[0001] 本发明涉及一种毛菊苣饮片、标准汤剂或配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法、应用、产品，属于中药检测技术领域。

[0002] 毛菊苣为2020年版《中华人民共和国药典》一部药材和饮片菊苣项下收载，为维吾尔族习用药材，来源于菊科植物菊苣属的毛菊苣Cichorium glandulosum Boiss.et Huet的干燥地上部分及根。夏、秋二季采割地上部分，除去泥沙和杂质，晒干。微苦、咸，凉。归肝、胆、胃经。具有清肝利胆、健胃消食和利尿消肿的功效，主治湿热黄疸、胃痛食少和水肿尿少。

[0003] 传统中药饮片临床使用以汤剂为主，存在制备过程繁琐复杂、服用方式不便、药效温和缓慢以及质量控制困难等问题。中药配方颗粒是在中医药理论指导下，对中药饮片采用科学提取、低温浓缩、干燥等现代制药技术制成的规范化、标准化的单味中药颗粒剂，相比于传统汤剂能够更加规范的监控有效成分，方便携带，使用更安心。现有的文献专利对毛菊苣质量标准的研究主要集中在药材方面，目前暂未报道毛菊苣饮片、标准汤剂和配方颗粒的质量标准研究。2020年版《中国药典》一部只记载了毛菊苣药材的鉴别方法，尚未进行特征图谱的控制。

[0004] 与药材和饮片相比，毛菊苣标准汤剂、中药配方颗粒已失去药材原本形态，无法通过性状和显微观察进行鉴别和质量控制。特征图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，能够从整体上对中药或中成药进行更加全面和科学的质量控制。因此，亟需一种可用于评价毛菊苣饮片、标准汤剂或配方颗粒质量的特征图谱。

[0099] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

[0100] 一、指纹图谱的构建

[0101] 1.1原料

[0102] 除非另有说明，实施例中毛菊苣饮片的制备方法如下：对经产地加工的菊科植物毛菊苣(Cichorium glandulosum Boiss et Huet)的干燥地上部分进一步切制、炮制而成。毛菊苣饮片的批号沿用毛菊苣药材的批号。

[0103] 实施例中毛菊苣标准汤剂的制备方法如下：将菊科植物毛菊苣的干燥地上部分，经炮制、加工制成。

[0104] 故毛菊苣饮片和毛菊苣标准汤剂的产地均和毛菊苣药材一致。

[0105] 实施例中毛菊苣配方颗粒的制备方法如下：取毛菊苣饮片(Y2308033)，加水煎煮，滤过，滤液浓缩成清膏，干燥，粉碎，加入辅料，混匀，制粒，即得。以此步骤重复4次，可得下述4批配方颗粒。

[0106] 分别从全国主要药材产区及道地产区购买处方药材共16批，药材的产地信息见下表。

[0107] 毛菊苣饮片、标准汤剂信息表

[0108]

[0109]

[0110] 毛菊苣配方颗粒信息表

[0111]

[0112] 1.2对照药材、对照品

[0113]

[0114] 1.3设备及型号

[0115]

[0116]

[0117] 1.4试剂

[0118] 乙腈：色谱级，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

[0119] 甲醇：色谱级，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

[0120] 磷酸：色谱级，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

[0121] 二、方法构建

[0122] 1、初步方案

[0123] 实施例1毛菊苣饮片、标准汤剂和配方颗粒HPLC特征图谱的初步构建

[0124] 1.1色谱条件

[0125] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.4％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为340nm。

[0126] 理论板数按菊苣酸峰计算应不低于5000。

[0127]

[0128]

[0129] 1.2供试品溶液和参照物溶液的制备

[0130] (1)供试品溶液制备：

[0131] 毛菊苣饮片供试品溶液：取毛菊苣饮片本品粉末(过二号筛)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇25mL，称定重量，超声处理10min，取出，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

[0132] 毛菊苣标准汤剂：取本品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇20mL，称定重量，超声处理10min，取出，放冷，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

[0133] 毛菊苣配方颗粒：取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇10mL，称定重量，超声(功率为250w，频率为53KHz)处理10min，取出，放冷，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

[0134] (2)参照物溶液制备：

[0135] 对照药材参照物溶液：取菊苣对照药材约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇25ml，称定重量，超声处理10分钟，取出，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。

[0136] 对照品溶液：取菊苣酸、绿原酸和秦皮乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含菊苣酸40μg、含绿原酸15μg、含秦皮乙素20μg的混合溶液，作为对照品溶液。

[0137] 1.3测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定即得。

[0138] 1.4特征图谱共有峰的确定

[0139] 采用上述方法将16批毛菊苣饮片、16批毛菊苣标准汤剂、4批毛菊苣配方颗粒，分别制备供试品溶液，在上述项下规定的色谱条件下进样分析，获得16批毛菊苣饮片、16批标准汤剂、4批毛菊苣配方颗粒HPLC特征图谱(图1、图2、图3)。

[0140] 图10中，S(9)表示选择了9个峰进行相似度评价，S1为Y2211026，S2为Y2012017，S3为YC22050901，S4为Y2111062，S5为Y2111036，S6为YC22080104，S7为YC22072702，S8为YC23020609，S9为YC23020608，S10为YC23020607，S11为YC23032001，S12为YC23032002，S13为YC23041401，S14为YC2304005，S15为Y2308033，S16为YC22080102。

[0141] 图11中，S(10)表示选择了10个峰进行相似度评价，S1为MJJG231106，S2为MJJG231202，S3为MJJG231205，S4为MJJG231209，S5为MJJG231210，S6为MJJG231207，S7为MJJG231208，S8为MJJG231206，S9为MJJG231104，S10为MJJG231203，S11为MJJG231105，S12为MJJG231201，S13为MJJG231103，S14为MJJG231101，S15为MJJG231101，S16为MJJG231211。

[0142] 图12中，S(9)表示选择了9个峰进行相似度评价，S1为YFZ2309001，S2为9231203，S3为9231204，S4为9231205。

[0143] 16批毛菊苣饮片、16批毛菊苣标准汤剂、4批毛菊苣配方颗粒均显示相同的8个共有特征峰，并与毛菊苣对照药材参照物色谱峰(图4)中的各特征峰保留时间相对应，说明8个特征峰均能从毛菊苣药材稳定转移到毛菊苣标准汤剂中，因此选择上述8个共有峰作为毛菊苣饮片、标准汤剂及配方颗粒HPLC特征图谱的特征峰，并以峰8(菊苣酸)为参照峰进行标准研究。计算峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7与峰8(S)的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.219(峰1)、0.309(峰2)、0.323(峰3)、0.380(峰4)、0.767(峰5)、0.786(峰6)、0.959(峰7)。

[0144] 1.5特征图谱共有峰的确定

[0145] 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)分别对16批毛菊苣饮片、16批毛菊苣标准汤剂、4批毛菊苣配方颗粒样品进行进样分析，记录色谱图，分别生成毛菊苣饮片、标准汤剂和配方颗粒的对照特征图谱，分别如图5‑7所示，以峰8(菊苣酸)为S峰，计算其他各峰的相对保留时间、相对峰面积、各样品特征图谱与对照特征图谱的相似度，结果见表1、表2、表3。其中，图5‑7中，峰3为绿原酸，峰4为秦皮乙素，峰8为菊苣酸。

[0146] 结果表明，以峰8为参照峰，4批颗粒剂的相似度均大于0.9，相似度较高，说明4批毛菊苣配方颗粒质量差异不大，为严格控制大生产毛菊苣配方颗粒的质量，根据4批样品的测定结果，规定按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，毛菊苣配方颗粒供试品特征图谱与对照特征图谱的相似度应不得低于0.90。

[0147] 表1 4批成品特征图谱共有峰相对保留时间

[0148]

[0149]

[0150] 表2 4批成品特征图谱共有峰相对峰面积

[0151] 批号 1 2 3 4 5 6 7 8(S)YFZ2309001 0.9630 0.8945 0.1725 0.9903 0.1195 0.1966 0.3902 1.0000
9231203 1.0119 1.0584 0.1834 1.0697 0.1216 0.1466 0.3079 1.0000 
9231204 0.8688 1.0678 0.1709 0.9730 0.1286 0.1559 0.3140 1.0000 
9231205 0.7193 0.9619 0.1497 0.8821 0.1199 0.1498 0.3097 1.0000
RSD(％) 14.46 8.31 8.33 7.87 3.46 14.33 12.08 0.00

[0152] 表3毛菊苣配方颗粒相似度评价表

[0153] 批号 相似度(参照) 相似度(对照)YFZ2309001 0.997 0.999
9231203 1.000 0.998 
9231204 0.998 0.999 
9231205 0.993 0.997

[0154] (3)毛菊苣配方颗粒HPLC特征图谱标准

[0155] 根据4批毛菊苣配方颗粒样品的研究结果，最终确定毛菊苣配方颗粒特征图谱标准为：供试品色谱中应呈现8个特征峰，各特征峰与对照药材特征峰保留时间一致；以菊苣酸参照物峰相应的峰8为S峰，规定各特征峰的相对保留时间，其中与对照品参照物峰相对应的峰为峰8(S)，计算峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7与峰8(S)的相对保留时间，各特征峰与S峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.219(峰1)、0.309(峰2)、0.323(峰3)、0.380(峰4)、0.767(峰5)、0.786(峰6)、0.959(峰7)；其中：峰3：绿原酸；峰4：秦皮乙素；峰8(S)：菊苣酸。

[0156] 1.6方法学考察

[0157] 对上述HPLC色谱条件，进行了方法学验证，对精密度、重复性、稳定性进行了考察。

[0158] (1)精密度

[0159] 取毛菊苣药物饮片，批号为Y2304005，按实施例1中供试品溶液的制备和测定法项下操作，连续进样6次，以菊苣酸为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值，结果见表4，各特征峰的相对保留时间RSD小于2.0％，相对峰面积RSD小于3.0％，表明各共有峰精密度良好。

[0160] 表4精密度

[0161]

[0162] (2)重复性

[0163] 取毛菊苣药物饮片，批号为Y2304005，按实施例1中供试品溶液的制备和测定法项下操作，按供试品制备方法平行制备6份，以菊苣酸为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值，结果见表5，各特征峰的相对保留时间RSD小于2.0％，相对峰面积RSD小于3.0％，表明各共有峰重复性良好。

[0164] 表5重复性

[0165]

[0166] (3)中间精密度

[0167] 取毛菊苣药物饮片，批号为Y2304005，按实施例1中供试品溶液的制备和测定法项下操作，由另一位分析人员于不同时间，按供试品制备方法平行制备6份，以菊苣酸为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值，结果见表6，各特征峰的相对保留时间RSD小于2.0％，相对峰面积RSD小于3.0％，表明各共有峰中间精密度良好。

[0168] 表6中间精密度

[0169]

[0170]

[0171] (4)稳定性

[0172] 取毛菊苣药物饮片，批号为Y2304005，按实施例1中供试品溶液的制备和测定法项下操作，在制备后的不同时间进样，测定，以菊苣酸为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值，结果见表7，各特征峰的相对保留时间RSD小于2.0％，相对峰面积RSD小于3.0％，表明供试品溶液在56h内稳定。

[0173] 表7稳定性

[0174]

[0175]

[0176] 二、指纹图谱构建过程中条件的筛选

[0177] 下述实施例或对比例中，峰1‑8与实施例1中一致。

[0178] 1、供试品的考察

[0179] 制备方法考察

[0180] 实施例2‑1

[0181] 取本品粉末Y2304005约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水10mL，静置1h，再精密加入甲醇15mL，称定重量，超声处理30min，取出，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

[0182] 其余条件参照实施例1。

[0183] 实施例2‑2

[0184] 取本品粉末Y2304005约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇25mL，称定重量，超声处理30min，取出，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

[0185] 其余条件参照实施例1。

[0186] 实施例2‑1、2‑2的结果见表8和图8，结果为实施例2‑2的提取效率较高，且整体峰形较好，故选择实施例2‑2作为本试验的最佳供试品制备方法。

[0187] 表8制备方法考察

[0188]

[0189] 提取溶剂考察

[0190] 实施例3‑1

[0191] 取本品粉末Y2304005约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理30min，取出，放冷，再称定重量，分别用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

[0192] 其余条件参照实施例1。

[0193] 实施例3‑2

[0194] 与实施例3‑1的区别仅在于：将甲醇替换为乙醇。

[0195] 实施例3‑3

[0196] 与实施例3‑1的区别仅在于：将甲醇替换为60％甲醇水溶液。

[0197] 实施例3‑1至3‑3的结果见表9和图9，结果为实施例3‑3的提取效率较高，且整体峰形较好，故选择实施例3‑3作为本试验的最佳提取溶剂。

[0198] 表9提取溶剂考察

[0199]

[0200] 提取方法考察

[0201] 实施例4‑1

[0202] 取本品粉末Y2304005约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇25mL，称定重量，分别超声提取30min，取出，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

[0203] 其余条件参照实施例1。

[0204] 实施例4‑2

[0205] 与实施例4‑1的区别仅在于：将超声提取替换为回流提取。

[0206] 实施例4‑1至4‑2的结果见表10和图10，超声提取与回流提取整体图谱及峰面积相差不大，考虑超声提取操作较为便捷，故选择超声提取作为本试验的最佳提取方法。

[0207] 表10提取方法考察

[0208]

[0209]

[0210] 提取时间考察

[0211] 实施例5‑1

[0212] 取本品粉末Y2304005约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇25mL，称定重量，分别超声提取10分钟，取出，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

[0213] 其余条件参照实施例1。

[0214] 实施例5‑2

[0215] 与实施例5‑1的区别在于超声提取30分钟。

[0216] 实施例5‑3

[0217] 与实施例5‑1的区别在于超声提取60分钟。

[0218] 实施例5‑1至5‑3的结果见表11和图11，随着超声时间的增加，峰面积无明显变化，故选择超声10min作为本试验的最佳提取时间。

[0219] 表11提取时间考察

[0220]

[0221]

[0222] 物料比考察

[0223] 实施例6‑1

[0224] 取本品粉末Y23040051.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇25mL，称定重量，分别超声提取10分钟，取出，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

[0225] 其余条件参照实施例1。

[0226] 实施例6‑2

[0227] 与实施例6‑1的区别仅在于：取本品粉末2.0g。

[0228] 实施例6‑3

[0229] 与实施例6‑1的区别仅在于：取本品粉末3.0g。

[0230] 实施例6‑1至6‑3的结果见表12和图12，称样量为1.0g的峰面积最高，故物料比定为1.0g‑25mL为最佳比例。

[0231] 表12物料比考察

[0232]

[0233]

[0234] 注：折算成1.0g峰面积的目的是为了更客观地筛选物料比，具体是指将实施例6‑1至6‑3的物料比统一折算为1g：25mL、1g：12.5mL和1g：8.3mL。

[0235] 3、色谱条件的选择

[0236] 检测波长的选择

[0237] 实施例7‑1

[0238] 对毛菊苣供试品溶液Y2304005进行3D全扫描，结果显示在340nm左右的峰较丰富，且峰形较好，优于其他波长。因此优选340nm作为检测波长，特征图谱见图13。

[0239] 其中，图13的a部分为检测波长为290nm时的特征图谱；图13的b部分为检测波长为300nm时的特征图谱；图13的c部分为检测波长为310nm时的特征图谱；图13的d部分为检测波长为320nm时的特征图谱；图13的e部分为检测波长为330nm时的特征图谱；图13的f部分为检测波长为340nm时的特征图谱；图13的g部分为检测波长为350nm时的特征图谱。

[0240] 其余条件参照实施例1。

[0241] 柱温考察

[0242] 实施例8‑1

[0243] 色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为Waters Sunfire C18色谱柱(5μm，4.6×250mm)；以乙腈为流动相A，以0.4％磷酸溶液为流动相B，高效液相色谱仪为：Thermo Scientific UlitiMate 3000，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为340nm。理论板数按菊苣酸峰计算应不低于5000。

[0244]

[0245]

[0246] 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定即得。

[0247] 其余条件参照实施例1。

[0248] 实施例8‑2

[0249] 与实施例8‑1的区别仅在于：柱温设置为35℃。

[0250] 实施例8‑3

[0251] 与实施例8‑1的区别仅在于：柱温设置为40℃。

[0252] 实施例8‑1至8‑3的结果见表13，不同柱温下各特征峰的相对保留时间有一定的差异，柱温为30℃时为最佳柱温。

[0253] 表13柱温考察

[0254]

[0255] 仪器考察

[0256] 实施例9‑1

[0257] 与实施例8‑1的区别仅在于高效液相色谱仪为：Waters e2695。

[0258] 实施例9‑2

[0259] 与实施例8‑1的区别仅在于高效液相色谱仪为：Thermo Vanquish。

[0260] 实施例9‑3

[0261] 与实施例8‑1的区别仅在于高效液相色谱仪为：Thermo Scientific UlitiMate 3000。

[0262] 实施例9‑1至9‑3的结果见表14，不同仪器测定下各特征峰的相对保留时间均在规定值的±10％范围之内，表明该方法对不同仪器耐用性较好。

[0263] 表14仪器考察

[0264]

[0265] 色谱柱考察

[0266] 实施例10‑1

[0267] 与实施例8‑1的区别仅在于色谱柱为Waters Sunfire C18色谱柱(5μm，4.6×250mm)。

[0268] 实施例10‑2

[0269] 与实施例8‑1的区别仅在于色谱柱为Agilent 5Tc C18色谱柱(5μm，4.6×250mm)。

[0270] 实施例10‑3

[0271] 与实施例8‑1的区别仅在于色谱柱为GL Sciences AQ‑C18色谱柱(5μm，4.6×250mm)。

[0272] 实施例10‑1至10‑3的结果见表15，不同色谱柱各特征峰的相对保留时间有所不同，综合考虑选用Waters Sunfire C18色谱柱(5μm，4.6×250mm)较好。

[0273] 表15色谱柱考察

[0274]

[0275] 流动相的流速考察

[0276] 实施例11‑1

[0277] 与实施例8‑1的区别仅在于流动相的流速为0.8mL/min。

[0278] 实施例11‑2

[0279] 与实施例8‑1的区别仅在于流动相的流速为1.0mL/min。

[0280] 实施例11‑3

[0281] 与实施例8‑1的区别仅在于流动相的流速为1.2mL/min。

[0282] 实施例11‑1至11‑3的结果见表16，不同流速下各特征峰的相对保留时间均在规定值的±10％范围之内，表明该方法对不同流速耐用性较好。

[0283] 表16流速考察

[0284]

[0285]

[0286] 进样量考察

[0287] 实施例12‑1

[0288] 与实施例8‑1的区别仅在于进样量为5μL。

[0289] 实施例12‑2

[0290] 与实施例8‑1的区别仅在于进样量为10μL。

[0291] 实施例12‑3

[0292] 与实施例8‑1的区别仅在于进样量为15μL。

[0293] 实施例12‑1至12‑3的见表17，不同进样量各特征峰的相对保留时间均在规定值的±10％范围之内，表明该方法对不同进样量耐用性较好。

[0294] 表17进样量考察

[0295]

[0296]

[0297] 流动相浓度考察

[0298] 实施例13‑1

[0299] 与实施例8‑1的区别仅在于流动相B为0.2％磷酸溶液。

[0300] 实施例13‑2

[0301] 与实施例8‑1的区别仅在于流动相B为0.3％磷酸溶液。

[0302] 实施例13‑3

[0303] 与实施例8‑1的区别仅在于流动相B为0.4％磷酸溶液。

[0304] 实施例13‑4

[0305] 与实施例8‑1的区别仅在于流动相B为0.5％磷酸溶液。

[0306] 实施例13‑1至13‑4的结果见表18，不同流动相浓度下各特征峰的相对保留时间均在规定值的±10％范围之内，表明该方法对不同流动相浓度耐用性较好。

[0307] 表18流动相浓度考察

[0308]

[0309]

[0310] 洗脱梯度考察

[0311] 实施例14‑1

[0312] 洗脱梯度如下表：

[0313]

[0314] 其余条件参照实施例1。

[0315] 实施例14‑2

[0316] 与实施例14‑1的区别仅在于，洗脱梯度如下表：

[0317]

[0318] 实施例14‑3

[0319] 与实施例14‑1的区别仅在于，洗脱梯度如下表：

[0320]

[0321] 实施例14‑1至14‑3的结果见图14‑图16，残留色谱图是指分析物质残留在色谱柱时的色谱图，该图会影响后续的分析结果，故残留色谱图的面积越小越好。由图14‑图16可知，图14的残留色谱图的面积最大。而图15和16的残留色谱图的面积相当，也就是残留的色谱图对分离的效果无影响，考虑到整体峰形，需要与标汤的流动相保持一致，即选择实施例14‑2为本申请的最佳洗脱梯度。

[0322] 实施例15

[0323] 毛菊苣饮品、标准汤剂或配方颗粒的特征图谱构建方法在实际研发过程中，是以参数为单元进行分批次优化，因此会出现方案一致但结果不同的情况。为进一步验证实验的准确性，对不同批次下所得到的结果进行RSD验证，结果如下表19。

[0324] 表19

[0325]

[0326]

[0327] 由表19可知，各个批次中，当实验条件均和实施例2‑2一致时，RSD小于2％，表明当含量测定中所有的条件均一致的时候，于不同时间检验的结果无明显差异。