[0001] 本发明涉及药物化学以及药物分析化学领域，尤其涉及不饱和多黏菌素及其双键位置的判定方法。

[0002] 多黏菌素(Polymyxin，PM)由多黏类芽孢杆菌发酵产生的多组分脂肽类混合物，主要药用组分为多黏菌素B(PMB)或多黏菌素E(PME，或称为黏菌素，Colistin)，临床上主要应用硫酸多黏菌素B或多黏菌素E或多黏菌素E甲磺酸钠作为“最后一道防线”来治疗多重耐药革兰阴性菌感染。由于是发酵产物，PME含有多种组分，主要组分如PME1、PME2、PME3、PME4、PME6的结构已经确定(《欧洲药典》10.0版)，但仍然存在未知组分。张含智等人通过HPLC‑Q/TOF‑MS发现了新型的双键化PMB组分，并经组分制备、核磁确定了双键位置，命名为2',3'‑脱氢PMB1(张含智，秦峰，刘浩，“高效液相色谱质谱联用分析硫酸多黏菌素B中的未知杂质”，《中国药学杂志》，2018，53(11)：918；张含智，孙宁，刘笑芬，刘浩等，“双键化多黏菌素B1的结构分析及其抗菌活性的初步研究”，《国外医药抗生素分册》，2020，41(6)：475)。并在多黏菌素E中也发现了双键化PME组分，《欧洲药典》10.0版中收载了2',3'‑脱氢PME1。仅通过液质联用技术无法明确判定双键位置，而组分制备会消耗大量的溶剂，进一步通过帕特诺‑比希 反应即双键化PM会与丙酮等羰基化合物形成四元环氧化合物可辅助判断双键位置，但存在误判(张含智，孙宁，秦峰，刘浩，“基于高效液相色谱‑四级杆飞行时间质谱的硫酸多黏菌素E组分的结构分析”，《中国药学杂志》，2021，56(1)：54)。

[0003] 本发明公开了一种通过光化学反应将双键化多黏菌素转化为环氧化多黏菌素、二羟基化多黏菌素的方法，并通过HPLC‑Q/TOF‑MS建立了环氧化多黏菌素、二羟基化多黏菌素的结构解析策略，通过以上方法可以判定不饱和多黏菌素的双键位置，避免了组分制备过程。以新型的环氧化多黏菌素如2',3'‑环氧化多黏菌素E1、2',3'‑环氧化多黏菌素E2和二羟基化合物如2',3'‑二羟基多黏菌素E1和2',3'‑二羟基多黏菌素E2为实施例具体阐明了本发明的具体内容。本发明的结构分析方法也可用于环氧化多黏菌素或二羟基化多黏菌素组分的结构判断，为严格控制多黏菌素的质量提供了研究基础。

[0036] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0037] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合；本发明中涉及的多黏菌素E，以硫酸多黏菌素E《欧洲药典》对照品为具体实施案例，但也适用于其他多黏菌素E对照品及制剂中。

[0038] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。

[0039] 实施例

[0040] ①仪器与试药

[0041] Agilent 1290型高效液相色谱仪‑6550QTOF‑MS(美国Agilent Technologies公司)，WFH‑203B三用紫外分析仪(上海驰唐电子有限公司)。

[0042] 硫酸多黏菌素E《欧洲药典》对照品(批号：3.3)。

[0043] ②实验条件

[0044] 选用Diamonsil Plus C18色谱柱(25cm×4.6mm，5μm)，流动相A为含0.1％三氟乙酸的水溶液：乙腈(体积比为95:5)，流动相B为含0.1％甲酸的乙腈溶液，等度洗脱(流动相A与流动相B的洗脱体积比为80:20)，流速为1mL/min，柱温为40℃；进样量为10μL。

[0045] 选用离子化方式为电喷雾离子化(正离子采集模式)，质量分析器为四级杆飞行时间质谱(ESI‑Q/TOF‑MS)，扫描范围为m/z 50‑1700，选用二级质谱的碰撞能量为20eV。

[0046] ③环氧化PME及双羟基化PME的制备

[0047] 精密称取多黏菌素E对照品10mg，于水‑乙腈(4:1)5mL中溶解(终浓度为2mg/mL)，置于紫外灯(波长为254nm)下照射7h。经HPLC‑Q/TOF‑MS分析得到总离子流图如图2所示，图中已标示出PME1和PME2的出峰位置，峰1为2',3'‑二羟基多黏菌素E2(2',3'‑dihydroxy PME2)，峰2包含2',3'‑环氧化多黏菌素E2(2',3'‑epoxidized PME2)和2',3'‑环氧化多黏菌素E1(2',3'‑epoxidized PME1)，峰3为2',3'‑二羟基多黏菌素E1(2',3'‑dihydroxy PME1)。

[0048] ④2',3'‑环氧化多黏菌素E1和2',3'‑二羟基多黏菌素E1的结构解析

[0049] 以2',3'‑环氧化多黏菌素E1(峰2)为例介绍环氧化多黏菌素的结构解析过程，其2+
一级质谱的准分子离子峰m/z为592.38([M+2H] )，如图3所示。以其为母离子，调整二级质谱的碰撞电压为20eV，获得二级质谱图，如图4所示，根据环氧化组分的特征离子为m/z 
857.53、757.45、456.29、255.17、155.11和127.11，归纳2',3'‑环氧化多黏菌素E1的质谱裂解规律如图5所示。2',3'‑环氧化多黏菌素E1首先丢失环肽上的(D‑Leu+L‑Leu+L‑Dab)得到碎片离子m/z 857.53，继而从环肽端逐渐丢失L‑Dab得到碎片离子m/z 757.45，继续失去环肽上(L‑Thr+L‑Dab)得到碎片离子m/z 456.29，即为环氧化脂肪酰基+线性三肽的特征离子，继续失去线性肽上(L‑Thr+L‑Dab)得到碎片离子m/z 255.17，进一步失去L‑Dab得到的m/z 155.11为环氧化脂肪酰基链的特征离子，继续失去一分子CO得到环氧化烷基链的特征离子m/z 127.11。

[0050] 以2',3'‑二羟基多黏菌素E1(峰3)为例介绍二羟基多黏菌素的结构解析过程，其2+
一级质谱的准分子离子峰m/z为601.38([M+2H] )，如图7所示。以其为母离子，调整二级质谱的碰撞电压为20eV，获得二级质谱图，如图8所示，根据二羟基化组分的特征离子为m/z 
875.53、775.47、474.29、273.18、155.11和113.10，归纳2',3'‑二羟基多黏菌素E1的质谱裂解规律如图9所示。2',3'‑二羟基多黏菌素E1首先丢失环肽上的(D‑Leu+L‑Leu+L‑Dab)得到碎片离子m/z 875.53，继而从环肽端逐渐丢失L‑Dab得到碎片离子m/z 775.47，继续失去环肽上(L‑Thr+L‑Dab)得到碎片离子m/z 474.29，即为二羟基脂肪酰基+线性三肽的特征离子，继续失去线性肽上(L‑Thr+L‑Dab)得到碎片离子m/z 273.18，进一步失去L‑Dab得到的m/z 155.11为二羟基脂肪酰基链的特征离子，该离子存在两种脱水方式，如图9中的I和II两种方式，I为失去3'位失去羟基并与2'位碳上氢脱除一分子水后的碎片离子，经烯醇式转化为2'位羰基的脂肪酰基离子；II为失去2'位失去羟基并与3'位碳上氢脱除一分子水后的碎片离子，经烯醇式转化为3'位羰基的脂肪酰基离子，继续碎裂得到γ‑甲基己酰基的特征离子m/z 113.10。

[0051] 通过对2',3'‑环氧化多黏菌素E1和2',3'‑二羟基多黏菌素E1的结构解析，可以反推得知双键化多黏菌素E1在光照(254nm)条件下发生了环氧化及开环反应(图1)，进一步可判断出双键位于脂肪酰基的2'和3'碳上。

[0052] 光化学反应生成的环氧化合物和二羟基化合物结合基于高分辨质谱的结构解析策略可以判断不饱和多黏菌素的双键位置。

[0053] ⑤2',3'‑环氧化多黏菌素E2和2',3'‑二羟基多黏菌素E2的结构解析

[0054] 根据如上建立的环氧化多黏菌素和二羟基多黏菌素的结构解析策略可以用于2',3'‑环氧化多黏菌素E2和2',3'‑二羟基多黏菌素E2的结构解析中。峰1中组分的准分子离子
2+
峰m/z为594.38([M+2H] )，如图10所示。以其为母离子获得二级质谱图，如图11所示，根据二羟基化组分的特征离子m/z 861.15、761.46、460.28、259.17和141.09，判断该组分为2',
3'‑二羟基多黏菌素E2。

[0055] 峰2中的另一组分的准分子离子峰m/z为585.37([M+2H]2+)，如图3所示。以其为母离子获得二级质谱图，如图6所示，根据二羟基化组分的特征离子m/z843.50、743.44、442.27、342.20、241.16、141.09和113.09判断该组分为2',3'‑环氧化多黏菌素E2。

[0056] 通过对2',3'‑环氧化多黏菌素E2和2',3'‑二羟基多黏菌素E2的结构解析，可以反推得知双键化多黏菌素E2在光照(254nm)条件下发生了环氧化及开环反应，进一步可判断出双键位于脂肪酰基的2'和3'碳上。

[0057] 综上所述，本发明公开了一种环氧化多黏菌素、二羟基化多黏菌素及其结构分析方法，并且通过该方法可以判定不饱和多黏菌素的双键位置。所述的不饱和多黏菌素即2',3'‑脱氢多黏菌素在光照条件下可以生成环氧化多黏菌素和二羟基化多黏菌素，该类组分的结构经HPLC‑Q/TOF‑MS及二级质谱确证。本发明公开了完善的环氧化多黏菌素、二羟基化多黏菌素的解析规律及含有环氧化碎片离子及二羟基化碎片离子的结构。这种新型的环氧化多黏菌素被命名为2',3'‑环氧化多黏菌素E1和2',3'‑环氧化多黏菌素E2，二羟基化多黏菌素被命名为2',3'‑二羟基多黏菌素E1和2',3'‑二羟基多黏菌素E2。本发明的结构分析方法可用于其他环氧化或二羟基化多黏菌素组分的结构判断，为严格控制多黏菌素的质量提供了研究基础。

[0058] 以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。