技术领域
[0001] 本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种不饱和脂类双键位置异构的鉴定方法。
相关背景技术
[0002] 脂类是一类重要的生物分子，在生命活动中扮演着重要的角色，其生物功能的正常发挥在很大程度上取决于它的化学结构。不饱和脂类是在脂类分子中的脂肪链上含有碳碳不饱和双键（C=C）的脂质亚类，正是由于C=C键的存在，让不饱和脂类产生了大量的同分异构体，包括C=C键在脂肪链上的位置异构和C=C键的顺反异构。因此，结构的多样性也赋予了不饱和脂类在生物体系中的特殊生物功能。例如，不饱和脂质的C=C键位异构体比例与乳腺癌和脑缺血等多种疾病有显著相关性。此外，具有特定C=C键位置的不饱和脂质水平的变化可反映其独特的生物合成和代谢途径受到的干扰，这将提供病理机制的关键信息。因此对碳碳双键位置的准确鉴定和对不饱和脂类位置异构体的定量分析对了解疾病发生机制、代谢路径具有重要意义。
[0003] 质谱（Mass spectrum, MS）技术已广泛应用于不饱和脂类分析，其具有高灵敏度并且能够提供丰富的分子结构信息，是脂质结构研究的重要技术手段。基于质谱的分析方法通常可以分为 3 种：即通过 MS 直接进样检测的“鸟枪法”质谱技术、与液相色谱（Liquid chromatography, LC）、气相色谱（Gas chromatography, GC）等分离技术联用的质谱技术以及质谱成像技术（Mass spectrometry imaging, MSI）。其中气相色谱质谱技术（Gas chromatography–mass spectrometry, GC‑MS）被广泛用于脂肪酸分析，但一般需要甲基化后形成脂肪酸甲酯（FAME）的混合物再进行分析。GC‑MS是最传统的技术，用保留时间和相应的质谱来表征不饱和脂类的结构。MSI 被广泛用于脂质双键、脂肪酰基位置原位可视化研究。目前，仅使用MS来识别不饱和脂类中C=C键的位置仍然是一个挑战。不饱和脂类双键异构体不能用电子电离（Electron ionization, EI）来区分，因为它们的质谱图几乎相同。低能碰撞诱导解离（Collision‑Induced Dissociation, CID）是区分异构体结构的一种有效方法，但是，不饱和脂类双键异构体的片段离子不能用于定位C=C键。因为由于C=C键难以碎裂，很难产生针对C=C键的诊断离子。因此，选择性的C=C键衍生与串联质谱（MS/MS）的结合为鉴定脂质双键位置提供了很好的范例，而目前鉴定脂质双键位置的主流方法是基于臭氧解反应、Paternò‑Büchi 反应和环氧化反应形成的含氧杂环结构产物。现有技术中有一些根据上述反应来检测有关不饱和脂类双键位置异构体的方法，但这些检测方法需要对不饱和脂类再进行其他前处理步骤，操作时间长，装置复杂。
具体实施方式
[0038] 以下结合附图对本发明的技术方案进行详细的说明，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。
[0039] 如图1至图4b所述，本申请涉及一种不饱和脂类双键位置异构的鉴定方法，具体包括以下步骤：
[0040] （1）仪器、材料与试剂：
[0041] 仪器：P‑2000微电极拉制仪（美国Sutter Instruments公司）；PVD75 Proline SP磁控溅射镀膜仪（美国Kurt J. Lesker 公司）； LTQ‑Orbitrap Velos质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），所用离子源为自行搭建的纳米酶辅助电喷雾电离源；电子天平（精度0.1 mg，美国奥豪斯仪器有限公司）。
[0042] 材料与试剂：高纯铁靶材购自中诺新材（中国北京）；硼硅酸盐玻璃毛细管（BF100‑100‑7.5，外径1.00 mm，内径0.70 mm，美国Sutter Instrument公司）；乙腈（高效液相色谱纯）；油胺（纯度98%，中国北京百灵威试剂）；油酸（纯度98%，中国上海阿达玛斯试剂）；H2O2（分析纯，中国国药集团化学试剂有限公司）；试验所用超纯水购于哇哈哈（杭州娃哈哈集团有限公司）。
[0043] （2）Fe3O4纳米酶镀层喷针的制备：
[0044] 空白喷针的拉制：硼硅酸盐毛细管使用微电极拉制仪在一定参数下拉制获得针尖直径约为2 μm的毛细管喷针；微电极拉制仪的参数为：Line1: HEAT=270, FIL=2, VEL=24, DEL=128, PULL=45；Line2: HEAT=270, FIL=2, VEL=24, DEL=128, PULL=55；每一个玻璃毛细管都经过了一个全面的清洗过程，使用等离子体清洗剂，以消除其表面存在的有机杂质。
[0045] Fe溅射：将步骤（1）中拉制的空白喷针固定在自制的样品台上，其孔口以大约45°的角度面向溅射源，镀膜过程中设置旋转速度为10 r/min，以保证针尖内各处镀膜厚度均匀。磁控溅射镀膜仪在直流模式下，先以50 W功率进行Cr溅射30 s形成一层粘附层，再以100 W功率进行Fe溅射3 min，使喷针外表面及针尖内部均覆盖一层Fe薄层。
[0046] Fe层的退火处理：Fe涂层喷针放置在我们定制的大锅内，然后在马弗炉中处理，处理条件如下：从室温加热到400℃‑450℃，保持一段时间，然后自然冷却回室温。
[0047] （3）样品溶液的配制：
[0048] 油酸样品溶液的配制：以乙腈为溶剂，将油酸配制成浓度为50 μM/L的油酸样品溶液。
[0049] 油胺样品溶液的配制：以乙腈为溶剂，将油胺配制成浓度为5 μM/L的油胺样品溶液。
[0050] 其中，以H2O2为环氧化剂，所述样品溶液中H2O2的浓度为100 μM/L。
[0051] （4）油酸样品溶液和油胺样品溶液的质谱测定：油酸样品溶液和油胺样品溶液用微量上样器从尾部灌注进Fe3O4纳米酶镀层喷针3，之后将其置于质谱4入口前；在Fe3O4纳米酶镀层喷针3内插入导电铁丝1与高压电源2相连，通过高压电的施加触发纳米酶辅助电喷雾电离，实现质谱检测。
[0052] 其中，在步骤（3）中，实现电喷雾电离是在喷针3尾部插入导电铁丝1，由一端带有鳄鱼钳的绝缘高压电源线2夹持导电铁丝1前端；高压线另一端与质谱仪4高压源连接，用于施加喷雾电压，实现质谱监测分析。
[0053] 本申请中，所述Fe3O4纳米酶镀层喷针3距离质谱入口约5 mm。
[0054] 本申请中，所述导电铁丝1尾部距离Fe3O4纳米酶镀层喷针3针尖约3‑4cm。
[0055] 本申请中，所采用的质谱仪4为LTQ‑Orbitrap Velos质谱仪。
[0056] 其中，质谱仪的方法参数如下：正离子检测模式（油胺）；喷雾电压：优化范围0.8‑1.6 kV；毛细管温度：350℃；最大注入时间：50 ms；碰撞气：氦气（纯度≥99.999%）；一级质谱采用傅里叶变换高分辨全扫描模式，分辨率：30000；串联质谱采用数据依赖性扫描，碰撞模式：高能量碰撞解离，其他未作说明的参数均使用仪器默认值。
[0057] 负离子检测模式（油酸）；喷雾电压：优化范围0.8‑1.6 kV；毛细管温度：350℃；最大注入时间：50 ms；碰撞气：氦气（纯度≥99.999%）；一级质谱采用傅里叶变换高分辨全扫描模式，分辨率：30000；串联质谱采用数据依赖性扫描，碰撞模式：高能量碰撞解离，其他未作说明的参数均使用仪器默认值。
[0058] 结论：
[0059] 通过本发明的方法对不饱和脂类进行环氧化反应，裂解所得环氧化产物，通过二级质谱图可以得到其特有的双键诊断离子，他们的双键诊断离子质荷比相差16，与C=C键完全对应，说明本方法可以快速、准确、高灵敏的不饱和脂类双键位置异构体。
[0060] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明。对于本领域相关技术人员而言，本发明均有各种更改和变化。凡在本发明相关原理及其实施方法之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
