[0001] 本发明涉及新材料技术领域，尤其是涉及一种搭载黄芩苷壳聚糖纳米粒的角膜接触镜及其制备方法和应用。

[0002] 传统的角膜损伤治疗将药物装载到角膜接触镜中最简单、最常见的方法是将角膜接触镜浸泡在药物溶液中，让药物吸收到角膜接触镜中。该方法是将预成型的角膜接触镜浸泡在含有目标药物的溶液中，角膜接触镜内部具有接收和容纳药物的水通道，药物的转移是通过角膜接触镜中的水通道和浸泡药物之间的浓度差来实现。角膜接触镜的载药量取决于含水量、镜片厚度、药物分子量、浸泡时间和浸泡液中药物浓度等参数。部分研究人员使用浸泡法将各种眼科药物(如毛果芸香碱、噻吗洛尔、地塞米松、透明质酸、氨基糖苷类和氟喹诺酮类)载入角膜接触镜中。尽管浸泡法简单且方便，但也存在一些局限性和挑战。传统的角膜损伤治疗药物不仅具有生物利用度低等缺点，而且不具备调节眼表微环境的功能(如图10所示)。

[0003] 通过载纳米粒的角膜接触镜来递送眼科药物是一种具有前景的方法，在制备过程中需要更多地关注纳米粒对镜片机械和物理性能的影响。还需要检查放大、药物稳定性、剂量调整、提取、灭菌和储存过程中的药物损失等制剂问题。多项临床前研究和临床调查已经证明了这些载药接触镜的潜力。然而，在许多实验室研究转化为临床试验之前，还有许多问题需要解决。

[0057] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0058] 以下各实施例中，所述材料来源如下所示：

[0059] 人角膜上皮细胞(HCECs)购买自青旗(上海)生物技术发展有限公司。

[0060] 下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互结合。

[0061] 实施例1

[0062] 本实施例提供一种确定制备黄芩苷壳聚糖纳米粒过程中的影响因素方法，先根据单因素实验确定制备过程中各影响因素的高低水平，然后采用Plackett‑Burman设计研究影响黄芩苷壳聚糖纳米粒包封率的最主要因素，选定对包封率影响最大的三个因素，代入到Box‑Behnken设计来确定实现最大包封率的最佳条件。具体步骤如下：

[0063] S1、单因素实验：将其他影响因素固定，只考察其中一个因素对结果的影响的实验称为单因素实验。在单因素实验的基础上，按实施例2所述的方法制备黄芩苷壳聚糖纳米粒。

[0064] S1‑1、单因素实验中的固定量为壳聚糖：黄芩苷(CS:BC)的质量比4:1，壳聚糖：磷酸三苯酯(CS:TPP)质量比3:1，黄芩苷壳聚糖溶液的pH为5，TPP加入速度1mL/min，搅拌时间20min，搅拌速度800r/min。

[0065] S1‑2、将上述六个因素中的其他五个因素固定，分别考察CS:BC质量比(1:1,2:1,3:1,4:1,5:1)，CS:TPP质量比(2:1,3:1,4:1,5:1,6:1)，黄芩苷壳聚糖溶液pH(3,3.5,4,
4.5,5)，TPP加入速度(0.5,1,1.5,2,2.5mL/min)，搅拌时间(0,20,40,60,80min)和搅拌速度(200,400,600,800,1000r/min)等单个因素对包封率的影响，按照研究中包封率的测定方法对不同条件下制备的黄芩苷壳聚糖纳米粒的包封率进行测定，每组实验重复三次，以此来确定每个因素的高低水平。

[0066] S2、Plackett‑Burman筛选试验：

[0067] Plackett‑Burman设计是一种高效的筛选方法，可以筛选出具有显著影响的因子，用于确定影响黄芩苷壳聚糖纳米粒包封率的最主要因素。

[0068] Plackett‑Burman设计是一种两级设计，用于在N次运行中研究k个变量，其中N是4的倍数且N≥k+1，每个因素的高低水平是根据单因素实验确定的。

[0069] 由此得出一阶多项式的数学模型式。使用Design Expert软件对结果进行方差分析。

[0070]

[0071] 其中，Y是实验响应；b0是响应的平均值；Xi是编码的独立因子；系数bi代表Xi的因子效应。

[0072] S3、Box‑Behnken试验：

[0073] Box‑Behnken设计优化并减少了实验次数，同时也考虑到了研究因素之间可能存在的相互作用及其对响应的影响。根据Plackett‑Burman设计的结果，筛选出影响包封率的三个最主要因素，代入到Design Expert软件中进行Box‑Behnken设计。

[0074] Box‑Behnken设计采用多元二次方程拟合影响因子和响应值之间的函数关系，回归方程如式所示。Box‑Behnken设计模型的有效性和可靠性由方差分析(Design Expert软件)确定。

[0075]

[0076] 其中，Y是实验响应；b0代表常数；bi、bii和bij是回归系数；Xi和Xj是独立因素的编码值。

[0077] 由Box‑Behnken设计结果，推算出制备黄芩苷壳聚糖纳米粒的最优方案，根据最优的制备方案，平行三组制备黄芩苷壳聚糖纳米粒，按照本研究中包封率的测定方法，对优化后制得的黄芩苷壳聚糖纳米粒的包封率进行测定。

[0078] 本实施例采用离子交联法成功制备了BC‑NPs，并利用Plackett‑Burman设计筛选出具有显著影响的因子，用于确定影响黄芩苷壳聚糖纳米粒包封率的最主要因素，通过Box‑Behnken设计推算出制备黄芩苷壳聚糖纳米粒的最优方案，根据最优的制备方案，平行三组制备黄芩苷壳聚糖纳米粒，综上研究方法对其制备处方和工艺进行优化。

[0079] 壳聚糖：黄芩苷质量比对包封率的影响结果如图5(a)所示，CS占比越大，BC‑NPs的包封率也越大。但是当BC:CS比例为1:1时，黄芩苷加入到壳聚糖乙酸溶液后迅速产生絮状沉淀，这可能是因为随着黄芩苷含量增加，黄芩苷在壳聚糖乙酸溶液中达到饱和后沉淀析出。因此，无法确定CS:BC质量比这个因素的高低水平。为了保证黄芩苷壳聚糖纳米粒有最大的包封率，选择CS:BC质量比为2:1进行后续的实验。

[0080] 壳聚糖：三聚磷酸钠质量比对包封率的影响的结果如图5(b)所示，CS:TPP质量比为3:1时包封率最大，由此确定CS:TPP质量比这一因素的低水平组为2:1，高水平组为4:1。可以观察到，当CS:TPP质量比为2:1时，黄芩苷壳聚糖纳米粒混悬液放置一段时间后出现沉淀，这可能是因为CS的浓度过高，溶液中没有足够的TPP与之交联，无法形成稳定的纳米颗粒。

[0081] 黄芩苷壳聚糖溶液的pH对包封率的影响的结果如图5(c)所示，pH为3.5时包封率最大，故确定该因素的低水平组为pH 3.5，高水平组为pH 4。当溶液处于酸性条件时，壳聚糖上的氨基带正电荷，能与TPP上的负电荷通过静电相互作用形成稳定的纳米粒。但pH值越低，壳聚糖所带正电荷越多，壳聚糖容易在TPP周围大量聚集，导致合成的纳米粒粒径过大且不稳定。而pH值过高则会导致壳聚糖所带正电荷减少，不能很好地与TPP结合形成稳定的纳米粒，而是以絮状沉淀的形式存在。

[0082] 三聚磷酸钠加入速度对包封率的影响的结果如图5(d)所示，加入速度为1mL/min时，包封率最大，因此确定该因素的低水平组为0.5mL/min，高水平组为1.5mL/min。加入速度过快或者过慢，TPP都不能很好地与CS结合形成稳定的纳米粒。

[0083] 搅拌时间对包封率的影响的结果如图5(e)所示，搅拌时间为20min时包封率最大，故搅拌时间这一因素的低水平组为0min，高水平组为40min。搅拌时间过短，壳聚糖与TPP不能充分交联。搅拌时间过长，可能导致纳米粒破裂，药物释放，造成包封率下降。

[0084] 搅拌速度对包封率的影响的结果如图5(f)所示，搅拌速度为800r/min时包封率最大，因此搅拌速度这一因素的低水平组为600r/min，高水平组为1000r/min。搅拌速度过慢会使得CS和TPP不能充分交联而产生沉淀，搅拌速度过快则会导致液体飞溅而造成损失，影响实验结果的准确性。

[0085] 根据单因素实验结果，确定对CS:TPP质量比，BC‑CS溶液的pH，TPP加入速度，搅拌时间和搅拌速度等5个影响因素进行评价，每个因素取最低(‑1)和最高(+1)两个水平，并对因素水平进行编码(表1)。通过Design Export软件进行Plackett‑Burman设计，将每个因素的高低水平代入到软件中，生成12组黄芩苷壳聚糖纳米粒的制备方案。根据该方案制备BC‑NPs，每个方案平行3组，分别测定它们的包封率，将得到的包封率结果输入到软件中(表2)，并对Plackett‑Burman设计结果进行方差分析。方差分析结果表明(表3)，该模型F值大，P值2
小，R＝0.9946，模型具有统计学意义(P<0.001)。以上5种因素对包封率大小的影响依次为X1(CS:TPP质量比)>X2(黄芩苷壳聚糖溶液的pH)>X3(TPP加入速度)>X4(搅拌时间)>X5(搅拌速度)。其中，黄芩苷壳聚糖溶液的pH和CS:TPP质量比对包封率的影响极显著(P<0.01)，TPP加入速度对包封率的影响显著(P<0.05)，搅拌时间和搅拌速度对包封率的影响不显著(P>
0.05)。因此，黄芩苷壳聚糖溶液的pH，CS:TPP质量比和TPP加入速度是影响黄芩苷壳聚糖纳米粒包封率的主要因素。考虑到时间成本问题，后续实验的搅拌时间确定为20min。搅拌速度过快容易导致液体飞溅，造成损失，故后续实验将搅拌速度确定为800r/min。

[0086] 表1Plackett‑Burman设计中使用的因素水平和编码值

[0087]

[0088] 表2Plackett‑Burman设计的结果

[0089]

[0090] 表3Plackett‑Burman设计的方差分析

[0091]

[0092]

[0093] Note：R2＝0.9946，Adj R2＝0.9902；***P<0.001，*P<0.05.

[0094] 根据Plackett‑Burman设计，确定了CS:TPP质量比，黄芩苷壳聚糖溶液的pH和TPP加入速度是影响黄芩苷壳聚糖纳米粒包封率的主要因素。每个因素设置低、中、高三个水平，每个水平的具体数值根据单因素实验获得。将每个因素的三个水平分别代入Design Export软件中进行Box‑Behnken设计，得到17组实验方案。根据拟定的实验方案进行实验，每个方案平行做三组，分别测定它们的包封率，将测得的包封率数据代入Design Export软件中，对Box‑Behnken设计进行方差分析，包封率数据如表4所示。可得到包封率(Y)对CS:TPP质量比(X1)，黄芩苷壳聚糖溶液的pH(X2)，TPP加入速度(X3)的回归方程：

[0095] Y＝42.50+14.98X1‑1.98X2‑1.76X3‑0.5475X1X2+3.53X1X3+0.72X2X3‑14.99X12‑2 2
7.29X2‑1.80X3

[0096] 对回归方程进行方差分析(表6)，该回归方程F值大，P值小(P<0.01)，失拟项不显2
著(P＝0.1421>0.05)，表明该模型具有统计学意义。模型的R ＝0.9950，表明相关性为
2
99.50％，拟合程度良好。校正R ＝0.9886，表明了预测值与实际值具有高度一致性，说明该
2
回归方程可靠，可用于黄芩苷壳聚糖纳米粒包封率的预测和分析。预测的R ＝0.9413低于
2
校正R ，这两个值的差值小于0.2，说明实验数据与模型结果具有较高的兼容性。预测数据的标准偏差比的平均值为4.82％，小于5％，表明实验具有较高的准确性和可重复性。

[0097] 表4Box‑Behnken设计的结果

[0098]

[0099]

[0100] 表5Box‑Behnken设计的方差分析

[0101]

[0102]

[0103] Note：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05

[0104] 表6Box‑Behnken设计回归方程的可信性分析

[0105]

[0106] 根据回归方程，利用Design Export软件绘制因素CS:TPP质量(X1)，黄芩苷壳聚糖溶液的pH(X2)和TPP加入速度(X3)对包封率的响应面和等高线图(图12)。响应面图以响应值Y(包封率)作为Z轴，在影响因素X1,X2,X3中取两个因素分别作为X轴和Y轴，分析两个影响因素对响应值的交互作用。图12(a)和(d)可知，在一定范围内，包封率会因为CS:TPP质量比和黄芩苷壳聚糖溶液的pH的增加而增加，达到最大值后开始伴有走低现象。X1，X2因素之间的交互作用不显著(P>0.05)，CS:TPP质量比(X1)为3:1，黄芩苷壳聚糖溶液的pH(X2)为3.5时，响应值达到最大。同理，对X1、X3和X2、X3的交互作用进行分析(图12)，可知在一定范围内，响应值随着影响因素的增加而增加，达到最高峰后开始下降。X1、X3之间的交互作用显著(P<0.01)，X2、X3之间的交互作用不显著(P>0.05)。X1、X3(3:1,1mL/mim)，X2、X3(3.5,1mL/min)时，响应值最大。通过响应面曲线图的曲线幅度，可以判断出X1X2、X1X3和X2X3三种组合因素中各因素的影响，表示为X1>X2，X1>X3，X2>X3，据此推算出三个因素的影响大小分别为X1>X2>X3，与表5中的数据显示一致。

[0107] 因此，通过Box‑Behnken设计得到的回归方程，本实施例得到以下最优的制备方案：CS:TPP质量比3.496:1，黄芩苷壳聚糖溶液的pH为3.422，TPP注射速度0.985mL/min。根据最优的制备方案，平行三组制备黄芩苷壳聚糖纳米粒，得到的BC‑NPs的包封率为46.20±1.47％，接近预测值46.41％，证明了Box‑Behnken设计结果的可靠性，表明优化后的制备方案可以用于制备包封率高的黄芩苷壳聚糖纳米粒。

[0108] 实施例2

[0109] 本实施例提供一种黄芩苷壳聚糖纳米粒的制备方法，具体步骤如下：

[0110] S1、将2.5mL黄芩苷溶液以1mL/min的速度加入12.5mL壳聚糖溶液中，磁力搅拌10分钟后，用1mol/L NaOH调节pH值到5，得到混合溶液。

[0111] S2、在步骤S1中得到的混合溶液中以1mL/min的速度加入5mL磷酸三苯酯(TPP)溶液，加入后继续搅拌20min，得到混悬液。

[0112] S3、步骤S2中得到的混悬液在15000r/min，4℃条件下离心30min，去除上清液，重新加入适当超纯水混匀沉淀，再次离心；重复离心操作三次后，将沉淀放入冷冻干燥机中，冻干48h，得到黄芩苷壳聚糖纳米粒(BC‑NPs)。

[0113] 对比例1

[0114] 本对比例提供一种空白壳聚糖纳米粒的制备方法，具体步骤如下：

[0115] S1、将2.5mL PEG400溶液以1mL/min的速度加到12.5mL的壳聚糖溶液中，磁力搅拌10分钟后，用1mol NaOH调节pH值到5，得到混合溶液。

[0116] S2、在步骤S1中得到的混合溶液中以1mL/min的速度加入5mL磷酸三苯酯(TPP)溶液，加入后继续搅拌20min，得到壳聚糖纳米粒混悬液。

[0117] S3、步骤S2中得到的壳聚糖纳米粒混悬液在15000r/min，4℃条件下离心30min，去除上清液，重新加入适当超纯水混匀沉淀，再次离心；重复离心操作三次后，将沉淀放入冷冻干燥机中，冻干48h，得到空白壳聚糖纳米粒(B‑NPs)。

[0118] 性能测试例1确定黄芩苷的最大吸收波长

[0119] 取一定量的黄芩苷，用0.1mol/L HCL使其完全溶解，制成黄芩苷溶液。测定黄芩苷溶液在200～400nm波长的吸光度如图1所示，测得黄芩苷在200～400nm处的最大吸收波长为278nm，且在278nm处空白壳聚糖纳米粒的吸光度很小，几乎可以忽略不计。因此，选择278nm作为后续测定黄芩苷含量的波长。

[0120] 在278nm处分别测量浓度为3、5、6、7、9μg/mL的黄芩苷溶液的吸光度，以浓度为横坐标(X)，每个浓度对应的吸光度为纵坐标(Y)，根据数值绘图，通过线性拟合，得到黄芩苷的标准曲线(图2)，拟合的标准曲线方程为Y＝0.0748X‑0.006,R2＝0.9993。表明黄芩苷溶液在3～9μg/mL浓度下有良好的线性关系，可利用该拟合曲线计算黄芩苷的浓度。

[0121] 性能测试例2测定黄芩苷壳聚糖纳米粒的相关属性

[0122] (1)取实施例2制备得到的黄芩苷壳聚糖纳米粒混悬液200μL于10mL容量瓶中，用0.1mol/L HCL定容至刻度，混匀，用紫外分光光度计测定吸光度。代入性能测试例1计算得到的黄芩苷吸光度的标准曲线，得到总药量M总。

[0123] (2)再将实施例2制备得到的黄芩苷壳聚糖纳米粒混悬液在15000r/min离心30min，取上清液200μL于10mL容量瓶中，用0.1mol/L HCL定容至刻度，混匀，测定吸光度。代入标曲，得到游离药物的质量M。

[0124] (3)取实施例2制备得到的黄芩苷壳聚糖纳米粒和对比例1制备得到的空白壳聚糖纳米粒的冻干粉末，将它们重新分散在超纯水中，稀释一定的倍数后滴在硅片上。晾干后用导电胶将带有纳米粒的硅片粘到铜台上，喷金120s，通过场发射扫描电子显微镜观察表面形态。

[0125] (4)取过量的黄芩苷分别加入pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液、0.5％(v/v)吐温80+pH7.4的磷酸盐缓冲溶液和1mol/L水杨酸钠磷酸盐缓冲溶液，制成过饱和溶液；将上述三种溶液放入恒温培养振荡器中，在50r/min，34±0.5℃条件下，孵育24h，得到溶解平衡的黄芩苷溶液。分别取1mL上述溶液用0.45μm滤头过滤，稀释。

[0126] 通过纳米电位粒径分析仪测得空白壳聚糖纳米粒的平均粒径为166.1±1.51nm，PDI为0.109±0.004，Zeta电位为23.5±0.60。BC‑NPs的平均粒径为174.0±1.67nm，PDI为0.136±0.01，Zeta电位为24.7±0.30(图13)。载药量为17.8±0.13％，包封率为46.2±
0.50％。随着黄芩苷的载入，纳米粒的粒径略微增加，这符合载药纳米粒的规则，有利于维持纳米粒的稳定。

[0127] 通过对红外光谱图特征峰所对应的官能团进行分析，来证明黄芩苷是否成功负载‑1到壳聚糖纳米粒中。如图14所示，壳聚糖在3350cm 处的特征峰对应为‑OH的伸缩振动，在‑1 ‑1
1030cm 处的特征峰对应为‑C‑O‑C‑的伸缩振动。空白壳聚糖纳米粒可在3320cm 和1060cm‑1 ‑1
处观察到相应的特征峰。在空白壳聚糖纳米粒的光谱中，3320cm 处的峰明显变宽，这表‑1 ‑1
明氢键作用的增强。在壳聚糖的光谱中还观察到1650cm 和1590cm 处的峰，对应的是‑NH2‑1 ‑1
的弯曲振动，在空白纳米粒中，‑NH2的峰移至1630cm 和1530cm 。这些特征峰的变宽和转移是因为在壳聚糖纳米粒的合成过程中，壳聚糖的氨基与TPP的磷酸根通过静电相互作用交联，产生氢键。

[0128] 黄芩苷在3390cm‑1和3260cm‑1处的特征峰对应为酚羟基的伸缩振动，在1720cm‑1处‑1 ‑1的峰对应为‑C＝O的伸缩振动。BC‑NPs在3390cm 和3250cm 处存在相应的酚羟基的特征‑1
峰，‑C＝O的峰则移至1730cm 。这些特征峰可证明黄芩苷被成功负载到壳聚糖纳米粒中。

[0129] 黄芩苷在不同介质中的平衡溶解度见表7。虽然黄芩苷在0.5％(v/v)吐温80 +磷酸盐缓冲液(pH 7.4)的平衡溶解度最大，但是该溶解介质在278nm处存在紫外吸收，对黄芩苷的含量测定有干扰(图15a)。故选用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)作为黄芩苷溶液和BC‑NPs的体外释放介质。

[0130] 表7黄芩苷在不同介质中的平衡溶解度

[0131]

[0132] 纳米给药系统的药物释放包括三个阶段：第一阶段是初始爆发阶段，存在于纳米载体表面的药物迅速释放出来。第二阶段是聚合物膨胀阶段，由于纳米载体内部和外部渗透压的不同，释放介质向纳米载体内部扩散，从而引发聚合物的膨胀，药物被扩散出来。第三阶段是聚合物的降解阶段，随着时间的推移，组成纳米载体的聚合物被慢慢降解，药物完全释放出来。

[0133] 本实验采用透析法研究了黄芩苷溶液和黄芩苷壳聚糖纳米粒的体外释放情况。结合体外释放曲线(图16a)分析可知，黄芩苷溶液存在突释现象，4h释放率达到80.45％，12h释放率为93.83％。12h后释放趋于稳定。相较于黄芩苷溶液，黄芩苷壳聚糖纳米粒在是释放的初始阶段也存在一定的突释现象，在最初的1h内，黄芩苷的累积释放率为15.50％，这是[115]由于吸附在纳米颗粒表面的药物释放所致 。结合纳米给药系统的药物释放规律，在释放的第二、三阶段，PBS渗入BC‑NPs，导致聚合物膨胀和降解，BC从NPs中释放出来，这一过程持续了约48h，累积释放率为76.97％。48h后，BC‑NPs的释放曲线趋于平稳，药物体系内外的黄芩苷浓度相同。

[0134] 将BC‑NPs的体外释放数据与零级、一级和Higuchi动力学方程等不同模型进行拟合，以预测其动力学和药物释放机制(图16)。发现黄芩苷壳聚糖纳米粒中的黄芩苷的释放2
曲线遵循一级动力学(R ＝0.987)。这些结果表明，BC‑NPs对药物的持续释放有影响，这是因为包载在纳米颗粒中的黄芩苷可以缓慢而持续地释放。

[0135] 综上，对优化的处方和制备工艺下制得的BC‑NPs进行表征，结果如图3所示，BC‑NPs具有良好的纳米颗粒特性，呈分布均匀，大小均一的球形。BC‑NPs的平均粒径为174.0±1.67nm，PDI为0.136±0.013，Zeta电位为24.7±0.30，载药量为17.8±0.13％，包封率为
46.2±0.50％。红外光谱证明了黄芩苷被成功载入壳聚糖纳米粒中。体外释放结果表明，BC从NPs中释放出来，这一过程持续了约48h，累积释放率为76.97％，证明了将黄芩苷载入壳聚糖纳米粒中能起到缓释作用。

[0136] 性能测试例3

[0137] 本测试例提供一种人角膜上皮细胞的培养方法，具体步骤如下：

[0138] 1)将人角膜上皮细胞(HCECs)从干冰中取出，迅速放入37℃水浴锅中轻轻晃动，使冻存的细胞悬液尽快融化。

[0139] 2)将冻存管从水浴锅移到超净工作台后，打开冻存管，将管内的细胞悬液吸出至15mL离心管中，再加入5mL完全培养基混匀。

[0140] 3)将装有细胞悬液的离心管放入离心机中，1000r/min，离心10min。

[0141] 4)离心后，弃去上清液，加入1mL完全培养基使细胞重悬后，将重悬液移至T25培养瓶中，再加入6mL完全培养基，通过画“8”字将细胞混匀在完全培养基中，放入37℃，5％ CO2培养箱中静置培养。

[0142] 5)当细胞生长密度达到培养瓶底部约80～90％时，用胰酶消化，传代。

[0143] 6)细胞传代：取出细胞密度为80～90％的培养瓶，将旧的完全培养基吸出后，加入2mL PBS缓冲液清洗细胞两次，移去PBS，加入不含EDTA的胰酶2mL，放入培养箱中消化5min后，加4mL完全培养基终止消化。

[0144] 7)再反复吹打，将细胞完全冲洗下来。将培养瓶中的细胞悬液移至15mL离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清液，加入2mL完全培养基重新混悬。将混悬液各取1mL加到两个不同的T25培养瓶中，每个培养瓶再加6mL新鲜完全培养基，画“8”字混匀。放入37℃，5％ CO2培养箱中继续培养。

[0145] 考察黄芩苷壳聚糖纳米粒对人角膜上皮细胞的细胞毒性，细胞毒性结果如图4所示，含黄芩苷浓度为12.5～400μg/mL的BC‑NPs对HCECs没有细胞毒性。BC‑NPs对HCECs有潜在的积极作用，值得进一步研究和开发。

[0146] 本实验使用响应面法优化壳聚糖纳米粒的制备过程，通过设计实验方法系统地研究了各种制备参数对纳米粒子性能的影响。优化后的纳米粒子具有更高的药物包封率和更可控的释放特性，提高了药物在治疗中的有效性和安全性。

[0147] 对比以往工作，经本方案优化后的壳聚糖纳米粒子展示出显著更高的包封率和载药量，相比传统方法，包封率得到提高。此外优化后的纳米粒子在体外释放实验中显示出更长时间的持续释放，相比传统纳米粒子，药物释放持续时间增强了延长时间。

[0148] 实施例3

[0149] 如图11所示，本实施例提供一种搭载黄芩苷壳聚糖纳米粒的角膜接触镜的制备方法，具体步骤如下：

[0150] S1、将2.5mL黄芩苷溶液以1mL/min的速度加到12.5mL的壳聚糖溶液中，磁力搅拌10分钟后，用1mol/L NaOH调节pH值到3.4，得到混合溶液。

[0151] S2、在步骤S1中得到的混合溶液中以1mL/min的速度加入5mL TPP溶液，加入后继续搅拌20min，得到混悬液。

[0152] S3、步骤S2中得到的混悬液在15000r/min，4℃条件下离心30min，去除上清液，重新加入适当超纯水混匀沉淀，再次离心；重复离心操作三次后，得到黄芩苷壳聚糖纳米粒混悬液。

[0153] S4、将12g HEMA和7.3g低浓度BC‑NPs混悬液(C1，含1mg/mL BC)混合作为单体溶液。

[0154] S5、将0.2g NVP(1‑乙烯基‑2‑吡咯烷酮)与4g MAA(甲基丙烯酸)溶解在单体溶液中，在室温下磁力搅拌60min，转速为200r/min，得到混合物。

[0155] S6、将0.1g EGDMA(交联剂)和0.1g AIBN(引发剂)添加到上述混合物中，再次搅拌60min，转速为200r/min。

[0156] S7、将所得溶液注入角膜接触镜模具，放入50℃烘箱中加热12h，再70℃热聚合24h。

[0157] S8、取出模具，放凉后脱模，得到搭载黄芩苷壳聚糖纳米粒的角膜接触镜(BNC1)。

[0158] 实施例4

[0159] 本实施例提供一种搭载黄芩苷壳聚糖纳米粒的角膜接触镜的制备方法，具体步骤如下：

[0160] S1、将2.5mL黄芩苷溶液以1mL/min的速度加到12.5mL的壳聚糖溶液中，磁力搅拌10分钟后，用1mol/L NaOH调节pH值到3.4，得到混合溶液。

[0161] S2、在步骤S1中得到的混合溶液中以1mL/min的速度加入5mL TPP溶液，加入后继续搅拌20min，得到混悬液。

[0162] S3、步骤S2中得到的混悬液在15000r/min，4℃条件下离心30min，去除上清液，重新加入适当超纯水混匀沉淀，再次离心；重复离心操作三次后，得到黄芩苷壳聚糖纳米粒混悬液。

[0163] S4、将12g HEMA和7.3g中浓度BC‑NPs混悬液(C2，含2mg/mL BC)混合作为单体溶液。

[0164] S5、将0.2g NVP(1‑乙烯基‑2‑吡咯烷酮)与4g MAA(甲基丙烯酸)溶解在单体溶液中，在室温下磁力搅拌60min，转速为200r/min，得到混合物。

[0165] S6、将0.1g EGDMA(交联剂)和0.1g AIBN(引发剂)添加到上述混合物中，再次搅拌60min，转速为200r/min。

[0166] S7、将所得溶液注入角膜接触镜模具，放入50℃烘箱中加热12h，再70℃热聚合24h。

[0167] S8、取出模具，放凉后脱模，得到搭载黄芩苷壳聚糖纳米粒的角膜接触镜(BNC2)。

[0168] 实施例5

[0169] 本实施例提供一种搭载黄芩苷壳聚糖纳米粒的角膜接触镜的制备方法，具体步骤如下：

[0170] S1、将2.5mL黄芩苷溶液以1mL/min的速度加到12.5mL的壳聚糖溶液中，磁力搅拌10分钟后，用1mol/L NaOH调节pH值到3.4，得到混合溶液。

[0171] S2、在步骤S1中得到的混合溶液中以1mL/min的速度加入5mL TPP溶液，加入后继续搅拌20min，得到混悬液。

[0172] S3、步骤S2中得到的混悬液在15000r/min，4℃条件下离心30min，去除上清液，重新加入适当超纯水混匀沉淀，再次离心；重复离心操作三次后，得到黄芩苷壳聚糖纳米粒混悬液。

[0173] S4、将12g HEMA和7.3g高浓度BC‑NPs混悬液(C3，含4mg/mL BC)混合作为单体溶液。

[0174] S5、将0.2g NVP(1‑乙烯基‑2‑吡咯烷酮)与4g MAA(甲基丙烯酸)溶解在单体溶液中，在室温下磁力搅拌60min，转速为200r/min，得到混合物。

[0175] S6、将0.1g EGDMA(交联剂)和0.1g AIBN(引发剂)添加到上述混合物中，再次搅拌60min，转速为200r/min。

[0176] S7、将所得溶液注入角膜接触镜模具，放入50℃烘箱中加热12h，再70℃热聚合24h。

[0177] S8、取出模具，放凉后脱模，得到搭载黄芩苷壳聚糖纳米粒的角膜接触镜(BNC3)。

[0178] 对比例2

[0179] 本对比例提供一种空白角膜接触镜(CL)的制备方法，具体步骤如下：

[0180] S1、将12g HEMA(甲基丙烯酸羟乙酯)和7.3g水混合得到单体溶液；

[0181] S2、将0.2g NVP(1‑乙烯基‑2‑吡咯烷酮)与4g MAA(甲基丙烯酸)溶解在单体溶液中，在室温下磁力搅拌60min，转速为200r/min，得到混合物。

[0182] S3、将0.1g EGDMA(交联剂)和0.1g AIBN(引发剂)添加到上述混合物中，再次搅拌60min，转速为200r/min。

[0183] S4、将所得溶液注入角膜接触镜模具，放入50℃烘箱中加热12h，再70℃热聚合24h。

[0184] S5、取出模具，放凉后脱模，得到空白角膜接触镜(CL)。

[0185] 性能测试例4搭载黄芩苷壳聚糖纳米粒的角膜接触镜的相关属性

[0186] (1)将对比例2制得的空白角膜接触镜(CL)和实施例3～5制得的三种不同浓度的BNC切割成大小约为1cm×1cm的正方形，冷冻干燥72h，得到CL、BNC1、BNC2和BNC3的样品。

[0187] 将干燥好的CL、BNC1、BNC2和BNC3的样品用导电胶粘贴到铜台上，喷金60s，通过SEM观察载药角膜接触镜表面及侧面的形态和结构。

[0188] (2)亲水性测定

[0189] 本测试例通过镜片表面水接触角的测定，来研究角膜接触镜的亲水性，具体步骤如下：

[0190] 1)用接触角测量仪测定CL、BNC1、BNC2和BNC3在室温下的静态水接触角。

[0191] 2)将CL、BNC1、BNC2和BNC3的样品冲洗干净并擦干表面水分，使其表面保持相对干燥。将干燥的CL、BNC1、BNC2和BNC3的样品粘贴在载玻片上，保证样品平整地贴附在载玻片表面。

[0192] 3)向其表面滴加10μL纯水，立即读取接触角的数值。每个样品分别测定三个不同位置的水接触角，结果取平均值；

[0193] (4)透光率测定

[0194] 将CL、BNC1、BNC2和BNC3的样品表面用纯水洗净，再用无尘纸擦干表面水分，分别放入比色皿中，在紫外分光光度计下测定400～800nm波长下角膜接触镜的透光率；

[0195] (5)释放实验：

[0196] 将CL、BNC1、BNC2和BNC3的样品分别放入2mL PBS(0.1M，pH 7.4)中，分别在1、2、6、8、12、24、48、72和96h后取出1mL，并补充1mL释放介质。

[0197] 通过SEM图(图6)可以明显看出，BC‑NPs被成功负载在角膜接触镜上，且载药量越大，角膜接触镜表面的纳米粒就越多。侧面图可以看出，随着纳米粒的增加，载药角膜接触镜表面的孔隙越少，表明纳米粒通过静电相互作用很好地结合到了角膜接触镜中。

[0198] 本测试例对三种BNC的体外释放进行考察(图7)，12h后BNC1、BNC2和BNC3分别释放了9.34μg(51.17％)、16.11μg(44.13％)和30.02μg(41.12％)。由释放曲线可以看出(图7a)，BNC在前2h释放较快，这是因为一些在CL表面的纳米粒子的药物释放。2～12h可以观察到持续的BC释放，释放过程有利于维持角膜内的药物浓度。但12h后，BNC释放开始变慢，是因为在角膜接触镜中的BC‑NPs释放BC后，BC会先到达角膜接触镜的基质，再从基质中释放出来，这一过程延缓了药物的释放。

[0199] 如图6～7所示，通过静电相互作用成功将黄芩苷壳聚糖纳米粒载入角膜接触镜中，实施例3～5制备了载低、中、高三种浓度的黄芩苷壳聚糖纳米粒的角膜接触镜BNC1、BNC2和BNC3，合成后的载药角膜接触镜与未载药的空白角膜接触镜均有较低的水接触角(53.6°～54.3°)和较高的含水量(>40％)。表明角膜接触镜有较高的润湿性、亲水性和透氧率，这将带给佩戴者更舒适的佩戴体验。载药角膜接触镜的体外释放结果表明，载药角膜接触镜能在12h内持续释放药物，BNC1、BNC2和BNC3分别释放了9.34μg(51.17％)、16.11μg(44.13％)和30.02μg(41.12％)，这一过程有利于延长药物在眼表的停留时间，能为眼部持续提供药物，提高了生物利用度。体外细胞毒性结果表明，本章所制备的载药角膜接触镜不会影响角膜上皮细胞的存活率，能保证在药物释放的同时，角膜上皮细胞不受到角膜接触镜的影响。

[0200] 本研究中制备的角膜接触镜不仅具有良好的光学和机械性能，还具备抗菌、抗炎和抗氧化等多种生物活性。实验数据表明，对比以往研究工作，新的角膜接触镜在透光率和机械性能上显著优于传统接触镜，透光率、机械强度均得到提高，此外，在体外细胞实验中，新制备的接触镜展示出更低的细胞毒性和更好的细胞附着性，相比传统材料，生物相容性也得到相应提高。

[0201] 性能测试例5

[0202] (1)本测试例提供一种搭载黄芩苷壳聚糖纳米粒的角膜接触镜抗菌活性测试的方法，分别考察CL、BNC1、BNC2和BNC3的样品对人角膜上皮细胞的细胞毒性，具体步骤如下：

[0203] S1、细菌培养

[0204] S1‑1、分别取10μL大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的冻存液加到3mL LB液体培养基中混匀，取10μL混匀后的菌液于含有LB固体培养基的培养皿上，用接种环划线后在37℃生化培养箱中培养，直至培养皿中长出单菌落。

[0205] S1‑2、在摇菌管中加入3mL LB液体培养基，挑取单菌落摇菌管中，在转速为200r/min，温度为37℃的摇床中培养24h。

[0206] S1‑3、取出摇菌管，用无菌PBS将菌液稀释至不同倍数，通过紫外分光光度计在600nm下测定每个浓度的菌液的吸光度值。并取每个浓度的菌液100μL于含固体培养基的培养皿中，用涂布棒涂匀菌液，在37℃恒温孵育12h，计算菌落个数、

[0207] S2、体外抗菌活性

[0208] S2‑1、分别挑取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的单菌落于3mL LB培养基中，在200r/min，37℃摇床中培养24h。

[0209] S2‑2、取出菌液，用无菌的PBS将菌液稀释至浓度约为105CFU/mL。

[0210] S2‑3、将在紫外照射下充分灭菌的CL和不同的BNC放入摇菌管中，每管分别加入1mL稀释后的菌液，对照组为不加任何样品的1mL菌液。在转速为200r/min，温度为37℃的摇床中培养12h。

[0211] S2‑4、取出摇菌管，将所有菌液都稀释一定倍数后，每管取100μL菌液，加到含有LB固体培养基的培养皿上，用涂布棒将菌液涂抹均匀。然后，将培养皿放入37℃恒温孵育12h。

[0212] S2‑5、取出培养皿，观察菌落生长情况，拍照记录并计算培养皿上的菌落数。

[0213] (2)本测试例提供一种搭载黄芩苷壳聚糖纳米粒的角膜接触镜阻菌性测试的方法，具体步骤如下：

[0214] 将CL和不同的BNC在紫外下正反面各灭菌30min后，放置于固体培养基上，取浓度5
为10CFU/mL的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌液100μL滴在CL和三种不同浓度的BNC上，放入37℃恒温孵育12h。取出培养基，移除CL和BNC，再将培养基放入37℃恒温孵育12h，观察是否有菌落长出。

[0215] (3)本测试例提供一种搭载黄芩苷壳聚糖纳米粒的角膜接触镜抗炎活性测试的方法，具体步骤如下：

[0216] 用LPS诱导RAW 264.7细胞建立细胞炎症模型，来测试BNC的抗炎活性。

[0217] 通过倒置显微镜观察细胞形态(图8)，未经LPS处理的对照组细胞，细胞形态呈现球形。1μg/mL LPS刺激RAW 264.7细胞后，观察到RAW 264.7细胞呈现向四周扩散的太阳花式触角，符合M1型极化的特征。M1型极化能产生高水平的促炎因子，如IL‑6，IL‑1β，TNF‑α等，表明LPS刺激RAW 264.7细胞成功构建炎症模型。

[0218] 通过清除1,1‑二苯基‑2‑苦肼基(DPPH)自由基的效率来检测BNC的抗氧化能力。CL、BNC1、BNC2和BNC3对DPPH自由基的清除率分别为12.93％、41.33％、63.78％和93.65％。
表明BC‑NPs的加入增强了角膜接触镜清除DPPH自由基的能力，且加入的BC‑NPs越多，清除自由基的能力越强(图9h)。

[0219] 细胞水平氧化应激的保护作用如图9(a‑f)所示，与100μM H2O2共同孵育1h后，H2O2组观察到强烈的绿色荧光(DCF)，表明细胞内产生了大量的ROS。然而，与H2O2组比，BNC1组细胞内的DCF荧光强度明显降低(P<0.001)，并且随着BNC中载药纳米颗粒的增加，DCF荧光强度减弱(BNC3对DCF的清除率为81.21％)。这些结果表明BNC可以去除细胞中产生的ROS并发挥抗氧化保护作用。

[0220] 如图8～9所示，本测试例考察了三种不同浓度的载药角膜接触镜的抗菌、抗炎和抗氧化活性。三种浓度的BNC均具有良好的抗菌性能，且随着BNC中BC‑NPs含量的增加，BNC的抗菌能力越强。BNC3处理后的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的存活率分别为18.39％、10.44％和29.56％(与对照组相比)，BNC对三种细菌均起到一定的阻隔性，防止细菌通过空气接触伤口表面。表明BNC对眼部疾病中常见的细菌能起到抗菌作用。

[0221] 上述数据体现了本研究系统评估了载药壳聚糖纳米粒角膜接触镜的抗菌、抗炎和抗氧化性能，全面展现了其多功能生物活性。通过一系列体外实验和动物模型实验，提供了强有力的证据，证明了该角膜接触镜在治疗眼部感染和炎症中的潜在应用价值。实验结果显示，新型角膜接触镜在抗菌实验中表现出更强的抗菌活性，相比传统接触镜，抗菌效果增强。此外，在动物模型实验中，新制备的角膜接触镜在减少炎症反应和氧化应激方面表现出显著优势，相比传统接触镜，抗炎效果和抗氧化能力都得到了一定提高。

[0222] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。