[0001] 本发明属于土壤污染修复技术领域，具体涉及一种基于砷转化微生物长效氧化稳定土壤砷污染的菌剂。

[0002] 砷污染土壤的现状严峻，对人类健康和生态环境构成了巨大威胁。砷是一种有毒的半金属元素，长期暴露于砷污染的土壤中会导致多种健康问题，如皮肤病、神经系统疾病甚至癌症。目前，随着工业化和农业活动的增加，土壤中的砷污染问题日益严重，特别是在一些矿产资源丰富或工业活动密集的地区，土壤砷浓度超过安全限值的现象屡见不鲜。

[0003] 依据砷在土壤中结合的紧密程度，将土壤中的砷可分为不同的结合形态，主要包括水溶态、交换态、结合态（如铁结合态、钙结合态、铝结合态）及残渣态的砷。一般认为水溶态、交换态的砷具有强的生物有效性，易被植物吸收，残渣态砷的生物有效性差，不易被植物吸收，但当土壤理化条件变化或在土壤微生物作用下导致砷结合矿物相态或粒径改变时，均可使土壤中的砷释放成为有效砷，土壤中砷结合形态及其分配比例的改变往往带来植物吸收砷和土壤砷生物有效性的变化。

[0004] 目前，砷污染土壤修复主要分为两种途径：一是改变污染土壤中砷的存在形态，使其由活化态转化为稳定态，以此降低砷在环境中的迁移性和生物可利用性，减弱其对植物和动物的毒性；二是从污染土壤中去除砷，达到回收和减少土壤中重金属的双重目的，使其存留浓度接近或达到背景值。目前，国内外砷污染土壤修复治理技术发展迅速，主要有以下几种：工程措施方面，包括客土法、换土法和翻土法等；物理修复技术方面，包括固化/稳定化、物理分离修复、玻璃化修复、电动修复等；化学修复技术方面，包括原位/异位化学淋洗技术、土壤性能改良技术等；生物修复技术，包括动物修复、微生物修复、植物修复等。

[0005] 其中，在工程措施方面，土壤修复快速有效，可迅速降低污染浓度，但成本高，需大量挖掘和运输，可能破坏土壤结构，不适用于大面积污染；物理修复效果稳定，无二次污染风险，可针对深层土壤修复，但成本较高，技术复杂，对土壤性质有一定影响；化学修复速度快，效果显著，可针对特定污染物，但可能产生二次污染，成本较高，对土壤生态有潜在影响；生物修复成本低，环境友好，有利于土壤生态系统恢复，但修复速度慢，效果受环境因素影响大修复效果不稳定，适用范围有限。

[0006] 与其他修复技术相比，微生物修复技术在环境修复领域具有显著的优势，但也存在一些局限之处。为了克服这些局限，需要进一步加强微生物修复技术的研究和开发，提高微生物的降解能力和适应性，完善修复效果的评估和监测手段，以及探索更加高效、经济的修复方法。

[0017] 以下结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步描述。但是本领域技术人员应当理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为对本发明的限制。实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器，如无特殊说明，均为通过市购渠道获得的常规产品。

[0018] 实施例1一种基于砷转化微生物长效氧化稳定土壤砷污染的菌剂包括改性瓜尔胶载体和菌液：
所述改性瓜尔胶载体的制备过程包括以下步骤：
；
（1）取2g瓜尔胶分散于含11mL甲苯的反应瓶中，再将1.2g三溴化磷于5°C滴加至反应瓶中中，待滴加完毕后将920mg吡啶加入至反应瓶中，将反应液由5°C逐渐升至20°C后反应10h；用5wt%氢氧化钠溶液淬灭反应至反应液pH=7后进行过滤，过滤后依次用去离子水和乙醇洗涤，即为溴化瓜尔胶；
（2）取2g溴化瓜尔胶与520mgN,N,N',N' ‑ 四甲基‑1,4‑丁二胺于11mL四氢呋喃中反应18h，过滤溶剂，依次用去离子水和乙醇洗涤，即为改性瓜尔胶。

[0019] 所述菌液的制备包括以下步骤：1）菌株筛选：所述菌株为台湾假单胞菌（Pseudomonas taiwanensis，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。）；
2）培养基准备：所述培养基为营养肉汁琼脂，于蒸汽压力灭菌锅0.1Mpa、121℃条件下灭菌20min；
3）菌株活化：将保存在‑80℃下的台湾假单胞菌菌种取出，在冰浴下缓慢解冻；接种所述解冻的菌种于100倍体积的培养基中，放在恒温振荡培养箱于170rpm、31℃条件下振荡培养36h，得活化的菌液；
4）扩大培养及收集菌液：接种所述活化的菌液于装有所述活化菌液20倍体积营养肉汁琼脂培养基的发酵罐中，在30℃、180r/min和1vvm的通气量条件下培养24h，即得菌液。

[0020] 基于砷转化微生物长效氧化稳定土壤砷污染的菌剂的制备过程包括以下步骤：将菌液和改性瓜尔胶载体按照2:3的质量比混合，190rpm搅拌4min，然后于18℃进行干燥，干燥后含水量为8wt％，包装，即得基于砷转化微生物长效氧化稳定土壤砷污染的菌剂。

[0021] 实施例2一种基于砷转化微生物长效氧化稳定土壤砷污染的菌剂包括改性瓜尔胶载体和菌液：
所述改性瓜尔胶载体的制备过程包括以下步骤：
（1）取2g瓜尔胶分散于含10mL甲苯的反应瓶中，再将1g三溴化磷于5°C滴加至反应瓶中中，待滴加完毕后将880mg吡啶加入至反应瓶中，将反应液由5°C逐渐升至20°C后反应
12h；用5wt%氢氧化钠溶液淬灭反应至反应液pH=7后进行过滤，过滤后依次用去离子水和乙醇洗涤，即为溴化瓜尔胶；
（2）取2g溴化瓜尔胶与500mgN,N,N',N' ‑ 四甲基‑1,4‑丁二胺于10mL四氢呋喃中反应24h，过滤溶剂，依次用去离子水和乙醇洗涤，即为改性瓜尔胶。

[0022] 所述菌液的制备包括以下步骤：1）菌株筛选：所述菌株为台湾假单胞菌（Pseudomonas taiwanensis，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。）；
2）培养基准备：所述培养基为胰蛋白胨大豆肉汤，于蒸汽压力灭菌锅0.1Mpa、121℃条件下灭菌20min；
3）菌株活化：将保存在‑70℃下的台湾假单胞菌菌种取出，在冰浴下缓慢解冻，接种所述解冻的菌种于100倍体积的培养基中，放在恒温振荡培养箱于160rpm、30℃条件下振荡培养48h，得活化的菌液；
4）扩大培养及收集菌液：接种所述活化的菌液于装有所述活化菌液20倍体积胰蛋白胨大豆肉汤培养基的发酵罐中，在30℃、180r/min和1vvm的通气量条件下培养24h，即得菌液。

[0023] 基于砷转化微生物长效氧化稳定土壤砷污染的菌剂的制备过程包括以下步骤：将菌液和载体按照2:3的质量比混合，180rpm搅拌3min，然后于15℃进行干燥，干燥后含水量为6wt％，包装，即得基于砷转化微生物长效氧化稳定土壤砷污染的菌剂。

[0024] 实施例3一种基于砷转化微生物长效氧化稳定土壤砷污染的菌剂包括改性瓜尔胶载体和菌液：
所述改性瓜尔胶载体的制备过程包括以下步骤：
（1）取2g瓜尔胶分散于含12mL甲苯的反应瓶中，再将1.5g三溴化磷于5°C滴加至反应瓶中中，待滴加完毕后将1g吡啶加入至反应瓶中，将反应液由5°C逐渐升至20°C后反应
11h；用5wt%氢氧化钠溶液淬灭反应至反应液pH=7后进行过滤，过滤后依次用去离子水和乙醇洗涤，即为溴化瓜尔胶；
（2）取2g溴化瓜尔胶与550mgN,N,N',N'‑四甲基‑1,4‑丁二胺于12mL四氢呋喃中反应24h，过滤溶剂，依次用去离子水和乙醇洗涤，即为改性瓜尔胶。

[0025] 所述菌液的制备包括以下步骤：1）菌株筛选：菌株筛选：所述菌株为台湾假单胞菌（Pseudomonas taiwanensis，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。）；
2）培养基准备：所述培养基为营养肉汁琼脂，于蒸汽压力灭菌锅0.1Mpa、121℃条件下灭菌20min；
3）菌株活化：将保存在‑70℃下的台湾假单胞菌菌种取出，在冰浴下缓慢解冻，接种所述解冻的菌种于90倍体积的培养基中，放在恒温振荡培养箱于180rpm、32℃条件下振荡培养24h，得活化的菌液；
4）扩大培养及收集菌液：接种所述活化的菌液于装有所述活化菌液20倍体积营养肉汁琼脂培养基的发酵罐中，在30℃、180 r/min和1vvm的通气量条件下培养24h，即得菌液。

[0026] 基于砷转化微生物长效氧化稳定土壤砷污染的菌剂的制备过程包括以下步骤：将菌液和载体按照2:3的质量比混合，200rpm搅拌5min，然后于20℃进行干燥，干燥后含水量为10wt％，包装，即得基于砷转化微生物长效氧化稳定土壤砷污染的菌剂。

[0027] 试验例1本发明菌剂对土壤中砷的去除试验：
土壤预处理：取花盆5个，每个花盆放置有高浓度砷污染土壤2kg，分别编号为A1‑A5，检测初始砷浓度并记录，具体检测方法为：称取2g土样于100mL的锥形瓶内，加600μL去离子水湿润土壤，静置10min后，分别依次加入5mL 65wt％浓硝酸、3mL 30wt％硫酸、1mL 
70wt％高氯酸，常温下搅拌3h后再加热至沸腾，直至变成混合液成为灰白色后冷却；然后加入5mL 65wt％浓硝酸与10mL去离子水，加热沸腾，直至溶液蒸发至5mL；待锥形瓶冷却至30°C时，再加入15mL去离子水充分溶解土壤，再用滤纸过滤；再加入去离子水洗涤土壤，再用中性滤纸过滤，然后用用去离子水定容至50mL，最后使用全反射X射线荧光光谱仪测试液体中砷元素的含量。

[0028] 测样步骤：取2g土样于50mL的烧杯内，加入15mL去离子水，浸润土壤5min，在磁力搅拌器下搅拌2h，静止1h后通过3层纱布过滤，收集淋出液，测定淋出液中砷含量，计算淋出液砷稳定化率：砷稳定化率（%）=1‑[砷含量/1d砷含量]。

[0029] 实施例1‑3菌剂处理土壤流程：分别将实施例1‑3制备的菌剂0.2g、0.1g硫酸亚铁加入到砷污染土壤样品1kg中，搅拌均匀，培养90d，保证土壤含水量为20‑30％左右；菌液处理土壤流程：将与实施例1制备的菌剂0.2g所需等量的菌液、0.1g硫酸亚铁加入到砷污染土壤样品1kg中，搅拌均匀，培养90d，保证土壤含水量为20‑30％左右；
瓜尔胶菌剂（与实施例1制备菌剂的方式的区别之处在于：瓜尔胶菌剂采用的是与实施例1改性瓜尔胶等量的瓜尔胶）处理土壤流程：将瓜尔胶菌剂0.2g、0.1g硫酸亚铁加入到砷污染土壤样品1kg中，搅拌均匀，培养90d，保证土壤含水量为20‑30％左右。

[0030] 于1d、15d、30d、60d、90d后检测A1‑A5的洗脱砷含量（mg/mL）和砷稳定化率（%），具体见表1；表1 本发明菌剂对土壤中砷含量的影响

[0031] 由表1可知：与菌液组、瓜尔胶菌剂组相比，实施例1‑3菌剂组在1‑90d中保持着较为优越的砷稳定化能力，说明本发明达到了在菌剂长效氧化方面有了较为明显的表现。菌液组在1‑90d中一直作用于土壤中砷含量，但其作用幅度较为有限，且其90d后的砷稳定化率仅有40.28，远远低于实施例1‑3的65.78% 67.04%；瓜尔胶菌剂在1‑90d中砷稳定化效果~略优于菌液组，但是和实施例1‑3组存在较为明显的差距。这说明本发明具有较为突出的砷稳定化能力。

[0032] 以上仅为本发明的优选实施例，不限于上述的举例，对于本领域的技术人员来说，在本发明的原理下，可以有各种更改和变化。所作的任何修改、改进等，均应视为在本发明的保护范围之内。