[0001] 本发明属于药物载体合成技术领域，涉及一种pH/GSH双响应型Fe基MOF药物载体及其合成方法和应用。

[0002] 几十年来，癌症一直威胁着人类的身体健康，研究者们一直在不断创新癌症的治疗方法。肿瘤细胞微环境具有的微酸性、谷胱甘肽（GSH）过表达和高活性氧（ROS）等特点为环境响应型纳米药物传递系统提供了新的治疗思路。另外铁死亡是一种细胞内的程序性死亡方式，其通过不断累积铁元素，致使细胞内部的脂质被不断氧化为具有细胞毒性的脂质过氧化物，最终在细胞膜出现损伤后，导致细胞破裂死亡。基于上述机理，研究人员通过引入不同的敏感基团以响应不同的环境刺激，并结合铁死亡的作用机制设计制备所需的纳米药物，以达到抑制或者杀死肿瘤细胞的目的。

[0003] 目前，研究者们已经开发了许多Fe基MOFs纳米材料通过抑制或消耗过表达的GSH（在癌细胞中浓度高达10 mmol/L）来间接灭活GPX4酶来诱导铁死亡。例如，一些基于MnO2的纳米材料也被报道具有消耗细胞内抗氧化剂GSH以增强ROS诱导的肿瘤治疗的能力。另一方面，GSH的缺乏还会加强ROS相关的治疗，如放射治疗、化学治疗和光动力学治疗(PDT)，它会消耗具有细胞毒性的ROS来维持体内的稳态。Meng等人开发了一种负载Ce6的谷胱甘肽消耗型MOF，它可以通过二硫‑硫醇交换反应导致细胞内GSH耗竭，从而与PDT治疗的抗肿瘤作用相互协同。单一的治疗手段往往起不到非常好的疗效，存在一定的局限性，同时，铁死亡治疗的疗效仍可能受到肿瘤组织中内源性 H2O2供应不足的限制。将程序性细胞死亡和细胞凋亡结合提供了一种有前途的治疗方式， 可以显著提高抗癌治疗的治疗效果。因此需要开发一种新的通过降低GSH同时增加ROS含量放大铁死亡治疗的纳米平台，形成铁死亡、化疗、饥饿治疗的三联协同治疗策略。

[0033] 下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场采购获得的常规产品。

[0034] 下述实施例中，小鼠正常细胞L929细胞购自中国典型培养物保藏中心（保藏号：GDC0034）；4T1细胞购自宁波明舟生物科技有限公司。

[0035] 实施例1：pH/GSH双响应型Fe基MOF药物载体的合成本实施例中合成了Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG，具体步骤如下所示：
（1） Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑) MOF的合成：
精确称量1.00 g FeCl3·6 H2O和1.00 g 3,3’‑二硫代二丙酸溶解在含有50 mL DMF和1 mL TEA的烧杯中，持续超声5分钟，然后将烧杯内的混合物转移至置于100 mL水热釜中，在120℃条件下以连续反应24小时。反应结束等待混合体系恢复室温后，在12 000 rpm下离心并使用DMF与超纯水分别洗涤3次，真空干燥后得到最终的空白纳米颗粒Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑) MOF，收集备用。

[0036] 图2为Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑) MOF的SEM图，从图中可以看出，所合成的纳米粒子呈现出长方形的方片结构，粒径约为长200nm，宽50 nm左右的均匀尺寸。通过动态光散射法测定其纳米粒子水溶液的平均粒径为143.30 nm（PDI=0.278），表明所合成的Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)MOF纳米粒子具有作为药物载体较为合适的纳米尺寸。

[0037] 图3为Fe基MOF的N2吸脱附曲线和粒径分布图，从图中可以看出，Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑2 ‑1 3 ‑1
SS‑)MOF的比表面积、孔体积和平均孔径分别为24.93 m g 、0.106 cmg 和17.61 nm。因此，以介孔为主要孔道结构的Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)MOF具有一定的载药能力，可以作为抗癌药物的载体。

[0038] （2） Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX的合成：为了将药物载入Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑) MOF空隙中，将DOX水溶液(1 mg/mL)在超声状态下缓慢滴入Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑) MOF水溶液中，在室温暗条件下连续搅拌24 h，将混合溶液离心(12 000 rpm, 15 min)，并用蒸馏水反复洗去未负载成功的DOX，干燥后得到载药纳米Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX。采集离心后的所有上清液，在480 nm处测定其紫外吸光度，采用紫外‑可见光谱标准曲线法计算DOX的载药量(DLC)和包封率(EE)。

[0039] 从图4可以看出，Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX的XPS全扫描光谱显示有5个主要峰值，分别为163、285、400、531和712 eV，对应于S 2p、C 1s、N 1s、O 1s和Fe 2p。相比于空白Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑) MOF的XPS全谱，DOX中含有的N元素首次出现在Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX全谱中，初步证实DOX的成功负载（图4a）。同时在红外对比谱图（图4b）中出现了DOX的特征峰，紫外对比谱图（图4c）也在480 nm处出现了代表DOX的吸收峰，进一步证明了DOX的成功负载。图4d在整体角度范围内Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX的整体峰型未发生太大改变，说明药物DOX的载入过程不会破坏载药材料的晶体结构。

[0040] 本步骤还探究了Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑) MOF材料的载药能力，以不同MOF:DOX的投药比设计实验，通过收集不同条件下制备的Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX离心后的上清液，使用紫外标准曲线测定并计算不同比例投药比下的载药量（DLC）与载药效率（EE），探究所合成材料的最佳投料比，结果如图5所示。从图5中可以看出，增加DOX投入含量后，DLC逐步上升，但是EE在超过1:1后处于下降趋势。结合EE数据并考虑合成经济成本，MOF:DOX比例在1:1左右，载药条件最优。因此，选用MOF:DOX=1:1的Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX完成剩余实验，Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX的DLC为28.08%，EE为39.15%。

[0041] （3）Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG的合成：本步骤采用自组装法合成Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG纳米颗粒，具体包括：将过量mPEG‑NH2加入Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)的水溶液中，在25℃下连续搅拌反应24 h，反应后的混合物用蒸馏水透析过夜，冷冻干燥得到Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG纳米粒子。

[0042] 从图6a可以看出，PEG特征峰的出现证明了PEG的成功修饰；同时，Zeta电位的数值变化也可以证明成功修饰了PEG，并获得了结构更为稳定的Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG纳米载药复合材料（6b）。此外，Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG纳米粒子水溶液连续七天的粒径和PDI变化可以看出纳米载药连续一周内粒径和PDI的数值几乎保持不变，这说明该纳米载药材料具有良好的稳定性（6c）。

[0043] 实施例2：pH/GSH双响应型Fe基MOF药物载体的合成本实施例中合成了Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX@PEG‑GOx，具体步骤如下所示：
（1）mPEG‑GOx的合成：
将GOx (20.0 mg, 0.12 mmol)溶解于10 mL超纯水中，向其中加入EDC (10.0 mg, 
0.06 mmol)和NHS (7.0 mg, 0.06 mmol)，在25℃搅拌2小时，搅拌结束后向其中加入mPEG‑NH2(100 mg, 0.02 mmol)，然后在25℃下搅拌反应20小时，反应结束后将反应物转移到透析袋(MWCO 6000‑8000 Da)中，用蒸馏水透析过夜，然后冷冻干燥备用。

[0044] （2）RSSR的合成：将4,4'‑二硫代二丁酸(0.3778 g, 1.585 mmol)和N,N'‑羰基二咪唑(0.6333 g, 
3.906 mmol)溶解于40 mL无水二氯甲烷中，然后在40℃的氮气保护下蒸发8小时取残留物。
将残留物溶解于40 mL二氯甲烷中，用超纯水和碳酸钠(NaCO3)溶液(0.10 mol/L)反复洗涤，然后收集有机相并在无水硫酸钠(Na2SO4)中干燥，干燥结束后采用真空旋转蒸发法对二氯甲烷进行处理，真空干燥后得到沉淀相RSSR，作为含二硫敏感键的MOF有机配体RSSR。

[0045] （3）Fe(Ⅲ)‑RSSR MOF的合成：精确称量FeCl3(80.0 mg)溶解在10 mL DMF中形成溶液I，将RSSR (100.0 mg)溶解在20 mLDMF中形成溶液II。在超声条件下，将溶液I缓慢滴入装有溶液II和1mL TEA的烧杯中，持续超声5分钟，然后将烧杯置于磁搅拌器上，在室温下以350 rpm的速度搅拌24小时。在12000 rpm下离心得到最终的空白纳米颗粒Fe(Ⅲ)‑RSSR MOF，分别用DMF和乙醇洗涤
3次，真空干燥，收集备用。

[0046] 图2为Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑) MOF的SEM图，从图中可以看出，所合成的纳米粒子呈长方形片状结构，分散性较好，粒径为长100nm、宽50 nm左右的均匀尺寸。通过动态光散射法测定其纳米粒子水溶液的平均粒径为131.00 nm（PDI=0.121），表明Fe(Ⅲ)‑RSSRMOF纳米粒子具有作为药物载体较为合适的纳米尺寸，并有较好的稳定性。

[0047] 图3为Fe基MOF的N2吸脱附曲线和粒径分布图，从图中可以看出，Fe(Ⅲ)‑RSSRMOF2 ‑1 3 ‑1
的比表面积、孔体积和平均孔径分别达到51.34 mg 、0.277 cmg 和19.34 nm。因此，介孔Fe(Ⅲ)‑RSSRMOF有望具有有效的载药能力，可以作为抗癌药物的载体。

[0048] （4）Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX的合成：为了将药物纳入Fe(Ⅲ)‑RSSR MOF中，将DOX水溶液(1 mg/mL)在超声状态下缓慢滴入Fe(Ⅲ)‑RSSR MOF水溶液中，在室温暗条件下搅拌24 h，将混合溶液离心(12 000 rpm, 
15 min)，用蒸馏水反复洗涤，得到载药纳米Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX。采集上清液，采用紫外‑可见光谱法测定DOX的载药量(DLC)和包封率(EE)，并在480 nm处测定紫外吸光度。

[0049] 从图7可以看出，Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX的XPS全扫描光谱显示有5个主要峰值，分别为161、285、400、531和710 eV，对应于S 2p、C 1s、N 1s、O 1s和Fe 2p。相比于空白MOF的XPS全谱，DOX中独有的N元素出现在Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX全谱中，初步证实DOX的成功负载（7a）。红外谱图（图7b）中出现了DOX的特征峰，进一步证明了DOX的成功负载。此外，Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX复合材料的XRD图中可以看出，在整体角度范围内主要出峰位置均能达到很好的吻合，说明药物的载入过程基本不会破坏载药材料的晶体结构（图7c）。

[0050] 本步骤还探究了Fe(Ⅲ)‑RSSR MOF材料的载药能力，以不同MOF:DOX的投药比设计实验，通过收集不同条件下制备的Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX离心后的上清液，使用紫外标准曲线测定并计算不同比例投药比下的载药量（DLC）与载药效率（EE），探究所合成材料的最佳投料比，结果如图8所示。

[0051] 从图8中可以看出，增加DOX投入比例后，DLC逐步上升，但是由于MOF固定的孔道结构限制着其载药能力，在DOX的投入比例增加的过程中，DLC逐步趋于平稳。结合EE数据并考虑合成经济成本，选用MOF:DOX=1:3的Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX完成实验剩余测试，此时Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX的DLC为61.02%，EE为52.26%。

[0052] （5）Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX@PEG‑GOx的合成：本步骤采用自组装法合成Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX@PEG‑GOx纳米颗粒，具体包括：将过量PEG‑GOx加入Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX的水溶液中，在25℃下连续搅拌反应24 h，反应后的混合物用蒸馏水透析过夜，冷冻干燥得到Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX@PEG‑GOx纳米粒子。

[0053] 从图9a可以看出，PEG特征峰的出现证明了PEG的成功修饰；同时，Zeta电位的数值变化也可以证明成功修饰了PEG，并获得了结构更为稳定的Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG纳米载药复合材料（9b）。此外，Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG纳米粒子水溶液连续七天的粒径和PDI变化可以看出纳米载药连续一周内粒径和PDI的数值几乎保持不变，这说明该纳米载药材料具有良好的稳定性（9c）。

[0054] 实施例3：pH/GSH双响应型Fe基MOF药物载体具有响应性的药物释放行为研究本实施例分别探究了Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG和Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX@PEG‑GOx释放药物的能力，具体步骤为：将Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG和Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX@PEG‑GOx分别在ABS（0.1 M，pH 5.0）、含有10 mM GSH的ABS（0.1 M，pH 5.0）和PBS（0.1 M，pH 7.4）释放介质中的体外DOX，考察DOX的体外释放曲线，考察结果如图9所示。

[0055] 从图10a中可以看出，在酸性条件并添加GSH的条件下药物累积释放量显著增加。在酸性条件(pH 5.0)下，DOX的释放量略高于中性条件(pH 7.4)，连续72 h内药物释放量由
9.08%增加到38.68%，表明药物载体具有很好的pH响应性，这是Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG在酸性条件下配位键相互作用减弱所致。在10 mmol/L GSH溶液中，DOX在pH 5.0条件下连续72 h的释放量达90.24%，远高于不添加GSH时的38.68%，说明GSH的加入断裂了‑S‑S‑敏感键，特殊的骨架结构使Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG具有优异的pH/GSH响应性。由释药曲线可以分析出，整体释药过程较为缓慢而稳定，未出现药物的突释现象，可以缓解患者副作用。考虑到高GSH和微酸性的肿瘤微环境，具有pH/GSH双响应性的Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG可以在肿瘤部位高效释放DOX，减少给药次数并达到高效抑制肿瘤生长的目的。

[0056] 从图10b中可以看出，由于MOF结构的解体，在酸性条件并添加GSH的条件下药物释放显著增加。在酸性条件(pH 5.0)下，DOX的释放量略高于中性条件(pH 7.4)，连续48 h内药物释放量由20.11%增加到30.04%，表明药物具有pH响应性，这可能是由于Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX@PEG‑GOx在酸性条件下的配位作用减弱所致。在10 mmol/L GSH溶液中，DOX在pH 5.0条件下连续48 h的释放量达82.10%，远高于不加GSH时的30.04%。考虑到氧化还原和酸性的肿瘤微环境，RSSR@DOX@PEG‑GOx的pH/GSH双响应性释放DOX特性是实现肿瘤部位特异性释放的首选，大大提高了治疗效率。

[0057] 综上所述，体外模拟药物释放实验表现出突出的环境相应释放，且在酸性条件下和GSH条件下，药物能够快速定点释放，提高药物治疗效率。。

[0058] 实施例4：pH/GSH双响应型Fe基MOF药物载体激发铁死亡作用的验证2+
（1）Fe 的生成监测：
pH/GSH双响应型Fe基MOF药物载体骨架坍塌后，除了释放出内部包载的药物DOX，
3+ 3+
还会解离出作为金属活性参与配位的Fe 。此时，Fe 的作用就是被肿瘤内的高GSH还原为
2+
Fe ，大量消耗GSH以破坏氧化还原稳态，进而发生Fenton反应以快速激发铁死亡。

[0059] 邻菲罗啉能与Fe2+生成橙红色络合物本步骤通过测量邻菲罗啉显色后溶液的吸光2+
度来监测释药过程中生成的Fe ，监测结果如图11所示。

[0060] 从图11a中可以看出，在酸性条件(pH 5.0)下，72 h内近169.84 µg的Fe3+转化为了2+ 2+
Fe 。相比之下，在有 10 mM GSH的溶液中，Fe 的生成量由169.84 µg提升至1007.92 µg。
结合药物释放的规律分析，在pH 5.0的溶液中添加10 mmol/L GSH后，药物载体的结构崩塌
3+ 2+
使得Fe 高效释放并发生反应生成Fe 。这些结果表明，GSH能将Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@
3+ 2+
PEG响应性解离后，有效地将溶液中的Fe 转化为Fe 以发挥激发铁死亡的作用。

[0061] 从图11b可以看出，在酸性条件(pH 5.0)下，48 h内863.52 µg的Fe2+成功释放，12 2+ 2+
h后Fe 浓度略有升高，但变化不大。相比之下，在有10 mM GSH的溶液中，Fe 的生成量提升
3+
948.54 µg。这是因为在pH 5.0溶液中，药物载体的快速解离使得Fe 高效释放并发生还原。
3+ 2+
这些结果表明，GSH能有效地将MOF解离释放并将溶液中的Fe 转化为Fe 发挥治疗的作用。

[0062] 因此，肿瘤内高 GSH 含量（10 mmol/L）能与MOF的二硫键反应，还需要与 Fe3+反应2+ 3+ 2+
生成 Fe 。实验证明在 10 mmol/L GSH 含量下，有足量 Fe 可以被还原为 Fe ，为后续 Fenton反应发生提供基础。

[0063] （2）•OH的生成监测：2+
Fe 与肿瘤细胞中的内源性H2O2发生Fenton反应后生成的•OH，可以上调肿瘤细胞的ROS水平，促进有细胞毒性的脂质过氧化物累积并顺利激发铁死亡。作为芬顿反应的最终产物，本实施例可以通过•OH的生成来推断芬顿反应的顺利发生，测定结果如图12所示。

[0064] 从图12a中可以看出，在酸性条件(pH 5.0)下，72 h内有一部分•OH生成。相比之下，添加 10 mM GSH后，•OH的生成量大幅提升。这些结果表明，所合成的Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG可以有效地生成•OH。大量•OH的生成导致ROS上调，脂质过氧化物积累激发铁死亡，并抑制肿瘤生长。

[0065] 从图12b中可以看出，添加葡萄糖后的Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX@PEG‑GOx曲线显示出明显更高的TMB吸光度，表明反应过程中确实产生了大量•OH。这是因为Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX@PEG‑2+
GOx中含有的葡萄糖氧化酶定向催化所添加的葡萄糖发生分解并产生H2O2，最终与Fe 发生反应生成•OH。而且•OH是激发铁死亡最高效的活性氧成分，大量•OH的生成为铁死亡的发生提供物质基础，可以有效达到激发铁死亡并抑制肿瘤生长的目的。

[0066] 综上所述，通过监测•OH的大量生成表明Fenton反应的顺利发生。

[0067] 实施例5：细胞毒性及细胞内吞验证（1）细胞毒性验证：
本步骤用MTT方法分别检测了Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG和Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX@PEG‑GOx在加载药物前后的细胞活力及生存情况：活细胞线粒体可以使 MTT 还原为结晶甲臜（Formazan）沉积在细胞中，死细胞则不能，以此来考察Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG和Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX@PEG‑GOx的细胞毒性，具体步骤如下：
3
选用L929（ 小鼠成纤维细胞）和 4T1（乳腺癌细胞），将细胞浓度稀释为 5×10个/μL 分别接种于 96 孔板中，每孔 100 μL 1640 培养液（含酚红、 10%血清和 1%双抗），在培养箱（5%的 CO2、 37ºC）中培养 24 h。将培养基用吸引器小心移除，用含有不同浓度空白纳米粒子或载药纳米粒子的 100 μL 培养基替换。继续孵育48 h，移去培养基， PBS 冲洗三次，移入 MTT 溶液（100 μL，体积分数为 10%）。细胞在黑暗中孵育 4 h，用吸引器轻轻吸出液体，用 DMSO（150 μL）溶解后用迅速用酶标仪在 570 nm 波长下测量吸光度。用以下公式计算细胞存活率来评估载体的生物相容性以及载药胶束的细胞毒性。

[0068] Relative cell viability (%) = Asample‑A0/Acontrol‑A0×100在此公式中，A0表示空白的吸光度值，Acontrol表示对照组的吸光度值，Asample表示材料的吸光度值，检测结果如图13和14所示。

[0069] 从图13中可以看出，当空白的Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑) MOF浓度达到125 μg/mL，小鼠正常细胞L929细胞共培养48小时，细胞存活率达到99.28%（图13A）。正常细胞仍然保持较高的活性，这证明Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑) MOF材料具有良好的生物相容性。Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG在125 µg/mL的药物浓度下，L929细胞的存活率为78.26%（图13(B）。抗癌药物DOX的负载对正常细胞有一定的毒性，但是较高的细胞存活率仍然可以说明纳米载体的细胞毒性较低，具有较好的生物相容性。从图13C可以看出，空白药物载体Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑) MOF对4T1细胞有一定的自体毒性，这是由于Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑) MOF在肿瘤内高表达的GSH环境
3+ 3+ 2+
下断键释放Fe ，Fe 被还原成Fe ，然后发生Fenton反应激发铁死亡治疗，表现出一定的细胞毒性。然而，Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG的4T1癌细胞存活率为6.27%，远远低于游离DOX。与空白载体和单独的DOX相比，载药载体Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG对4T1细胞表现出更高的细胞毒性，这是由于细胞内的Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG可以更好地释放药物，产生铁死亡和DOX相互协同的高效治疗效果，这一结果与体外的药物释放行为结果一致。

[0070] 从图14可以看出，当空白的Fe(III)‑RSSR MOF浓度达到50 μg/mL，小鼠正常细胞L929细胞共培养48小时，细胞存活率达到100.71%（图14A）。正常细胞仍然保持较高的活性，这证明Fe(III)‑RSSR MOF材料具有良好的生物相容性。在加载Fe(III)‑RSSR@DOX@PEG‑GOx后的50 μg/mL药物浓度下，L929细胞的存活率为79.88%（图14B）。抗癌药物DOX的负载对正常细胞有毒性，但高的细胞存活率仍然可以说明纳米载体的细胞毒性较低。从图14C可以看出，空白药物载体Fe(III)‑RSSRMOF对4T1细胞有一定的自体毒性，这是由于Fe(III)‑RSSR MOF在肿瘤内高表达的GSH环境下断键发生Fenton反应，激发铁死亡，表现出一定的细胞毒性。然而，Fe(III)‑RSSR@DOX@PEG‑GOx的细胞存活率为3.94%，远远低于游离DOX。与空白载体和单独的DOX相比，载药载体Fe(III)‑RSSR@DOX@PEG‑GOx对4T1细胞表现出更高的细胞毒性，这是由于细胞内的Fe(III)‑RSSR@DOX@PEG‑GOx可以更好地释放药物，产生铁死亡和DOX相互协同的高效治疗效果，这一结果与体外的药物释放行为结果一致。同时，载体表面修饰的GOx会消耗肿瘤内的葡萄糖，产生H2O2，进一步促进铁蛋白的形成过程，此时形成铁蛋白、化疗和饥饿疗法的三重协同治疗局面。

[0071] 综上，未载药的空白纳米粒子Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG和Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX@PEG‑GOx表现出良好的生物相容性，由于铁死亡和药物的释放的协同治疗，载药后的纳米粒子表现出更好的细胞毒性。

[0072] （2）细胞内吞验证：本步骤利用CLSM来研究Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG和Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX@PEG‑GOx在不同时期的细胞内化情况，具体步骤为：用DAPI对细胞核进行染色，并使用DOX作为荧光探针。分别将Fe(Ⅲ)‑(3,3’‑SS‑)@DOX@PEG和Fe(Ⅲ)‑RSSR@DOX@PEG‑GOx与肿瘤细胞共培养后，细胞核有蓝色荧光，DOX为红色。DOX被广泛地内化到癌细胞中，在细胞质和细胞核中显示出强烈的红色荧光定位。结果如图15和16所示。

[0073] 从图15和16可以看出，随着培养时间从3 h、6 h增加到12 h，DOX的红色荧光增加，而DAPI的荧光强度保持不变。在共聚焦后的图片中，合并的紫色荧光明显越来越强，这说明更多的DOX被内化到细胞中。

[0074] 综上所述，本发明以含GSH敏感键的MOF合成了Fe基MOF，然后在Fe基MOF孔道内包载抗癌药物模型DOX，并在Fe基MOF表面修饰功能性材料，得到所述pH/GSH双响应型Fe基MOF药物载体；所述Fe基MOF药物载体通过铁死亡与化疗相互协同来达到抑制或者杀死肿瘤细胞的目的，在抗癌症中具有很好的应用，具有很好的实用性。

[0075] 所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。