[0001] 本发明属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及一种生物合成乙醛酸的方法。

[0002] 一碳(C1)化合物包括CO2、CO、甲酸、甲醛和甲醇等，具有来源广泛、价值低廉等特点，是公认最理想的工业生物制造原料。自然生物通常用循环途径进行一碳利用，如卡尔文循环、丝氨酸循环、木酮糖单磷酸循环和核酮糖单磷酸循环等，然而天然的循环固碳途径往往存在途径复杂、效率低下、原子经济性差等问题。线性、正交的固碳路径被认为是最有潜力的固碳路径。以近几年发现的还原甘氨酸途径为例，其核心固碳酶是甘氨酸裂解体系(glycine cleavage system，GCS)，其可以逆向利用CO2、5，10‑亚甲基四氢叶酸和氨(NH3)合成甘氨酸。甘氨酸裂解体系是由三个酶(P蛋白、T蛋白、L蛋白)和一个载体H蛋白组成的多酶复合体，通过载体H蛋白上硫辛酰赖氨酸臂作为活性亲核基团，接受并转移CO2。还原甘氨酸途径为被认为是固碳途径中最具优势的途径之一，反应步骤较少，ATP需求较低，途径中的酶对氧气的耐受性比较好，对中心代谢干扰小，有较好的工业应用潜力。最近还原甘氨酸途径在E.coli、Saccharomyces cerevisiae、Clostridium drakei等微生物中获得成功表达，使得宿主细胞可以利用甲酸和CO2合成有机酸及氨基酸等初级代谢产物。

[0003] 地球上的一碳资源丰富，2013年全球甲醛产能约6400万吨，全球甲醇产能约10324万吨，天然气可采储量约185.7万亿立方米，原煤可采储量约8915.31亿吨。自然界没有酶能够催化甲醛与二氧化碳反应生成乙醛酸，因此，探索以甲醛和二氧化碳为原料，以酶为催化剂生成乙醛酸将为一碳资源的高效利用奠定基础。

[0038] 下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

[0039] 除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0040] 除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0041] 发明人通过对苯甲酰甲酸脱羧酶(BFD,Pseudomonas putida)进行定向进化，获得了(W86R,N87T,L109G,L110E,A460M,H281V,Q282F)，成功实现了甲醛缩合反应。我们将此BFD突变体定义为羟基乙醛合成酶(GALS)，该酶能够缩合甲醛与二氧化碳反应生成乙醛酸。乙醛酸既可以通过甘油酸路径进入中心代谢，也可以转化为甘氨酸，构建人工甘氨酸路径。

[0042] 实施例1：构建GALS表达载体

[0043] GALS酶的编码基因种属来源为Pseudomonas putida，GALS酶的氨基酸如SEQ ID No.2，GALS酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。表达GALS酶的载体为将上述GALS酶的编码基因(SEQ ID No.3)插入pET‑28a载体的NdeI和XhoI酶切位点之间得到的载体，命名为pET‑28a‑GALS(如图2所示)。

[0044] 实施例2.基因的表达

[0045] 为了体外检测和验证GALS酶的活性和功能，在大肠杆菌中对该酶进行外源表达。

[0046] (1)将实施例1制备的大肠杆菌表达型重组质粒pET‑28a‑GALS转入E.coli BL21+(DE3)中，获得表达GALS酶的重组菌。采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(Kan ，
100mg/mL)，37℃过夜培养；

[0047] (2)挑单克隆至5mL LB液体培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220r/min培养至+OD600为0.6‑0.8。将5mL LB培养基中菌液转接至800mL 2YT培养基中(Kan ，100mg/mL)，37℃、220rpm培养至OD600为0.6‑0.8时，降温至16℃，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导表达16h；

[0048] (3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500rpm离心15min；

[0049] (4)弃上清，用35mL蛋白缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4)将所得菌体沉淀悬起，倒入50mL离心管中，‑80℃冰箱保存，得到表达GALS酶的菌体。

[0050] 实施例3.蛋白的纯化

[0051] (1)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下对实施例2获得的表达GALS酶的菌体进行破菌2次。破菌后菌悬液4℃、10000rpm离心45min；

[0052] (2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：

[0053] a：柱平衡：挂上清前，先用ddH2O洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡Ni亲和层析柱1个柱体积；

[0054] b：上样：将上清按0.5mL/min流速缓慢经过Ni亲和层析柱，重复一次；

[0055] c：洗脱杂蛋白：用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，然后分别用50mL含50mM，100mM咪唑的蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白；

[0056] d：洗脱目的蛋白：用20mL含200mM咪唑的蛋白缓冲液(50mM磷酸钾，PH＝7.4，5mM MgSO4)将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流川样品，制样，12％ SDS‑PAGE检测。

[0057] (3)换液：将收集到的目的蛋白用50mL Amicon超滤管(30kDa，Millipore公司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1mL。加15mL不含咪唑的蛋白缓冲液，浓缩至1mL，重复1次，得到GALS蛋白。

[0058] (4)用Nondrop 2000微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度，并稀释至10mg/mL，即得到GALS蛋白。

[0059] 实施例4.GALS蛋白催化乙醛酸生成的功能检测

[0060] GALS蛋白催化甲醛和CO2生成乙醛酸。

[0061] 样品：2mg/mL GALS，200mM碳酸氢钠缓冲液(200mM NaHCO3,pH＝9)，辅因子：1mM硫胺素焦磷酸(TPP)，pH 9，50mM甲醛。

[0062] 对照：200mM碳酸氢钠缓冲液，1mM TPP，pH 9，50mM甲醛。

[0063] 标准品：10mM乙醛酸。

[0064] 反应体系混匀后，置于37℃反应1h。反应结束后，反应体系中加入等体积乙腈，12000rpm离心1h。吸取上清液100μL样品，HPLC检测。

[0065] HPLC检测：检测系统是安捷伦液相色谱仪7890A；检测条件为：安捷伦色谱柱为Aminex 87‑H(300×7.8mm，9μm)；检测器分为紫外检测器(Agilent,G1315D)紫外检测波长210nm，流动相的流速为0.6ml/min；进样量为20μl；柱温为35℃。

[0066] 通过HPLC分析可知，GALS可以催化甲醛缩合CO2生成乙醛酸，结果如图3。

[0067] 以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。