[0001] 本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种兼具成骨诱导与抗菌的多功能仿生涂层及其制备方法。

[0002] 在骨关节炎、骨质疏松、骨肿瘤等综合并发症下的骨折、创伤等骨缺损修复与治疗，目前仍是临床医学领域面临的主要难题。钛及其合金因具有较高的比强度、优异的耐蚀性、可靠的生物相容性，已成为骨科与矫形外科理想的植入替代材料之一。然而，钛基合金的弹性模量较高，与天然骨组织极不匹配，易导致应力屏蔽效应，从而加剧骨吸收过程，造成植入失效；且表面自发形成的天然钝化致密氧化层，不具备生物活性，不利于成骨分化、成骨细胞的粘附、增殖与功能表达等生理过程，植入后与周围人体组织的交互作用差，导致骨整合不足；此外，较弱的抗菌性能，也加速了植入手术的早期感染，引起炎症。因此，迫切需要对生物医用钛合金进行表面改性处理，以应对复杂的临床环境，促进植入物与骨组织界面的早期骨整合并避免细菌感染。

[0003] 人体骨骼是一种具有微纳多级多孔结构的组织，可用于储存大量的营养素、生长因子、细胞，也可用于物质交换和运输。在植入钛合金表面构建纳米管状结构的仿骨多孔材料，可显著降低钛合金的弹性模量，也可实现植入周围组织营养物质的储存与运输，促进骨内快速血管化；纳米结构，也为细胞粘附提供较多的黏着位点，有利于细胞的快速铺展。此外，中空结构也为生物活性物质的搭载与控释提供大量存储空间。骨骼包含大量多种金属元素，在维持骨骼组织的稳态平衡、加速血管生成、调节骨代谢、维持骨细胞正常功能表达中发挥着重要作用。在纳米管内搭载金属活性离子，可有效地实现植入部位周围成骨分化、抑制破骨，实现骨组织的稳态调节。但金属离子可随周围组织液快速扩散，形成突释，对细胞和组织造成毒性。因此，对金属离子释放必须有效地控制。

[0004] 然而，现有技术中在制备含金属离子的功能涂层时，无法实现活性金属离子的可控释放，导致功能涂层快速失效，无法得到很好的应用，并且，现有涂层还存在着抗菌性能差、细胞毒性大等不足之处。

[0032] 下面，结合具体实施例和附图进一步对本发明进行说明。

[0033] 实施例1：本实施例提供的兼具成骨诱导与抗菌的多功能仿生涂层，以TA2合金为基体，由内向外依次构建二氧化钛纳米中空管层(即仿骨多孔二氧化钛纳米管层)、搭载锶离子的自组装溶菌酶层(即螯合活性金属离子的相转变溶菌酶纳米蛋白层)和盐酸四环素层(即骨靶向生物分子层)。

[0034] 制备过程为：将TA2合金裁剪成70mm×50mm×0.1mm的试样，表面通过砂纸打磨、抛光至镜面后，使用丙酮、乙醇分别超声清洗30min后，吹干。配置乙二醇+0.5wt.％氟化铵+2vol.％去离子水的有机电解液250mL，电压保持45V，阴极阳极二者距离保持4cm，氧化温度为25℃，氧化时间为60min，阳极氧化后，使用去离子水对样品进行超声清洗30min后，吹干，制得纳米管样品。配制含2mg/mL的蛋清溶菌酶、1.8mM的乙酸锶的10mM 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸混合溶液、pH为7.2，和含50mM、pH＝7.0的三(2‑羧乙基)膦的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸溶液。
将上述两种溶液混合并快速浸入上述纳米管样品，室温反应2h后，用去离子水冲洗后吹干，制得含自组装溶菌酶层的样品。配制20mM(1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐)、
10mM N‑羟基琥珀酰亚胺溶液，并将上述含自组装溶菌酶层的样品浸入，充分活化羧基3h后，加入4mM的盐酸四环素溶液，充分反应12h。取出样品，超声清洗、风干，制得多功能仿生涂层。

[0035] 实施例2：本实施例提供的兼具成骨诱导与抗菌的多功能仿生涂层，以Ti13Nb13Zr合金为基体，由内向外依次构建二氧化钛纳米中空管层、搭载锌离子的自组装溶菌酶层和盐酸四环素层。

[0036] 制备过程为：将Ti13Nb13Zr合金裁剪成70mm×50mm×0.1mm的试样，表面通过砂纸打磨、抛光至镜面后，使用丙酮、乙醇分别超声清洗30min后，吹干。配置乙二醇+0.5wt.％氟化铵+2vol.％去离子水的有机电解液250mL，电压保持50V，阴极阳极二者距离保持4cm，氧化温度为25℃，氧化时间为60min，阳极氧化后，使用去离子水对样品进行超声清洗30min后，吹干，制得纳米管样品。配制含2mg/mL的溶菌酶、1.8mM的硫酸锌的20mM 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸混合溶液、pH为7.2，和含50mM、pH＝7.0的三(2‑羧乙基)膦的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸溶液。将上述两种溶液混合并快速浸入上述纳米管样品，室温反应2h后，用去离子水冲洗后吹干，制得含自组装溶菌酶层的样品。配制20mM(1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐)、10mM N‑羟基琥珀酰亚胺溶液，并将上述含自组装溶菌酶层的样品浸入，充分活化羧基3h后，加入4mM的盐酸四环素溶液，充分反应12h。取出样品，超声清洗、风干，制得多功能仿生涂层。

[0037] 实施例3：本实施例提供的兼具成骨诱导与抗菌的多功能仿生涂层，以Ti12Mo6Zr合金为基体，由内向外依次构建二氧化钛纳米中空管层、搭载镁离子的自组装溶菌酶层和多西环素层。

[0038] 制备过程为：将Ti12Mo6Zr合金裁剪成70mm×50mm×0.1mm的试样，表面通过砂纸打磨、抛光至镜面后，使用丙酮、乙醇分别超声清洗30min后，吹干。配置乙二醇+0.5wt.％氟化铵+2vol.％去离子水的有机电解液250mL，电压保持40V，阴极阳极二者距离保持4.5cm，氧化温度为25℃，氧化时间为45min，阳极氧化后，使用去离子水对样品进行超声清洗30min后，吹干，制得纳米管样品。配制含3mg/mL的溶菌酶、1.8mM的MgSO4的20mM 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸混合溶液、pH为7.2，和含60mM、pH＝7.0的三(2‑羧乙基)膦的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸溶液。将上述两种溶液混合并快速浸入上述纳米管样品，室温反应2h后，用去离子水冲洗后吹干，制得含自组装溶菌酶层的样品。配制20Mm(1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐)、10mM N‑羟基琥珀酰亚胺溶液，并将上述含自组装溶菌酶层的样品浸入，充分活化羧基3h后，加入4mM的多西环素溶液，充分反应12h。取出样品，超声清洗、风干，制得多功能仿生涂层。

[0039] 实施例4：本实施例提供的兼具成骨诱导与抗菌的多功能仿生涂层，以TA2合金为基体，由内向外依次构建二氧化钛纳米中空管层、搭载锶离子的自组装溶菌酶层和替加环素层。

[0040] 制备过程为：将TA2合金裁剪成70mm×50mm×0.1mm的试样，表面通过砂纸打磨、抛光至镜面后，使用丙酮、乙醇分别超声清洗30min后，吹干。配置乙二醇+0.5wt.％氟化铵+2vol.％去离子水的有机电解液250mL，电压保持45V，阴极阳极二者距离保持4cm，氧化温度为25℃，氧化时间为60min，阳极氧化后，使用去离子水对样品进行超声清洗30min后，吹干，制得纳米管样品。配制含3mg/mL的溶菌酶、1.8mM的乙酸锶的10mM 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸混合溶液、pH为7.2，和含60mM、pH＝7.0的三(2‑羧乙基)膦的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸溶液。将上述两种溶液混合并快速浸入上述纳米管样品，室温反应2h后，用去离子水冲洗后吹干，制得含自组装溶菌酶层的样品。配制20mM(1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐)、10mM N‑羟基琥珀酰亚胺溶液，并将上述含自组装溶菌酶层的样品浸入，充分活化羧基3h后，加入
4mM的替加环素溶液，充分反应12h。取出样品，超声清洗、风干，制得多功能仿生涂层。

[0041] 对比例1：与实施例1的区别之处在于，不包括搭载锶离子的自组装溶菌酶层和盐酸四环素层。

[0042] 制备过程为：将TA2合金裁剪成70mm×50mm×0.1mm的试样，表面通过砂纸打磨、抛光至镜面后，使用丙酮、乙醇分别超声清洗30min后，吹干。配置乙二醇+0.5wt.％氟化铵+2vol.％去离子水的有机电解液250mL，电压保持45V，阴极阳极二者距离保持4cm，氧化温度为25℃，氧化时间为60min，阳极氧化后，使用去离子水对样品进行超声清洗30min后，吹干，制得纳米管样品。使用配制1.8mM的乙酸锶溶液，将纳米管样品浸泡在乙酸锶溶液中，2h后取出，用去离子水冲洗表面后，吹干，获得对比例1涂层。

[0043] 对比例2：与实施例1的区别之处在于，不包括盐酸四环素层。

[0044] 制备过程为：将TA2合金裁剪成70mm×50mm×0.1mm的试样，表面通过砂纸打磨、抛光至镜面后，使用丙酮、乙醇分别超声清洗30min后，吹干。配置乙二醇+0.5wt.％氟化铵+2vol.％去离子水的有机电解液250mL，电压保持45V，阴极阳极二者距离保持4cm，氧化温度为25℃，氧化时间为60min，阳极氧化后，使用去离子水对样品进行超声清洗30min后，吹干，制得纳米管样品。配制含2mg/mL的蛋清溶菌酶、1.8mM的乙酸锶的10mM 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸混合溶液、pH为7.2，和50mM、pH＝7.0的三(2‑羧乙基)膦的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸溶液。将上述两种溶液混合并快速浸入上述纳米管样品，室温反应2h后，用去离子水冲洗后吹干，获得对比例2涂层。

[0045] 对实施例1‑实施例4和对比例1‑对比例2制得的涂层进行表征和生物相容性测试，结果如附图1‑图9所示。

[0046] 图1为实施例1制备的纳米管表面搭载锶离子的自组装溶菌酶并接肢盐酸四环素骨靶向分子的表面形貌。如图1所示，所制备的相转变溶菌酶颗粒尺寸约200‑300nm，溶菌酶颗粒之间相互粘附，并覆盖在内径约50‑70nm的二氧化钛纳米管表面。

[0047] 图2为实施例1制备的纳米管表面搭载锶离子的自组装溶菌酶并接肢盐酸四环素骨靶向分子的截面形貌。如图2所示，纳米管外径约100nm、管长约为4‑5μm。

[0048] 图3为实施例1制备的纳米管表面搭载锶离子的自组装溶菌酶并接肢盐酸四环素骨靶向分子的表面元素分布图。如图3所示，纳米管表面由Ti、O、C、Sr、N和S等元素构成。Ti元素来自于纳米管；O元素主要来自纳米管、相转变溶菌酶和盐酸四环素分子，也可包含吸附的水蒸气；C元素来自相转变溶菌酶和盐酸四环素，也可能包含表面吸附的有机污染物；Sr元素来自搭载的锶离子；N元素来自相转变溶菌酶和盐酸四环素；S元素来自相转变溶菌酶。

[0049] 图4为实施例1和对比例1、对比例2制得的涂层在14天(336h)的金属离子释放行为。如图4所示，实施例1释放的锶离子速度很慢，可在336h内连续释放；而对比例1和2在前24h都出现了明显的大量突释。

[0050] 图5为实施例1制备的纳米管表面搭载锶离子的自组装溶菌酶并接肢盐酸四环素4
骨靶向分子涂层表面接种0.5mL小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3‑E1，5×10个细胞/mL)和1.5mL完全培养基(89％α‑MEM培养基、10％胎牛血清和1％青霉素‑链霉素)，并在37℃、
5％CO2湿润环境下分别培养3天后，分别用200μL的罗丹明(10μg/mL，PBS作溶剂)、200μL的DAPI(500ng/mL，PBS作溶剂)避光染色20min，获得的细胞荧光图形。如图4所示，细胞大量呈现铺展形态粘附在涂层表面，表明涂层可明显促进成骨细胞粘附。

[0051] 图6为实施例1制备的纳米管表面搭载锶离子的自组装溶菌酶并接肢盐酸四环素骨靶向分子涂层表面采用平板涂布法检测细菌抗菌性能的菌落情况，接种的金黄色葡萄球4
菌密度为5×10 CFU/mL。如图5所示，涂层表面几乎没有菌落残留，表明涂层展现出优异的抗菌性能。

[0052] 图7为对比例1所制备的涂层表面形貌图。如图7所示，纳米管内径约60‑80nm、外径约100‑120nm，纳米管壁粗糙，表明金属离子搭载其中。

[0053] 图8为对比例1表面接种0.5mL小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3‑E1，5×104个细胞/mL)和1.5mL完全培养基(89％α‑MEM培养基、10％胎牛血清和1％青霉素‑链霉素)，并在37℃、5％CO2湿润环境下分别培养3天后的细胞荧光图形。如图8所示，表面细胞数量相比于实施例1而言，明显较少。

[0054] 图9为对比例1涂层表面采用平板涂布法检测细菌抗菌性能的菌落情况。如图9所示，涂层表面金黄色葡萄球菌菌落数较多，抗菌性能与本发明实施例1相比较差。

[0055] 实施例2‑实施例4制得的多功能涂层，纳米管内径、外径、管长等、溶菌酶颗粒尺寸等参数均与实施例1的图1和2相近；多功能涂层表面的成骨细胞粘附数量较多、形态均成铺展态，形貌与实施例1的图5相似，表明多功能涂层释放的活性金属离子及表面相转变溶菌酶有利于成骨细胞的生长，表现出较好的细胞生长行为；采用平板涂布法检测多功能涂层的抗菌性能，结果表明几乎没有明显的菌落，达到较好的抗菌效果，结果与实施例1的图6相似。