具体技术细节
[0004] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供不饱和多黏菌素及其双键位置的判定方法。
[0005] 多黏菌素的组成单元包括N‑脂肪酰基以及L‑构型或D‑构型的氨基酸；所述N‑脂肪酰基包括6'‑甲基辛酰基(PME1的N‑脂肪酰基)、6'‑甲基庚酰基(PME2的N‑脂肪酰基)、7'‑甲基辛酰基(PME1‑7'MOA的N‑脂肪酰基)、辛酰基(PME3的N‑脂肪酰基)、庚酰基(PME4的N‑脂肪酰基)、3'‑羟基‑6'‑甲基辛酰基(PME6的N‑脂肪酰基)、3'‑羟基‑6'‑甲基庚酰基、己酰基，但不限于以上N‑脂肪酰基；所述氨基酸包括α,γ‑二氨基丁酸(Dab)、苏氨酸(Thr)、亮氨酸(Leu)或异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、缬氨酸(Val)或正缬氨酸(Nva)、丝氨酸(Ser)、甲硫氨酸(Met)，但不限于以上氨基酸；而不饱和多黏菌素的双键可能位于所述N‑脂肪酰基的所有位点。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0007] 本发明的第一方面是提供一种不饱和多黏菌素中双键位置的判定方法，所述不饱和多黏菌素在光照条件下生成环氧化多黏菌素或/和二羟基化多黏菌素(但不限于以上组分，可能还包括其他多黏菌素氧化产物、差向异构化产物、水解产物、硫酸化产物、磺酸化产物、甲磺酸化产物等)，经高效液相色谱‑高分辨质谱或/和高效液相色谱‑二级质谱确证组分的结构，即可判定所述不饱和多黏菌素中双键的位置；
[0008] 其中，所述多黏菌素包括多黏菌素E或/和多黏菌素B等；优选地，所述多黏菌素包括多黏菌素E/B原料药、硫酸多黏菌素E/B、磺酸多黏菌素E/B或多黏菌素E/B甲磺酸钠等片剂、软膏剂或其他制剂；进一步地，所述多黏菌素为硫酸多黏菌素E(欧洲药典对照品，批号：3.3)；
[0009] 所述多黏菌素E的主要组分包括多黏菌素E1或/和多黏菌素E2，其他组分包括多黏菌素E3、多黏菌素E4、多黏菌素E6、多黏菌素E1‑7'MOA、多黏菌素E1‑I、多黏菌素E2‑I、多黏菌素E1‑Val、多黏菌素E2‑Val、多黏菌素E1‑Ser、多黏菌素E2‑Ser，但不限于以上组分；以上组分均有可能存在相应的双键化组分，优选地，所述不饱和多黏菌素主要包括多黏菌素E1双键化组分或/和多黏菌素E2双键化组分；进一步地，所述不饱和多黏菌素为2',3'‑脱氢多黏菌素E1和2',3'‑脱氢多黏菌素E2。
[0010] 优选地，所述不饱和多黏菌素在光照前溶解所选用的溶剂包括水、乙腈、甲醇、丙酮、乙醛、N,N‑二甲基甲酰胺或二甲亚砜中的一种或多种。
[0011] 进一步地，所述不饱和多黏菌素在光照前溶解所选用的溶剂为水：乙腈，其体积比为9:1‑1:9，且所述不饱和多黏菌素溶解后的终浓度为0.1mg/mL‑20mg/mL。
[0012] 优选地，所述光照所选用的光源为紫外灯，其紫外波长为190nm‑400nm；所选用的照射时间为0.5h‑24h。
[0013] 优选地，所述高效液相色谱所选用的反相色谱柱，其填料包括十八烷基(C18)键合的硅胶基质、八烷基(C8)键合的硅胶基质或四烷基(C4)键合的硅胶基质中的一种或多种，柱长为5‑30cm，直径为1‑10mm，填料粒径为1‑10μm；所选用的流动相A为含三氟乙酸的水溶液：乙腈，其体积比为99:1‑80:20，所述三氟乙酸的含量为0.01％‑1％；所选用的流动相B为含甲酸或/和乙酸的甲醇或/和乙腈溶液，所述甲酸或/和乙酸的含量为0.01％‑1％；所选用的洗脱方式为等度洗脱，所述流动相A与所述流动相B的洗脱体积比为70:30‑95:5；所选用的流速为0.5mL/min‑1.5mL/min；所选用的柱温为20℃‑50℃；所选用的进样体积为1μL‑100μL。
[0014] 优选地，所述高分辨质谱以及所述二级质谱所选用的离子化方式包括电喷雾离子化、大气压离子化、快原子轰击离子化中的一种或多种；所选用的质量分析器包括四级杆飞行时间质谱、三重四级杆质谱、离子肼质谱、轨道离子肼质谱中的一种或多种；所选用的扫描范围均为m/z 50‑1700；所述二级质谱所选用的碰撞能量设置范围为5‑50eV。
[0015] 本发明的第二方面是提供一种不饱和多黏菌素，所述不饱和多黏菌素为2',3'‑脱氢多黏菌素E1，其结构如式(I)所示；采用如上所述的判定方法，所述2',3'‑脱氢多黏菌素E1在光照条件下生成2',3'‑环氧化多黏菌素E1和2',3'‑二羟基化多黏菌素E1，经高效液相色谱‑二级质谱确证：所述2',3'‑环氧化多黏菌素E1的结构如式(II)所示，其分子量为m/z 2+
592.38([M+2H] )，其特征离子为m/z 857.53、757.45、456.29、255.17、155.11和127.11；所
2+
述2',3'‑二羟基化多黏菌素E1的结构如式(III)所示，其分子量为m/z 601.38([M+2H] )，其特征离子为m/z 875.53、775.47、474.29、273.18、155.11和113.10；
[0016]
[0017] 本发明的第三方面是提供一种不饱和多黏菌素，所述不饱和多黏菌素为2',3'‑脱氢多黏菌素E2，其结构如式(IV)所示；采用如上所述的判定方法，所述2',3'‑脱氢多黏菌素E2在光照条件下生成2',3'‑环氧化多黏菌素E2和2',3'‑二羟基化多黏菌素E2，经高效液相色谱‑二级质谱确证：所述2',3'‑环氧化多黏菌素E2的结构如式(V)所示，其分子量为m/z 2+
585.37([M+2H] )，其特征离子为m/z 843.50、743.44、442.27、342.20、241.16、141.09和
113.09；所述2',3'‑二羟基化多黏菌素E2的结构如式(VI)所示，其分子量为m/z 594.38([M
2+
+2H] )，其特征离子为m/z 861.15、761.46、460.28、259.17和141.09；
[0018]
[0019] 优选地，所述环氧化多黏菌素或/和所述双羟基化多黏菌素，2'‑碳或/和3'‑碳的手性为R型或S型。
[0020] 本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0021] (1)本发明首次通过光照双键化多黏菌素获得了环氧化多黏菌素及双羟基化多黏菌素；
[0022] (2)本发明首次建立了基于高分辨质谱的环氧化多黏菌素及双羟基化多黏菌素的结构解析策略，并首次公布了2',3'‑环氧化多黏菌素E1、2',3'‑环氧化多黏菌素E2、2',3'‑二羟基多黏菌素E1及2',3'‑二羟基多黏菌素E2的结构；
[0023] (3)本发明中的技术方法可以用于判断双键化多黏菌素中不饱和键的位置而无需经过组分制备，节省试剂及人工成本；
[0024] (4)本发明中的环氧化多黏菌素及双羟基化多黏菌素的合成及结构确定方法适合于其他多肽类抗生素组分，简单高效，易于推广。
法律保护范围
涉及权利要求数量10：其中独权3项，从权-3项
1.一种不饱和多黏菌素中双键位置的判定方法，其特征在于，所述不饱和多黏菌素在光照条件下生成环氧化多黏菌素或/和二羟基化多黏菌素，经高效液相色谱‑高分辨质谱或/和高效液相色谱‑二级质谱确证组分的结构，即可判定所述不饱和多黏菌素中双键的位置。
2.根据权利要求1所述的判定方法，其特征在于，所述不饱和多黏菌素包括不饱和多黏菌素E或/和不饱和多黏菌素B。
3.根据权利要求2所述的判定方法，其特征在于，所述不饱和多黏菌素E包括不饱和多黏菌素E1、不饱和多黏菌素E2、不饱和多黏菌素E3、不饱和多黏菌素E4、不饱和多黏菌素E6、不饱和多黏菌素E1‑7'MOA、不饱和多黏菌素E1‑I、不饱和多黏菌素E2‑I、不饱和多黏菌素E1‑Val、不饱和多黏菌素E2‑Val、不饱和多黏菌素E1‑Ser或不饱和多黏菌素E2‑Ser中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的判定方法，其特征在于，所述不饱和多黏菌素在光照前溶解所选用的溶剂包括水、乙腈、甲醇、丙酮、乙醛、N,N‑二甲基甲酰胺或二甲亚砜中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的判定方法，其特征在于，所述不饱和多黏菌素在光照前溶解所选用的溶剂为水：乙腈，其体积比为9:1‑1:9，且所述不饱和多黏菌素溶解后的终浓度为
0.1mg/mL‑20mg/mL。
6.根据权利要求1所述的判定方法，其特征在于，所述光照所选用的光源为紫外灯，其紫外波长为190nm‑400nm；所选用的照射时间为0.5h‑24h。
7.根据权利要求1所述的判定方法，其特征在于，所述高效液相色谱所选用的反相色谱柱，其填料包括十八烷基键合的硅胶基质、八烷基键合的硅胶基质或四烷基键合的硅胶基质中的一种或多种，柱长为5‑30cm，直径为1‑10mm，填料粒径为1‑10μm；所选用的流动相A为含三氟乙酸的水溶液：乙腈，其体积比为99:1‑80:20，所述三氟乙酸的含量为0.01％‑1％；
所选用的流动相B为含甲酸或/和乙酸的甲醇或/和乙腈溶液，所述甲酸或/和乙酸的含量为
0.01％‑1％；所选用的洗脱方式为等度洗脱，所述流动相A与所述流动相B的洗脱体积比为
70:30‑95:5；所选用的流速为0.5mL/min‑1.5mL/min；所选用的柱温为20℃‑50℃；所选用的进样体积为1μL‑100μL。
8.根据权利要求1所述的判定方法，其特征在于，所述高分辨质谱以及所述二级质谱所选用的扫描范围均为m/z 50‑1700；所述二级质谱所选用的碰撞能量设置范围为5‑50eV。
9.一种不饱和多黏菌素，其特征在于，所述不饱和多黏菌素为2',3'‑脱氢多黏菌素E1，其结构如式(I)所示；采用如权利要求1所述的判定方法，所述2',3'‑脱氢多黏菌素E1在光照条件下生成2',3'‑环氧化多黏菌素E1和2',3'‑二羟基化多黏菌素E1，经高效液相色谱‑二级质谱确证：所述2',3'‑环氧化多黏菌素E1的结构如式(II)所示，其分子量为m/z
2+
592.38([M+2H] )，其特征离子为m/z 857.53、757.45、456.29、255.17、155.11和127.11；所
2+
述2',3'‑二羟基化多黏菌素E1的结构如式(III)所示，其分子量为m/z 601.38([M+2H] )，其特征离子为m/z 875.53、775.47、474.29、273.18、155.11和113.10；
10.一种不饱和多黏菌素，其特征在于，所述不饱和多黏菌素为2',3'‑脱氢多黏菌素E2，其结构如式(IV)所示；采用如权利要求1所述的判定方法，所述2',3'‑脱氢多黏菌素E2在光照条件下生成2',3'‑环氧化多黏菌素E2和2',3'‑二羟基化多黏菌素E2，经高效液相色谱‑二级质谱确证：所述2',3'‑环氧化多黏菌素E2的结构如式(V)所示，其分子量为m/z
2+
585.37([M+2H] )，其特征离子为m/z 843.50、743.44、442.27、342.20、241.16、141.09和
113.09；所述2',3'‑二羟基化多黏菌素E2的结构如式(VI)所示，其分子量为m/z 594.38([M
2+
+2H] )，其特征离子为m/z 861.15、761.46、460.28、259.17和141.09；
