使脂质薄膜水化，得到脂质体佐剂；将含锰试剂用PBS溶解后与脂质体佐剂混匀，即得兽用疫苗复合佐剂。
7.一种兽用疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求1所述的兽用疫苗复合佐剂和抗原。
8.根据权利要求7所述的兽用疫苗，其特征在于，所述的抗原浓度为0.2～2mg/mL。
9.一种H7N9亚型禽流感灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗中包括权利要求1～5中任一项所述的兽用疫苗复合佐剂和H7N9亚型禽流感免疫原。
10.根据权利要求9所述的H7N9亚型禽流感灭活疫苗，其特征在于，所述兽用疫苗复合佐剂中的含锰复合物为氯化锰，Mincle激动剂为海藻糖6,6’‑二山嵛酸酯，阳离子聚合物为二甲基双十八烷基铵。
