[0001] 本发明属于食品保鲜领域，具体涉及一种明胶基冷冻凝胶及其制备方法及应用。

[0002] 伴随着人们对食品质量要求的提升，食品保鲜方面的标准也开始越来越高。除了食品包装材料可以进行保鲜以外，人们往往会使用冰块对食品进行保鲜，抑制微生物的生长[1]。尽管，冰块能够有效的降低周围环境的温度，达到食品保鲜的功效，但冰块的使用还是存在很大的弊端：冰块的不可重复利用性对水资源造成了很大的浪费；冰的融水性易导致食品交叉污染；冰块融化后对其保鲜的食物不再具有支撑性，使得食品很容易与外界直接接触，再次造成污染。虽然利用抗菌冰块和酸性电解水冰来代替传统冰块是一个有效的方法[2]，但是其厚塑料外壳会降低冷却效率并带来环境负担。因此，开发一种新型坚固、可重复使用、抗微生物以及无塑料污染的食品冷却介质至关重要。此时，基于冷冻凝胶而制备成的冰块展现出它巨大的应用潜力。

[0003] 近年来，已有部分研究者尝试采用功能性冰块直接应用于保鲜食品。例如：陈飞东等[3]采用含焦亚硫酸钠的冰块，在4(±1)℃下冰藏南美白对虾，实验组的保鲜效果明显优于对照组。Laura等[4]将纳米封装精油嵌入冰中，提高了储存在该冰上的新鲜整条鲷鱼的质量和保质期。Zou等[5]基于明胶水凝胶开发了新型食品冷却剂“果冻冰块”(JICs)，在继承传统冰的高冷却效率的同时减少融水。

[0004] 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是存在于绿茶叶中的多酚单体，因其丰富的酚羟基而具有较强的抗氧化、抑菌等功能特性和理化活性[6‑8]。EGCG还可用于改善蛋白质的功能特性。例如，EGCG可用于改善大豆蛋白[9]、乳清蛋白[10]和牛骨蛋白[11]的乳化特性，重塑大豆蛋白纤维的结构[12]，提高乳清蛋白的发泡特性[13]，改善肌纤维蛋白的胶凝特性[14]。最近，研究人员发现利用超声波产生的自由基可以诱导蛋白质与多酚共价交联。例如，超声波产生的自由基已被成功用于制备大豆蛋白‑青花素‑3‑半乳糖苷共价复合物[15]、酪蛋白‑青花素‑3‑半乳糖苷共价复合物[16]、火麻仁蛋白‑多酚共价复合物[17]、乳清蛋白‑姜黄素共价复合物[18]和麦谷蛋白‑多酚共价复合物[19]。这种方法的优点如下：反应过程中只需使用超声波，无需交联剂；反应条件温和，时间短；同时超声波处理还能起到改善蛋白质功能特性的作用。

[0005] 冰上保存是一种广泛用于保鲜虾的方法，因为它具有冷却效率、温度控制、保湿性、安全性、易用性、可用性和成本效益[20]。

[0006] 参考文献：

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[0056] 下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

[0057] 以下实施例中：明胶购于福建省福宁浦明胶有限公司；EGCG购于江苏艾康生物医药研发有限公司；2，2‑二苯基‑1‑三硝基肼(DPPH)购于合肥博美生物科技有限责任公司；LB固体培养基购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

[0058] 实施例1明胶凝胶的制备

[0059] (1)将明胶和EGCG在磷酸钠缓冲液中(0.01M,pH＝7.4)充分混合得到混合液，混合液中，明胶的质量体积浓度为10％g/mL，EGCG与明胶的混合质量比为3％g/g，将混合液pH值用NaOH水溶液调节至9.0，然后超声处理15分钟，超声功率为400W，超声结束后，得到样品溶液。

[0060] (2)用HCl水溶液将步骤(1)得到的样品溶液的pH值调节至7.4，置于90℃恒温水浴30min后，倒入模具(2cm×2cm×2cm)中，冷却至室温后放入4℃冰箱过夜，实现溶液‑凝胶转化，标为共价混合物G‑EGCG‑U凝胶。

[0061] (3)将步骤(2)得到的G‑EGCG‑U凝胶在‑20℃下冷冻18h，即得G‑EGCG‑U冷冻凝胶。

[0062] 将步骤(2)得到的G‑EGCG‑U凝胶进行0‑5次冻融循环(FTC 0‑5)：在‑20℃下冷冻18h，室温下解冻6h，此为1次冻融循环。

[0063] 此外，设置三组对照：(a)明胶凝胶G，(b)超声处理后的明胶凝胶G‑U，以及(c)加入EGCG的明胶凝胶共混物G/EGCG。具体如下：

[0064] (a)所述明胶凝胶G的制备方法为：将明胶在磷酸钠缓冲液(0.01M，pH7.4)中充分混合，明胶的质量体积浓度为10％g/mL，得到样品溶液；将样品溶液置于90℃恒温水浴30min后，倒入模具(2cm×2cm×2cm)中，冷却至室温后放入4℃冰箱过夜，实现溶液‑凝胶转化，标为明胶凝胶G；将明胶凝胶G按照上述冻融方法进行0‑5次冻融循环(FTC 0‑5)。

[0065] (b)所述超声处理后的明胶凝胶G‑U的制备方法为：将明胶在磷酸钠缓冲液(0.01M，pH 7.4)中充分混合，明胶的质量体积浓度为10％g/mL。将溶液pH调节至9.0，然后超声处理15min，超声功率为400W，超声结束后，将溶液的pH调节至7.4，得到样品溶液；将样品溶液置于90℃恒温水浴30min后，倒入模具(2cm×2cm×2cm)中，冷却至室温后放入4℃冰箱过夜，实现溶液‑凝胶转化，标为明胶凝胶G‑U；将明胶凝胶G‑U按照上述冻融方法进行0‑5次冻融循环(FTC 0‑5)。

[0066] (c)所述加入EGCG的明胶凝胶共混物G/EGCG的制备方法为：将明胶和EGCG在磷酸钠缓冲液(0.01M,pH 7.4)中充分混合，得到样品溶液，其中，明胶的质量体积浓度为10％g/mL，EGCG与明胶的质量比为3％g/g；将样品溶液置于90℃恒温水浴30min后，倒入模具(2cm×2cm×2cm)中，冷却至室温后放入4℃冰箱过夜，实现溶液‑凝胶转化，标为明胶凝胶共混物G/EGCG；将明胶凝胶共混物G/EGCG按照上述冻融方法进行0‑5次冻融循环(FTC 0‑5)。

[0067] 实施例2不同冻融循环条件下EGCG共价交联对明胶凝胶强度的影响

[0068] 用TMS‑PRO食品质构仪测定实施例1中制备得到的凝胶的强度。选用直径φ＝12.7mm(r＝6.35mm)的圆柱状平头冲头，测试速度为1mm/s，测试过程中最大应力即为破裂强度(N)。

[0069] 从图1可以看出，G、G‑U、G/EGCG和G‑EGCG‑U凝胶强度随着冻融次数的增加显著下降(P＜0.05)，其中，G/EGCG和G‑EGCG‑U凝胶强度值在FTC3和FTC5后没有显著差别。且G/EGCG和G‑EGCG‑U组样品的凝胶强度显著高于G和G‑U组，说明EGCG与明胶的共混物和共价复合物可显著提高明胶的凝胶强度，且共价复合物凝胶强度显著高于共混物。此外，G/EGCG冻融循环5次后凝胶强度下降了39.8％，G‑EGCG‑U冻融循环5次后凝胶强度下降了36.7％，远低于G、G‑U和G/EGCG样品。由此可知，EGCG共价交联可以更有效的抑制凝胶强度的下降，进而有效减缓了蛋白氧化和变性。这一现象的原因，很可能是EGCG与蛋白质分子结合后，导致明胶蛋白凝胶网络结构中的自由水被束缚，进而有效防止了蛋白质在冷冻过程中的变性。研究结果表明EGCG可以提高明胶蛋白的凝胶性。

[0070] 实施例3不同冻融循环条件下EGCG共价交联对明胶凝胶持水力的影响

[0071] 称取1g实施例1中制备得到的凝胶样品，在4℃、4000r/min的条件下离心15分钟，倒置并沥干后用滤纸去除剩余水分后取出样品并称质量。通过比较离心前后凝胶的失水量，分析凝胶的持水能力。用下列公式计算明胶持水力WHC：

[0072]

[0073] 式中：m1和m2分别代表离心前后凝胶的质量(g)。

[0074] 如图2所示，未冻融时(FTC0)，G‑EGCG‑U的持水力比G、G‑U和G/EGCG分别显著提高了5.24％，6.58％和2.41％(P＜0.05)，表明共价复合物样品有利于凝胶持水力的提升。冻融对G‑EGCG‑U样品的WHC无显著影响，而其他3组冻融对其均具有显著性影响(P＜0.05)。同一FTC下，G‑EGCG‑U凝胶的持水力均高于G/EGCG，G‑U和G凝胶，且FTC5次后，G‑EGCG‑U凝胶的持水力仅下降了3.22％，显著低于其他组样品(P＜0.05)。表明在反复冻融过程中，EGCG共价修饰明胶对其凝胶内部三维网络结构有保护作用，可以降低冰晶对凝胶结构产生的物理破坏。共价修饰的明胶在增强持水力方面展现出显著优势。一方面，它能够通过氢键作用紧密结合自由水，从而固定凝胶中的水分；另一方面，修饰后的明胶还有效减少了水分子在凝胶网络结构中的位移，进而提升其持水力。因此，EGCG共价修饰可以显著改善明胶凝胶的持水力和冻融稳定性。

[0075] 实施例4不同冻融循环条件下EGCG共价交联对明胶凝胶DPPH自由基清除活性的影响

[0076] 将实施例1制备得到的凝胶样品(FTC0、FTC1、FTC3、FTC5)冻干形成样品粉末。将1mg样品粉末与3mL DPPH/乙醇溶液(0.2mM)以及3mL去离子水混合均匀，于黑暗中静置
30min，然后以8000g的转速离心10分钟，取上清液在517nm处测量反应溶液的吸光度，用以下公式计算明胶凝胶的DPPH自由基清除活性：

[0077] DPPH自由基清除活性(％)＝(1‑As/A0)×100％

[0078] 其中As是样品在517nm处的吸光度，A0是对照组(水代替样品)在517nm处的吸光度。

[0079] 如图3所示，明胶具有较低的抗氧化活性，G和G‑U组在FTC过程中抗氧化活性有所波动但不明显。G/EGCG和G‑EGCG‑U组具有较高的抗氧化活性，是因为EGCG具有酚羟基，可以向自由基提供一个氢原子，同时多酚转化为不参与自由基链反应的多酚自由基，因此，添加EGCG的复合物具有较强的抗氧化活性。抗氧化活性相对于G、G‑U增加了14倍以上。此外，同一FTC下，共价复合物的抗氧化能力高于混合物，可能是由于在碱性条件下超声处理使明胶内部结构打开，暴露更多的疏水基团与EGCG结合，EGCG引入了大量的氢离子，与DPPH生成DPPH·H，增强了抗氧化能力。由此可知，碱性条件下共价结合的EGCG数量多于非共价结合，因此共价复合物的抗氧化能力更强。随着FTC增加，G/EGCG和G‑EGCG‑U组的DPPH清除活性均逐渐降低，抗氧化的能力逐渐减弱。

[0080] 实施例5冷冻凝胶对南美白对虾的菌落总数的影响

[0081] 取实施例1中进行了1次和5次冻融循环得到的凝胶FTC1、FTC5在‑20℃下冷冻18h得到的FTC1‑冷冻凝胶和FTC5‑冷冻凝胶用于本次实验。

[0082] 实验方法：设置普通水制成的冰作为对照。超市购买鲜活的南美白对虾，利用塑料袋活氧运输，1h内到达实验室，随后按虾:冰(或虾:冷冻凝胶)质量比例为1:2随机挑选分成5组，每组三个平行。置于4℃冰箱保鲜。南美白对虾共存储3天，每24h更换一次新鲜冷冻凝胶或冰块，在第0和3天取样进行实验检测。参照GB/T4789.2‑2010测定菌落总数，具体为在无菌操作台里称取虾肉25.0g，放入无菌均质袋中均质5min，加入225mL生理盐水，混合均匀后用移液枪吸取3个适宜稀释度的样品匀液1mL，于LB固体培养基平板上涂布，每个稀释液做3个平行，30℃培养箱培养24h后计数。

[0083] 冰储保鲜过程中南美白对虾的菌落总数如图4所示。虾的初始菌落总数为3.1～3.2lg CFU/g。与普通冰组、G组和G‑U组相比，G/EGCG和G‑EGCG‑U保鲜处理组均能在一定程度上抑制南美白对虾菌落总数的增加。保鲜结束后，普通冰组、G组和G‑U组的菌落总数超过了6.0l g CFU/g，超过可接受的极限值。而此时，G/EGCG组和G‑EGCG‑U组的菌落总数仍保持较低水平，菌落总数分别达到4.86和4.75lg CFU/g。实验结果证明，添加EGCG的冷冻凝胶有助于抑制微生物生长繁殖，减少保鲜期的菌落总数。此外，冻融循环对冷冻凝胶抑制微生物生长繁殖效果无显著影响。

[0084] 实施例6不同冻融循环条件下EGCG共价交联对明胶凝胶SEM的影响

[0085] 凝胶SEM实验方法是从实施例1制备得到的凝胶样品(FTC0、FTC1、FTC3、FTC5)中心部位切取3×1×1mm的切片后进行冷冻干燥。将干燥后的样品固定到样品台上，用溅射仪进行喷金处理，以增强其导电性。随后将样品转移至扫描电子显微镜台面上，在加速电压3kV，放大倍数为20000倍的条件下，观察记录凝胶的形态结构。凝胶外观直接拍照观察。

[0086] SEM可以用于评估FTC对明胶凝胶网络结构的影响。在FTC过程中，凝胶中的水从液态水到固体冰的体积侵占了蛋白质‑聚合物链的空间，并在冻融后产生网络结构上的缺陷。即使在溶剂(冰)解冻回液体状态后，具有许多材料缺陷的不均匀空心结构仍保留在冻融后的凝胶中。重复冻融循环会诱导较大冰晶的形成和生长，这不可避免地破坏了凝胶的原始网络结构，并导致松散的微结构。如图5所示，与未冻融的样品比，很明显，经过FTC的样品具有更大且不均匀的孔隙。此外，同一冻融循环次数下，G‑EGCG‑U的微观结构较其他3个样品更均匀，孔径更小。其中G‑U样品的微观结构是最松散和不均匀的，孔径是大的，表明超声打开了蛋白质的微观结构。由此可知，EGCG共价交联明胶可以显著降低冻融对其微观结构的不利影响。通常，致密且均匀的孔分布负责相对稳定的凝胶性能，反之亦然。在本实验中，与孔径较大的G和G‑U相比，具有致密和均匀孔的G/EGCGE和G‑EGCG‑U表现出更高的凝胶强度和WHC，这与本研究结果一致。各组凝胶的外观图片如图6所示。冻融循环前各组样品凝胶均匀、半透明且有光泽；FTC1后颜色介于半透明和不透明之间，且无明显裂纹；FTC3后G和G‑U组凝胶裂纹明显，G/EGCG和G‑EGCG‑U组出现较少裂纹；FTC5后各组裂纹变深。

[0087] 综上所述，采用本发明提供的方法制备明胶冷冻凝胶，操作简单、绿色安全、可以重复利用，作为冷却剂的情况下能够兼容更好的抗氧化和抑菌效果。

[0088] 本发明开发一种新型坚固、可重复使用以及绿色安全的新型EGCG共价修饰明胶冷冻凝胶及其制备方法和应用，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。