[0001] 本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种噻替哌的质控方法及其杂质化合物。

[0002] 噻替哌(英语：ThioTEPA或thiotepa，又名塞替派、硫涕巴)，化学全称N,N',N”‑三亚乙基硫代磷酰胺，是一种用来治疗癌症的烷化剂，结构如下所示：

[0003]

[0004] 噻替哌为抗肿瘤化学药物，是乙烯亚胺类烷化剂的代表，对多种实体瘤均有效。作用原理类似氮芥，活性烷基化基团为在体内产生的乙烯亚胺基，是细胞周期非特异性药。实验研究证明其对多种肿瘤均有明显的抑制作用。该药物主要用于乳腺癌、卵巢癌、癌性体腔积液的腔内注射以及膀胱癌的局部灌注等，也可用于胃肠道肿瘤等。噻替哌最早由美国氰胺公司在1950年代初合成，并在1953年被报道。1960年代人们开始使用这种药物至今。噻替哌分别在2007年1月29日和2007年4月2日被欧洲药品管理局(EMA)和美国食品药品监督管理局(FDA)认证为骨髓干细胞移植前的可选孤儿药之一。目前此用途的噻替哌主要由意大利公司ADIENNE Pharma&Biotech以“TEPADINA”的商标名生产。2024年3月19日，国家药品监督管理局(NMPA)发布公告，批准恒瑞医药的旗下产品 (中英文通用名：注射用噻替哌/Thiotepa for Injection)在国内上市，首个适应症为儿童重型β‑地贫(＜18周岁)异基因造血干细胞移植(allo‑HSCT)的预处理治疗，是国内首个获批移植预处理相关适应症的噻替哌产品，切实惠及中国儿童重型β‑地贫患者。

[0005] 对于噻替哌原料药及制剂的有关物质研究罕有文献报道。在各国药典中，欧洲药典未收载该药物；日本药典曾在版本16中收载该药物，但并未收载有关物质检测项目；中国药典收载该药物但并未收载有关物质检测项目。仅美国药典收载有关物质检测项目，但只收载了一个杂质“噻替哌氯乙基类似物”，结构如下所示：

[0006]

[0007] 噻替哌作为国内外已上市并广泛应用的药品，目前很少有报道其相关工艺杂质及中间体杂质的合成(相关常见杂质见图1)。杂质研究是药物研发过程中的一项重要内容，特别是中间体的杂质，若不能有效识别药物合成过程中中间体所携带的杂质，这些杂质会随着化学反应进入药品的活性药物成分(API)中，或被衍生化进入药品的API中，最终会影响药品的质量，有可能还会对患者的身体健康带来巨大的影响。

[0008] 因此，十分有必要对噻替哌制备过程中杂质的合成工艺开展进一步的研究，使相关杂质拥有标准对照品，在后续制备噻替哌相关药物时能有效识别药物中间体杂质，并对其含量进行准确控制，这对控制药物质量有着重要的意义。

[0124] 本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了一种噻替哌的质控方法及其杂质化合物。所述质控方法解决了现有噻替派合成工艺中容易产生对噻替派产品的质量产生关键性影响的杂质问题，大大提高了药物质量，进一步保证了患者的用药安全。在此基础上完成了本发明。

[0125] 术语

[0126] 除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。

[0127] 如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

[0128] 如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

[0129] 如本文所用，术语“室温”或“常温”是指温度为4‑40℃，较佳地，25±5℃。

[0130] 如本文所用，术语“化合物2”和“乙撑亚胺”可互换使用，均指具有如下式所示结构的化合物。

[0131]

[0132] 如本文所用，术语“杂质化合物3”、“化合物3”和“杂质3”可互换使用，均指结构如所示的化合物。

[0133] 如本文所用，术语“杂质化合物4”、“化合物4”和“杂质4”可互换使用，均指结构如所示的化合物。

[0134] 如本文所用，术语“杂质化合物5”、“化合物5”和“杂质5”可互换使用，均指结构如所示的化合物。

[0135] 如本文所用，术语“噻替哌化合物6”、“化合物6”和“噻替哌6”可互换使用，均指结构如 所示的化合物。

[0136] 如本文所用，术语“杂质化合物7”、“化合物7”和“杂质7”可互换使用，均指结构如所示的化合物。

[0137] 如本文所用，术语“TLC”是指薄层色谱。

[0138] 如本文所用，术语“TEA”是指三乙胺。

[0139] 如本文所用，术语“PE”是指石油醚。

[0140] 如本文所用，术语“DCM”是指二氯甲烷。

[0141] 如本文所用，术语“EtOAc”是指乙酸乙酯。

[0142] 本发明的主要优点包括：

[0143] 本发明提供了三种结构式的杂质化合物和4个杂质化合物，其可以独立或者任意组合作为对照品用于噻替派合成工艺的质量控制中，对控制产品质量，保证用药安全具有重要意义。

[0144] 下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

[0145] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

[0146] 通用实施方式

[0147] 化合物1的制备

[0148]

[0149] 取硫磺粉196g，无水三氯化铝18g，放到3000mL烧瓶中，烧瓶上装回流冷凝管，加入三氯化磷(PCl3)500mL。反应液立即剧烈沸腾，迅速用冰水浴冷却。至沸腾停止，硫磺粉全部溶解。移去冰水浴，换水浴加热95℃，继续反应2h，冷却后，用冰水洗两次。分出乳色液体。用无水氯化钙干燥。蒸馏bp.124‑126℃，产率86％。

[0150] 化合物2乙撑亚胺的制备

[0151]

[0152] 将100mL硫酸(102.9g，1.05mol)的水溶液缓慢的加入装有60mL乙醇胺(61.1g，1.0mol)的水溶液的反应瓶中。当硫酸水溶液全部加入其中之后，在100℃下经过减压蒸馏除去其中的水分，直至浓缩形成固体。此时固体产物是乙醇胺硫酸酯。待冷却到室温，向乙醇胺硫酸酯中加入233mL质量分数为30％的NaOH溶液并加热至100℃反应3h将其水解得到溶液。接着在120℃下将该溶液经过蒸馏得到乙撑亚胺和蒸馏水的混合物。之后将NaOH颗粒加入到该混合溶液中，经过萃取并通过氢化钙得到纯净的乙撑亚胺(35.1g,产率81.5％)，该原料不稳定，需要低温保存。

[0153] 实施例1化合物3和化合物4的合成

[0154]

[0155] 称取化合物1(3.39g,20mmol,1.0equiv.)加入50mL史莱克管中，量取二氯甲烷20mL置于瓶中，磁力搅拌，放入低温搅拌器中降温至‑40℃，瓶口密封并用氮气保护，然后用注射器向其中逐滴缓慢的加入三乙胺(4.45g,44mmol,2.2equiv.)，最后向反应瓶中加入原料2(1.72g,40mmol,2.0equiv)，保温反应2h。通过TLC(石油醚：二氯甲烷＝2:1的混合溶剂作为展开剂)监控反应。

[0156] TLC检测到原料点消失，反应液中产生了两个新的产物点。使用旋转蒸发仪蒸除溶剂二氯甲烷，得到透明状液体，再经柱层析分离纯化(PE：CH2Cl2＝8:1)，得到杂质化合物3(0.445g,产率：12.2％)和杂质化合物4(0.317g,产率；10.1％)。

[0157] 杂质化合物3：

[0158] 1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)＝2.41(s,4H),2.35(s,4H).

[0159] 13C NMR(151MHz,CDCl3):δ(ppm)＝27.40,27.34.

[0160] 杂质化合物4：

[0161] 1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)＝4.59(s,4H),3.75(t,J＝5.5Hz,2H),3.61(dq,J＝17.9,J＝5.9Hz,2H).

[0162] 13C NMR(151MHz,CDCl3):δ(ppm)＝45.23,45.21,43.94,43.88.

[0163] 实施例2杂质化合物5的合成

[0164]

[0165] 将实施例1中得到的化合物3作为原料，以二氯甲烷作为反应溶剂，加入等当量的乙醇胺，常温反应2h后，点板检测原料基本反应完全，分离纯化得到杂质化合物5，产率为78.5％。

[0166] 杂质化合物5：

[0167] 1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)＝3.73‑3.66(m,2H),3.62‑3.51(m,3H),3.31‑3.23(m,2H),2.07‑2.01(m,4H),1.96‑1.89(m,4H).

[0168] 13C NMR(151MHz,CDCl3):δ(ppm)＝63.49,63,47,44.17,44.14,24.06,24.02.[0169] [M+H+]+(ESI):m/z＝208.25

[0170] 实施例3化合物5的合成

[0171]

[0172] 在‑40℃的条件下，二氯甲烷(40mL)作为反应溶剂加入史莱克管中，反应瓶中充入氮气保护，然后用注射器依次分别加入化合物1(3.39g,20mmol,1equiv.)、三乙胺(4.45g,44mmol,2.2equiv.)、化合物2(1.72g,40mmol,2equiv.)，低温反应2h后，点板检测原料基本反应完全，将温度回升至0℃，然后向反应瓶中加入等当量的乙醇胺(1.22g,20mmol,
1equiv.)，TLC监测反应直至原料反应完全。将反应液用用饱和碳酸氢钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，粗品用柱层析分离纯化得到无色油状杂质化合物5(2.59g,产率：
62.5％)。

[0173] 实施例4化合物3的合成

[0174]

[0175] 称取化合物1(3.39g,20mmol,1equiv)加入100mL史莱克管中，量取二氯甲烷30mL置于瓶中，磁力搅拌，放入低温搅拌器中降温至‑40℃，瓶口密封并用氮气保护，然后用注射器向其中逐滴缓慢的加入三乙胺(6.68g,66mmol,3.3equiv)，最后在向反应瓶中加入化合物2(2.58g,60mmol,3equiv.)，保温反应2h。通过TLC监控反应，检测到原料基本反应完全，产生两个产物点分别为化合物3和噻替哌6，使用旋转蒸发仪蒸除溶剂二氯甲烷，然后将处理后的混合物经过柱层析分离纯化(PE：EtOAc＝8:1)得到化合物6噻替哌(0.783g,产率：20.7％)和杂质化合物3(0.712g,产率：19.5％)。

[0176] 化合物6

[0177] 1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)＝＝2.13(d,J＝16.6Hz,12H).

[0178] 13C NMR(151MHz,CDCl3):δ(ppm)＝24.30,24.23.

[0179] 实施例5杂质化合物4和杂质化合物7的合成

[0180]

[0181] 称取化合物1(3.39g,20mmol,1.0equiv.)加入50mL史莱克管中，量取二氯甲烷20mL置于瓶中，磁力搅拌，放入低温搅拌器中降温至‑40℃，瓶口密封并用氮气保护，然后用注射器向其中逐滴缓慢的加入三乙胺(2.23g,22mmol,1.1equiv.)，最后向反应瓶中加入原料2(0.86g,20mmol,1.0equiv)，保温反应2h。通过TLC(石油醚：二氯甲烷＝2:1的混合溶剂作为展开剂)监控反应，检测到原料基本反应完全，产生两个产物点分别为杂质4和杂质7。
使用旋转蒸发仪蒸除溶剂二氯甲烷，然后将处理后的混合物经过柱层析分离纯化(PE：
CH2Cl2＝20:1)得到杂质化合物7(0.535g,产率：15.2％)和杂质化合物4(0.423g,产率：
13.1％)。

[0182] 化合物7：

[0183] 1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)＝2.57(s,2H),2.51(s,2H)..

[0184] 13C NMR(151MHz,CDCl3):δ(ppm)＝30.13,30.05.

[0185] 化合物结构一览表

[0186]

[0187] 实施例6杂质化合物5高效液相检测方法

[0188] 6.1.仪器与设备

[0189] 安捷伦1260Infinity II液相色谱仪系统；

[0190] 安捷伦InfinityLab poroshell 120EC‑C18色谱柱(规格：4.6*100mm，2.7μm)；

[0191] 十万分之一电子天平(SECURA225D‑1CN型，Sartorius)；

[0192] 乙腈为HPLC级，水为去离子水。

[0193] 6.2.色谱条件

[0194] 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(InfinityLab poroshell 120EC‑C18，4.6*100mm，2.7μm)；

[0195] 去离子水为流动相A，乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

[0196] 表1梯度洗脱条件

[0197]

[0198]

[0199] 检测波长为210nm；流速为每分钟0.8mL；柱温为30℃；进样体积2μL。

[0200] 6.3.样品配制

[0201] 称取3.481mg的自制杂质5置于10mL容量瓶中，加流动相B溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

[0202] 6.4结果分析

[0203] 杂质化合物5的分析测试色谱图见图8，具体数据见下表2，其保留时间为7.542分钟，峰面积为7280.56738，峰形对称，能很好地通过HPLC进行分析检测。

[0204] 表2杂质化合物5的液相色谱数据

[0205]

[0206] 实施例7杂质3，杂质5和噻替哌6高效液相检测方法

[0207] 7.1仪器与设备

[0208] 安捷伦1260Infinity II液相色谱仪系统；

[0209] 安捷伦InfinityLab poroshell 120EC‑C18色谱柱(规格：4.6*100mm，2.7μm)；

[0210] 十万分之一电子天平(SECURA225D‑1CN型，Sartorius)；

[0211] 乙腈为HPLC级，水为去离子水。

[0212] 7.2色谱条件

[0213] 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(InfinityLab poroshell 120EC‑C18，4.6*100mm，2.7μm)；

[0214] 去离子水为流动相A，乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

[0215] 表3梯度洗脱条件

[0216]时间(分钟) 水 乙腈
0 95％ 5％
10 5％ 95％
15 5％ 95％

[0217] 检测波长为210nm；流速为每分钟0.8mL；柱温为30℃；进样体积2μL。

[0218] 7.3样品配制

[0219] 称取3.785mg的自制杂质3、35.633mg的自制噻替哌6和3.282mg的自制杂质5置于100mL容量瓶中，加流动相B溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

[0220] 6.4结果分析

[0221] 杂质3，杂质5和噻替哌6的分析测试色谱图见图13，具体数据见下表4，杂质3的保留时间为9.341分钟，峰面积为644.72687；噻替哌6的保留时间为11.216分钟，峰面积为11638.8；杂质5的保留时间为12.079分钟，峰面积为961.78644，三个化合物峰形对称，都能很好地通过HPLC进行分析检测。

[0222] 表4杂质3、5和噻替哌6的液相色谱数据

[0223]

[0224] 总量：1.32453e42099.58110

[0225] 实施例8杂质4和噻替哌6高效液相检测方法

[0226] 8.1仪器与设备

[0227] 安捷伦1260Infinity II液相色谱仪系统；

[0228] 安捷伦InfinityLab poroshell 120EC‑C18色谱柱(规格：4.6*100mm，2.7μm)；

[0229] 十万分之一电子天平(SECURA225D‑1CN型，Sartorius)；

[0230] 乙腈为HPLC级，水为去离子水。

[0231] 8.2色谱条件

[0232] 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(InfinityLab poroshe1l 120EC‑C18，4.6*100mm，2.7μm)；

[0233] 去离子水为流动相A，乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

[0234] 表5梯度洗脱条件

[0235] 时间(分钟) 水 乙腈0 95％ 5％
7 5％ 95％
10 5％ 95％

[0236] 检测波长为210nm；流速为每分钟0.8mL；柱温为30℃；进样体积2μL。

[0237] 8.3样品配制

[0238] 称取6.528mg的自制杂质4和18.723mg的自制噻替哌6置于100mL容量瓶中，加流动相B溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

[0239] 8.4结果分析

[0240] 杂质4和噻替哌6的分析测试色谱图见图14，具体数据见下表6，杂质4的保留时间为6.677分钟，峰面积为823.28589；噻替哌6的保留时间为7.198分钟，峰面积为5438.32373；两个化合物峰形对称，都能很好地通过HPLC进行分析检测。

[0241] 表6杂质4和噻替哌6的液相色谱数据

[0242]

[0243] 总量：6415.04307 1164.21264

[0244] 实施例9噻替哌6高效液相检测方法

[0245] 9.1仪器与设备

[0246] 安捷伦1260Infinity II液相色谱仪系统；

[0247] 安捷伦InfinityLab poroshe11120EC‑C18色谱柱(规格：4.6*100mm，2.7μm)；

[0248] 十万分之一电子天平(SECURA225D‑1CN型，Sartorius)；

[0249] 乙腈为HPLC级，水为去离子水。

[0250] 9.2色谱条件

[0251] 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(InfinityLab poroshell 120EC‑C18，4.6*100mm，2.7μm)；

[0252] 去离子水为流动相A，乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

[0253] 表7梯度洗脱条件

[0254]时间(分钟) 水 乙腈
0 95％ 5％
7 5％ 95％
10 5％ 95％

[0255] 检测波长为210nm；流速为每分钟0.8mL；柱温为30℃；进样体积2μL。

[0256] 9.3样品配制

[0257] 称取6.573mg的自制噻替哌6置于100mL容量瓶中，加流动相B溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

[0258] 9.4结果分析

[0259] 噻替哌6的分析测试色谱图见图15，具体数据见下表8，噻替哌6保留时间为7.200分钟，峰面积为1716.06360；化合物峰形对称，能很好地通过HPLC进行分析检测。

[0260] 表8噻替哌6的液相色谱数据

[0261]

[0262] 总量：1749.07432 322.06625

[0263] 实施例10杂质4高效液相检测方法

[0264] 10.1仪器与设备

[0265] 安捷伦1260Infinity II液相色谱仪系统；

[0266] 安捷伦InfinityLab poroshell 120EC‑C18色谱柱(规格：4.6*100mm，2.7μm)；

[0267] 十万分之一电子天平(SECURA225D‑1CN型，Sartorius)；

[0268] 乙腈为HPLC级，水为去离子水。

[0269] 10.2色谱条件

[0270] 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(InfinityLab poroshell 120EC‑C18，4.6*100mm，2.7μm)；

[0271] 去离子水为流动相A，乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

[0272] 表9梯度洗脱条件

[0273]时间(分钟) 水 乙腈
0 95％ 5％
7 5％ 95％
10 5％ 95％

[0274] 检测波长为210nm；流速为每分钟0.8mL；柱温为30℃；进样体积2μL。

[0275] 10.3样品配制

[0276] 称取42.618mg的自制杂质4置于100mL容量瓶中，加流动相B溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

[0277] 10.4结果分析

[0278] 杂质4的分析测试色谱图见图16，具体数据见下表10，杂质4保留时间为6.664分钟，峰面积为10548.6；化合物峰形对称，能很好地通过HPLC进行分析检测。

[0279] 表10杂质4的液相色谱数据

[0280]

[0281] 总量：1.06298e4 1837.26563

[0282] 综上所述，本申请所述的液相检测方法对塞替哌中多种杂质化合物均具有很好的分离度，可应用于工业生产中提高塞替哌的纯度，改善药物质量。

[0283] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。