[0001] 本发明涉及一种兽用疫苗复合佐剂及其制备方法和应用，属于动物疫苗领域。

[0002] 疫苗免疫接种仍然是动物疫病防控的重要举措。而目前许多候选疫苗仍然存在免疫原性差等问题，难以进一步推广应用。为了增加疫苗的免疫原性并能够使其应用于临床，迫切需要研究和发现既安全又有效的免疫佐剂来弥补疫苗的不足，改进和增强疫苗的效果。佐剂直接制约动物疫苗品质的提升，兽用疫苗佐剂发明的滞后导致国内大部分兽用疫苗佐剂依然是依赖国外进口。目前可用于疫苗的佐剂种类很多，由于存在毒性较大、成本较高和功能较单一等不足，难实现临床应用。尤其是，兽用疫苗常使用的油乳佐剂(白油)，但其存在代谢能力差、免疫效果的提升有限和释放抗原的可持续性有待提升等。此外，许多兽用油佐剂疫苗诱导的免疫保护期短，难以实现长效免疫，究其原因，主要是由于疫苗诱导的细胞免疫偏弱或者缺乏T细胞的辅助(T cell helper)。因此，亟需发明一种成本低、副作用小、安全性高、能同时诱导长效免疫和增强体液和细胞免疫应答的新型佐剂，以期弥补油乳佐剂的不足，从而改善现有兽用疫苗的保护效果。

[0003] 巨噬细胞诱导型C型凝集素(Macrophage‑inducible C‑type lectin，Mincle)主要表达于抗原提呈细胞表面，包括巨噬细胞、单核细胞、树突状、中性粒细胞，属于非经典型的C型凝集素家族成员，由Clec4e编码。Mincle在免疫反应过程具有多种功能，可以识别一系列不同的内源性或外源性配体，包括受损的细胞、真菌、细菌、病毒和寄生虫等，激活导致细胞因子和趋化因子的产生，促进炎症或抑制炎症发生。更重要的是，Mincle还可以诱导适应性免疫反应，如抗原特异性T细胞反应和抗体的产生。作为Mincle的激动剂‑海藻糖6,6’‑二山嵛酸酯(TDB)，在研究TDB用于动物疫苗增强免疫效果时发现，TDB可以在动物中产生免疫增强作用，但是这种作用还不够强。

[0004] 锰(Manganese，Mn)是机体必需的微量元素，参与机体多种生理过程，在生命活动中发挥重要作用。尤其是，Mn作为一种无机盐佐剂应用于疫苗的功能也逐渐被挖掘。研究证实Mn可以通过与环状GMP‑AMP合酶(cGAS)的相互作用激活cGAS‑STING途径以促进I型干扰素产生。另外，Mn可以促进抗原呈递细胞的成熟和分化，从而通过增强细胞和体液免疫来增强免疫力。

[0005] 迄今，Mincle激动剂与Mn组合在兽用疫苗佐剂的应用尚未见报道。

[0042] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

[0043] 实施例1：Mn和TDB体外刺激鸡脾脏细胞验证其佐剂活性

[0044] 1、不同浓度Mn2+作用鸡脾脏细胞表达免疫相关基因的检测

[0045] 为了体外验证Mn对鸡的原代细胞是否具有佐剂活性，取SPF鸡脾脏制备单个核细胞悬液，用含10％胎牛血清和1％青链霉素的1640培养基重悬至适宜浓度，12孔细胞培养板6
每孔铺设10×10 个细胞。称取适量MnCl2·4H2O，用培养基溶解并稀释，以不同浓度加至细胞孔内并混匀，使孔内Mn形成浓度梯度(单位：μg/mL)：0，2.5、12.5、25、50、100。铺好的细胞板放置37℃、5％CO2培养箱作用12小时后，收集细胞，使用TRIpure Reagent试剂盒(Aidlab Biotechnologies Co.,Ltd，RN01)提取总RNA，利用荧光定量PCR(ChamQ SYBR qPCRMaster Mix,Vazyme,Q311)检测TNF‑α、IL‑1β、IL‑6的相对表达量。每个反应体系20μL，其中包含10μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，0.4μL的上下游引物(见表1)，2μL的cDNA和7.4μL的ddH2O。反应程序为：95℃预变性30秒；循环反应(95℃10秒，60℃30秒，循环40次)；溶解曲线采集(95℃15秒，60℃1分钟)。

[0046] 表1

[0047]

[0048] 结果如图1A所示，不同浓度的Mn刺激细胞分泌细胞因子水平有明显差异，与其它的浓度相比，当Mn浓度为25μg/mL时，炎症因子TNF‑α、IL‑1β、IL‑6基因表达量显著增加(p<0.01)。实验结果说明Mn对鸡原代细胞刺激呈现一定的剂量依赖关系，其中Mn浓度为25μg/mL，作用效果最佳，提示Mn体外刺激鸡的细胞具有佐剂活性。

[0049] 2、TDB和Mn2+联合作用鸡脾脏细胞表达免疫相关基因的检测

[0050] 为了体外验证Mn联合TDB对鸡的原代细胞是否具有佐剂活性，用异丙醇溶解TDB，取100μL浓度分别为2.5μg/mL、5.0μg/mL、12.5μg/mL的TDB溶液均匀包被至12孔细胞培养板底部，晾干。取SPF鸡外周血和脾脏制备单个核细胞悬液，用含10％胎牛血清和1％青链霉素6
的1640培养基重悬至适宜浓度，以10×10个细胞每孔铺到上述12孔板内，补加含Mn(25μg/mL)的培养基，设置单独处理和联合处理孔，混匀。铺好的细胞板放置37℃、5％CO2培养箱刺激12小时后，收集细胞提取总RNA，利用荧光定量PCR检测TNF‑α、IL‑1β、IL‑6的相对表达量。

[0051] 结果如图1B所示，根据上述Mn最佳浓度(25μg/mL)，联合不同TDB浓度作用鸡的脾脏细胞结果说明Mn:TDB为5时，TNF‑α、IL‑1β、IL‑6的相对表达量最高。各组最佳浓度对比结果如图1C所示，与单独Mn组(25μg/mL)和TDB组(5.0μg/mL)相比，TDB+Mn组(Mn:TDB＝5)的TNF‑α、IL‑1β、IL‑6基因表达量显著上升(P<0.05)。实验结果提示Mn可以协同增强TDB的佐剂活性。

[0052] 实施例2：DDA‑TDB‑Mn联合灭活禽流感病毒疫苗复合体的制备

[0053] 1、薄膜水化法制备DDA‑TDB‑Mn复合佐剂

[0054] 取适量有机溶剂甲醇‑氯仿溶液(体积比1:9)溶解DDA和TDB，按照DDA与TDB的质量比为5:1加至西林瓶内，充分溶解混匀，置于通风橱内过夜风干，在瓶底部形成一层均匀脂质薄膜。加入1～3mL PBS缓冲液，置于60℃水化20分钟，其中，每隔5分钟涡旋1分钟，最后于60℃水浴中进行3次超声，每次1分钟，得到脂质体佐剂，其中TDB浓度为0.5mg/mL，DDA浓度为2.5mg/mL，置于4℃储存备用，命名为DDA‑TDB。称取适量MnCl2·4H2O至PBS中，在室温下充
2+
分溶解，Mn 浓度为2.5mg/mL，然后再与DDA‑TDB充分混匀，得到DDA‑TDB‑Mn复合佐剂。

[0055] 2甲醛灭活法制备疫苗免疫原

[0056] 将甲醛与PBS按照1:50的比例进行稀释，病毒尿囊液与稀释后甲醛溶液按照43:7的比例滴加混匀，并置于4℃过夜。第二天取出置于37℃细菌摇床，振荡孵育12小时。将得到灭活的病毒液接种SPF鸡胚，第4天收集鸡胚尿囊液做血凝试验检测，没有凝血则表示灭活完全。灭活病毒通过BCA蛋白浓度检测试剂盒检测浓度。

[0057] 3疫苗组合物的制备及其体外表征

[0058] 3.1将DDA‑TDB和DDA‑TDB‑Mn复合佐剂分别与A/chicken/Guangdong/GD15/2016株(专利号：CN117886901A)H7N9灭活病毒按照比例1:1充分混匀，使H7N9灭活病毒的终浓度为0.2mg/mL，得到的疫苗组合物分别命名为DDA‑TDB+H7N9 WIV和DDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV，没有加佐剂的命名为H7N9WIV。

[0059] 3.2吸取适量H7N9 WIV或DDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV，分别滴加至铜网，经1％磷钨酸负染1～2分钟，室内干燥后，通过TEM透射电镜(Tecnai 12)观察形态并拍照。如图2A(H7N9 WIV)和B(DDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV)所示，DDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV复合佐剂包裹疫苗免疫原后依然保持完整的囊泡形态。

[0060] 3.3吸取0.1mLH7N9 WIV或DDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV，分别加入至粒径和电位样品池内，分别加入0.9mLPBS缓冲液进行10倍稀释，充分混匀后，在室温条件下，通过马尔文粒度分析仪检测。如图2C和D所示，H7N9 WIV的粒径均值为200nm，Zeta电位均值为‑5mV；DDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV的粒径均值为800nm，Zeta电位均值为45mV。

[0061] 实施例3：免疫原性分析

[0062] 1实验分组

[0063] 将21日龄SPF鸡(购自勃林格殷格翰维通生物技术有限公司)随机分为4组，每组25只。第1组为PBS对照组，经皮下注射100μL和滴鼻免疫100μL PBS；第2组为H7N9 WIV组，经皮下注射100μL和滴鼻免疫100μL H7N9灭活病毒；第3组为DDA‑TDB+H7N9 WIV组，经皮下注射100μL和滴鼻免疫100μL DDA‑TDB+H7N9WIV；第4组为DDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV组，经皮下注射
100μL和滴鼻免疫100μLDDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV。初次免疫后间隔14天，以同等剂量和接种途径进行加强免疫。

[0064] 2血凝抑制试验(HI)检测血清抗体水平

[0065] 为了评价复合佐剂在鸡体液免疫应答中发挥的作用，分别于初次免疫后第7天、14天、21天，采集每组鸡翅静脉外周血，取血清进行HI抗体检测。血凝板中每孔加入25μLPBS，吸取25μL血清从第1孔稀释至第11孔，弃去25μL血清并于第12孔补加25μLPBS。第1～10孔中加入25μL四单位抗原，第11、12孔补加25μLPBS，室温作用30分钟后，加入25μL 1％鸡红细胞悬液，并于室温作用30分钟，进行结果判定，凝血表示无效价，未凝血表示有效价。结果如图3所示，与DDA‑TDB+H7N9 WIV组相比，DDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV组血清抗体水平显著提高，说明TDB联合Mn复合佐剂能够辅助疫苗免疫原，显著增强免疫鸡的体液免疫应答水平。

[0066] 3鸡免疫组织器官中T细胞亚型的变化

[0067] 在加强免疫后第7天，采集各组鸡脾脏、肺脏和外周血，并制备单个核细胞，分别取6
2×10个细胞，用鼠抗鸡CD45、CD3、CD4、CD8、TCRγδ、CD25、流式抗体进行流式染色，通过流+ +
式细胞仪检测鸡T细胞中CD4T细胞和CD8T细胞的绝对数。按照图4中的设门策略对流式数据进行分析，分析鸡脾脏和肺脏中T细胞的绝对数。图5的结果显示，与DDA‑TDB+H7N9 WI组+ +
相比，DDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV组CD4T细胞和CD8T细胞的绝对数明显升高，且差异极显著(P<+ +
0.05)。实验结果说明TDB联合Mn复合佐剂的加入能促进CD4 T细胞、CD8 T细胞比例增殖分+ +
化，促进机体和细胞免疫应答反应，产生更高比例的CD4T细胞和CD8T细胞。

[0068] 4酶联免疫斑点试验(ELISpot)检测鸡脾脏细胞IFN‑γ分泌水平

[0069] 加强免疫后第7天，取各组鸡脾脏制备单个核细胞。将鸡IFN‑γ抗体(0.5μg/ml)包被至MultiScreenTM‑IP 96孔板(Millipore，MSIPN4W50)，4℃条件下孵育过夜；使用无菌的5
PBS洗涤2次，在37℃、5％CO2条件下进行封闭1小时；加入被检测的细胞((2×10/孔)，再补加灭活毒、阳性肽(专利号：CN117886901A)等刺激物，终浓度为10μg/ml，37℃、5％CO2条件下培养24‑48小时后PBST洗涤5次，加入生物素标记的鸡IFN‑γ抗体(0.5μg/ml)室温孵育1小时后；加入碱性磷酸酶标记的链亲和素Streptavidin ALP(Mabtech，3310‑10‑1000)室温孵育1小时后PBST洗涤5次，最后加入BCIP/NBT‑plus forALP底物溶液(Mabtech，3650‑10)避光孵育10分钟，在细胞因子出现的位置形成蓝黑色的斑点，每个斑点代表单个分泌IFN‑γ的细胞。最后用ELISpot分析仪扫描并分析计算每孔斑点数目。

[0070] 上述阳性肽为具有免疫原性的单一表位多肽P4、P10、P12、P15(专利号：CN117886901A)，用其刺激疫苗免疫的SPF鸡脾脏细胞后，DDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV组的鸡T细胞IFN‑γ的分泌水平显著高于DDA‑TDB+H7N9 WIV组(p<0.001)(图6B)，实验结果说明，与DDA‑TDB+H7N9 WIV组相比，DDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV组诱导出更强的HA特异性细胞免疫应答。
IFN‑γELISPOT检测结果的代表图如图6A所示。

[0071] 实施例4：攻毒保护实验

[0072] 1攻毒后临床症状和存活率

[0073] 将实施例3中的实验鸡在加强免疫后的第14天进行攻毒，经鼻腔以200μL 5.0
10 EID50剂量接种高致病性H7N9禽流感病毒(A/chicken/Guangdong/GD15/2016)，并进行
14天的临床症状(如眼肿流泪、精神沉郁、炸毛、脚鳞出血和鸡冠发紫等症状)评分与存活率记录。结果如图7和8所示，DDA‑TDB+H7N9 WIV+GD15组和DDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV+GD15组临床评分显著低于H7N9 WIV+GD15组和PBS+GD15组，并且，DDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV+GD15组临床评分显著低于DDA‑TDB+H7N9 WIV+GD15组。DDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV+GD15组和PBS组的存活率为
100％，显著高于DDA‑TDB+H7N9 WIV+GD15组和H7N9 WIV+GD15组和PBS+GD15，而H7N9 WIV+GD15组和PBS+GD15组的存活率为0，DDA‑TDB+H7N9WIV+GD15组的存活率为90％(见图8)。以上结果说明TDB联合Mn佐剂的加入能够有效抵抗H7N9亚型禽流感病毒致死性攻击并且，Mn可以协同增强TDB联合疫苗的保护力。

[0074] 2攻毒后鸡肺脏组织的病毒载量变化

[0075] 攻毒后第4天，采集各组鸡肺脏组织，称取0.1g组织，加入1～2mLPBS并进行充分研磨，反复冻融3次，经800g离心1分钟，取上清，经0.22μm滤膜过滤，用PBS进行连续10倍稀释并接种于9日龄SPF鸡胚，于37℃孵化机内孵育48小时，其中，24小时内死亡的鸡胚判定为非特异性死亡，排除死鸡胚后，收集活鸡胚尿囊液，进行血凝效价测定。血凝板中每孔加入25μLPBS，吸取25μL鸡胚尿囊液从第1孔稀释至第11孔，充分混匀后，弃去25μL混合液，第12孔补加25μLPBS；每孔加入25μL 1％鸡红细胞悬液，于37℃作用30分钟，进行结果判定，按照Reed‑Muench法计算EID50。其中未免疫的PBS组设置为对照组，如图9所示，与DDA‑TDB+H7N9 WI组相比，DDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV组病毒滴度显著降低。

[0076] 3攻毒后鸡肺脏组织的病理变化

[0077] 攻毒后第7天，采集各组鸡肺脏组织浸泡于组织固定液中，采用石蜡包埋、HE染色，制成切片后观察组织病变情况。如图10所示，DDA‑TDB+H7N9 WIV+GD15组和DDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV+GD15组病变程度均显著低于H7N9 WIV+GD15组和PBS+GD15组，并且，DDA‑TDB‑Mn+H7N9 WIV+GD15组病变程度均显著低于DDA‑TDB+H7N9 WIV+GD15组。PBS+GD15组和H7N9 WIV+GD15组均出现了明显的出血现象和大量炎性细胞浸润，呈现严重的肺部损伤。但是，DDA‑TDB‑Mn+H7N9WIV+GD15组攻毒的鸡肺脏组织形态较清晰、肺房、细支气管中仅有极少量的炎症细胞浸润。