本发明涉及一种不饱和多黏菌素中双键位置的判定方法，所述不饱和多黏菌素在光照条件下生成环氧化多黏菌素或/和二羟基化多黏菌素(但不限于以上组分，可能还包括其他多黏菌素氧化产物、差向异构化产物、水解产物、硫酸化产物、磺酸化产物、甲磺酸化产物等)，经高效液相色谱‑高分辨质谱或/和高效液相色谱‑二级质谱确证组分的结构，即可判定所述不饱和多黏菌素中双键的位置。本发明可以用于判断双键化多黏菌素中不饱和键的位置而无需经过组分制备，节省试剂及人工成本；环氧化多黏菌素及双羟基化多黏菌素的合成及结构确定方法适合于其他多肽类抗生素组分，简单高效，易于推广。