技术领域
[0001] 本发明涉及生物活性分子检测技术领域,特别涉及一种基于上转换和血红蛋白的比率式氧传感器的制备方法及检测溶解氧浓度的方法。
相关背景技术
[0002] 溶解氧浓度的检测在生物医学科学环境保护、水产养殖、海洋科学研究等领域具有重要意义。目前的溶解氧传感器根据原理主要分为三种类型:化学型、电化学型、光学型,每种都有自己的特点。
[0003] 电化学法是测定溶解氧的一种通用方法。基于电化学方法的传感器,通过检测水中氧分子与电极之间氧化还原反应产生的电流,来检测溶解氧。然而,在测量过程中,细胞膜经常被堵塞,电极会持续老化。同时,由于消耗氧分子是不可避免的,因此应经常进行校准。因此,电化学方法溶解氧传感器边界线不是太好。
[0004] 光纤溶解氧传感器是基于氧分子和荧光猝灭效应。荧光分子嵌入在支撑基质中,如溶胶‑凝胶基质或聚合物。该传感器在测量过程中不耗氧,具有良好的重复性和稳定性,因此基于荧光猝灭效应的光学型溶解氧传感器越来越受到人们的关注和研究。研究人员通过使用不同的有机改性硅酸盐和不同的荧光染料(如钌、铂和钯的配合物)制备氧敏感膜,然后在光纤表面应用一层传感膜研究和测试传感器的性能。由于光漂白和激发光变化等的影响,该方法的稳定性仍然需要提高。
[0005] 在卫生保健和医学测量中,血液溶解氧则是利用脉搏和血红蛋白氧合前后对红外光的吸收度变化进行测量。然而,用这种方法只能测量血管中流动血液的氧浓度。因此,如何利用血红蛋白对氧的捕捉而引起的光吸收度的变化进而检测溶解氧是本申请要解决的课题。
具体实施方式
[0026] 下面结合实施方式对本发明进行详细的介绍。
[0027] 实施方式1:本实施方式提供了一种基于上转换和血红蛋白的比率式氧传感器的制备:
1、光纤预处理:光纤首先去除包覆层,然后置于HF溶液中继续腐蚀粗化10 min,最后用酒精和纯水反复清洗三次,氮气吹干。端面打磨平滑,用离子溅射仪蒸镀金反射层;
2、取3mlNaOH(30mmol)水溶液(澄清)、8ml无水乙醇、20ml油酸于烧瓶中搅拌20分钟至溶液澄清;用移液枪向前溶液中滴入Y、Yb、Er与Tm的醋酸水溶液,并搅拌30分钟至溶液澄清;加入10mlNaF(8mmol)乙醇溶液搅拌30分钟至溶液澄清。将制得混合液倒入50ml的Teflon反应釜中,于烘箱中在190摄氏度下加热10小时。加热完成后,用滴管吸出合成液于离心管内进行离心,离心速度9000rpm,得反应物,并分别加乙醇、环己烷清洗并离心,倒去上清液,得到油酸包覆的NaYF4:Yb,Er/Tm上转换纳米粒子(OA‑NaYF4:Yb,Er/ Tm UCNPs);
将OA‑NaYF4:Yb,Er/Tm上转换纳米粒子分散于醇中,接着加入三氯甲烷和柠檬酸盐溶液进行配体交换,反应后得到柠檬酸盐修饰的OA‑NaYF4:Yb,Er/Tm上转换纳米粒子;
3、称取合成的纳米粒子1mg溶于1ml MES的缓冲溶液(pH6)中,再分别加入NHS
(0.4M)和EDC(0.1M)在室温下避光搅拌反应10h后, 离心并清洗,将所得的纳米粒子与以MES为溶剂的5mg/L的血红蛋白溶液混合,血红蛋白的氨基与柠檬酸盐修饰的UCNP的羧基反应。将血红蛋白包裹后的纳米粒子与离心并清洗,备用;
4、将提前预处理的光纤置于5mL DMF中加入50mg NaH,孵育0.5小时,然后向溶液中加入1 mg KH‑560,接着将步骤三血红蛋白包裹的纳米粒子1mg加入上述溶液中,在90℃搅拌5小时后,逐滴加入NH3(在H2O中为25%)并搅拌12小时。然后依次用DMF、甲醇和水洗涤光纤,将光纤包裹复合纳米粒子得到基于上转换和血红蛋白的比率式氧传感器。
[0028] 基于上转换和血红蛋白的比率式氧传感器的外观(嵌入图:局部光学显微成像)如图2(a)所示,其表面的扫描电镜图像如图2(b)所示,图2(c)为NaYF4:Yb,Er/Tm上转换纳米粒子的透射电镜图像,从中可以看出合成的上转换纳米粒子分散性比较好,形状近似球形,粒子大小均一。
[0029] 实施方式2:本实施方式提供了利用实施方式1制备的基于上转换和血红蛋白的比率式氧传感器检测溶液中溶解氧浓度的方法,具体步骤如下:
S1:将基于上转换和血红蛋白的比率式氧传感器置入具有不同溶解氧浓度的溶液中反应;将980nm激发光源导入反应后的比率式氧传感器进行照射,滤除激发光后,检测光谱变化,获得不同溶解氧浓度下波长比率I654nm/I800nm的变化数据,构建波长比率I654nm/I800nm与溶解氧浓度的线性关系;
S2:将基于上转换和血红蛋白的比率式氧传感器置入待测溶液中反应;将980nm激发光源导入反应后的比率式氧传感器进行照射,滤除激发光后,检测光谱变化,获得波长比率I654nm/I800nm,进而根据波长比率I654nm/I800nm与溶解氧浓度的线性关系计算出待测溶液的溶解氧浓度。
[0030] 实施方式3:本实施方式为血红蛋白和上转换纳米粒子的光谱检测:
按照图1所示,利用实施方式1制备的比率式氧传感器搭建实验平台。用500mW,980 nm的激光激发比率式氧传感器上负载的上转换纳米粒子,经滤光片滤除激发光后,使用光纤光谱仪检测发射谱。用波长范围为400‑1000 nm的卤素灯,光源耦合到光纤耦合器的一端,使光源发出的光在光纤中传输,检测含氧血红蛋白和脱氧血红蛋白对光的吸收谱。图3(a)显示,血红蛋白吸收溶液中的氧转变为氧合血红蛋白,使血红蛋白对光的吸收度产生变化,从而导致上转换发光光谱的变化,654nm处发光光强提高,而800nm处发光光强没有变化,因此上转换654nm的光强变化反映了溶解氧的浓度。上转换光发射波长特征如图3(b)所示。
[0031] 实施方式4:向水溶液中吹入纯氧,获得不同溶解氧浓度的水溶液(溶解氧浓度分别为6.2mg/L、6.8mg/L、7.2mg/L、7.5mg/L、7.7mg/L)。按照图1所示,利用实施方式1制备的比率式氧传感器搭建实验平台,将比率式氧传感器置于不同溶解氧浓度的水溶液中,测量,并通过光谱仪记录测量的光谱。从而测得不同溶解氧浓度下654nm的发射光谱,如图4(a)所示。
[0032] 对饱和溶解氧水溶液进行吹入二氧化碳处理,减少水溶液中的溶解氧浓度,得到溶解氧浓度分别为7.7mg/L、7.1mg/L、6.6mg/L、6.3mg/L、6.0mg/L的水溶液,利用实施方式1制备的比率式氧传感器进行测量,并通过光谱仪记录测量的光谱。从而测得不同溶解氧浓度下654nm的发射光谱,如图4(b)所示。
[0033] 对上述获得的发射光谱进行处理,计算不同溶解氧浓度下I654nm/I800nm的值,得出随溶解氧浓度升高,而随之增大的光学信号。对该光学信号进行拟合,如图5所示,拟合系数为0.81046,其关系式为:Y=1.5161x‑9.14397;式中:Y表示I654nm/I800nm;x表示溶解氧浓度,mg/L。
[0034] 实施方式5:本实施方式提供一种外界干扰因素对于本发明中基于上转换和血红蛋白的比率式氧传感器的影响的检测:
1、温度是溶液中一种常见的影响因素,因此准备了相同溶解氧浓度下不同温度的样品溶液若干,让温度分别从273K到373K变化范围内利用本发明中基于上转换和血红蛋白的比率式传感器进行检测,结果如图6(a)所示。
[0035] 由图6(a)可知,溶解氧浓度不随温度的改变而改变,因此本发明中基于上转换和血红蛋白的比率式传感器不受温度的影响。
[0036] 2、环境水溶液中含有多种元素和分子,为了检测传感器的环境适应性,选取三种水溶液,包括自来水、河水和雨水;经充氧到含氧定值后使用本发明中基于上转换和血红蛋白的比率式氧传感器进行检测,在6mg/L溶解氧浓度下,分别三次检测样本溶液的溶解氧浓度,结果如图6(b)所示。
[0037] 由图6(b)可知,本发明中基于上转换和血红蛋白的比率式氧传感器测量溶解氧浓度和已知氧浓度均在可接受误差范围内,因此说明该传感器具有较强的抗干扰能力。
[0038] 上述实施方式只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。