[0001] 本发明属于生物学技术领域，具体涉及嗜酸乳杆菌与表没食子儿茶素没食子酸酯联用在制备抗畜禽大肠杆菌病药物中的应用。

[0002] 大肠杆菌属于肠杆菌科的一种革兰氏阴性细菌，其存在于畜禽的胃肠道中，可引起畜禽严重的肠道感染和全身感染。由于抗生素的不合理或者过度使用，大肠杆菌等细菌的耐药性问题越来越严重，给养殖业带来巨大的经济损失，同时也对生物安全和公共卫生造成了严重威胁。为了有效防治大肠杆菌所引起的动物疾病，研发新型抗大肠杆菌感染药物尤为重要。

[0003] 已有研究表明嗜酸乳杆菌和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)均可以抑制大肠杆菌的增殖，但二者单独应用时存在着一些弊端。在临床应用中，单独使用天然产物无法完全取代抗生素，而长期大量服用益生菌容易使机体产生依赖性，丧失繁殖益生菌的能力。

[0032] 下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。

[0033] 实施例1嗜酸乳杆菌和EGCG联用对大肠杆菌的体外抑制作用

[0034] (1)EGCG对大肠杆菌最小抑菌浓度的测定

[0035] 准确称取0.053g EGCG，加入1mL DMSO作为助溶剂，使EGCG溶解，再加水定容至10mL(调节pH＝6.4)，配制成终浓度为5mg/mL的EGCG储备液，经0.22μm的水系滤器过滤除菌，分装，置于‑20℃保存备用。分别挑取大肠杆菌标准株和鸡源大肠杆菌分离株单菌落于
3mL MH(B)液体培养基中，37℃、180rpm培养至对数生长期(OD600＝0.4～0.6)。采用微量肉汤稀释法测定EGCG对大肠杆菌标准株和鸡源大肠杆菌分离株的最小抑菌浓度。

[0036] 表1EGCG对大肠杆菌的MICs(μg/mL)

[0037]

[0038] 结果如表1，EGCG对大肠杆菌标准株和分离株均表现出抑菌活性，最小抑菌浓度均为2500μg/mL。

[0039] (2)嗜酸乳杆菌与大肠杆菌的共培养抑菌试验

[0040] 将大肠杆菌E27在4mL MRS液体培养基中培养至OD600＝0.6；加入100μL浓度为9
10CFU/mL的嗜酸乳杆菌菌液，37℃培养箱内静置培养；分别在0h、6h、12h、18h、24h和30h对共培养体系中的大肠杆菌E27进行菌落计数，并与对照组进行比较。

[0041] 结果如图1所示，嗜酸乳杆菌能够显著抑制共培养体系中大肠杆菌的数量。

[0042] (3)嗜酸乳杆菌与EGCG联用的体外抑菌试验

[0043] 将大肠杆菌E27在4mL MRS肉汤中培养至OD600＝0.6；在各组大肠杆菌培养液中分9
别加入100μL浓度为10CFU/mL的嗜酸乳杆菌菌液和终浓度为1/4MIC(625μg/mL)的EGCG，37℃培养箱内静置培养；于加入菌液和药液的0h、6h、12h、18h、24h和30h，在麦康凯平板上分别对共培养体系中的大肠杆菌E27进行菌落计数并记录结果。

[0044] 结果如图2所示，嗜酸乳杆菌和EGCG联用能显著抑制大肠杆菌的生长能力，且抑制作用优于嗜酸乳杆菌或EGCG单独使用，且优于多粘菌素。

[0045] (4)EGCG和嗜酸乳杆菌联用对大肠杆菌E27粘附CSIEC能力的影响

[0046] ①排阻抑试验：向24孔细胞培养板中加入CSIEC(1×105cells/孔)，CO2培养箱中培5
养细胞生长汇合率至80％左右(此时每孔细胞约为4×10个)；共设置3个试验组，分别单独
8
或联合加入浓度为1×10 CFU/mL嗜酸乳杆菌和156μg/mL EGCG的DMEM，对照组加入等量的
7
DMEM，培养1h；每孔中加入2×10 CFU的大肠杆菌E27，培养1h；用PBS洗涤细胞以去除未结合的大肠杆菌E27，使用200μL含1％Triton X‑100的PBS处理10min，然后加入800μL PBS终止反应；进行菌落计数并计算排阻抑制率。

[0047] 表2嗜酸乳杆菌和EGCG联用排阻抑制大肠杆菌E27对CSIEC的粘附

[0048]

[0049] 注:同列数据肩标不同字母表示差异显著(0.010.05)。

[0050] 嗜酸乳杆菌和EGCG联合应用能够有效排阻抑制大肠杆菌E27对鸡小肠上皮细胞的粘附，并且效果优于嗜酸乳杆菌或EGCG单独使用。

[0051] ②竞争抑试验：向24孔细胞培养板中加入CSIEC(1×105cells/孔)，CO2培养箱中培5
养细胞生长汇合至80％左右(此时每孔细胞约为4×10个)；共设置3个试验组，分别单独或
8
联合加入浓度为1×10 CFU/mL嗜酸乳杆菌和156μg/mL EGCG的DMEM，对照组加入等量的
7
DMEM；同时每孔中加入2×10 CFU的大肠杆菌E27，培养2h；用PBS洗涤细胞以去除未结合的大肠杆菌E27，使用200μL含1％Triton X‑100的PBS处理10min，然后加入800μL PBS终止反应；进行菌落计数并计算竞争抑制率。

[0052] 表3嗜酸乳杆菌和EGCG联用竞争抑制大肠杆菌E27对CSIEC的粘附

[0053]

[0054] 注:同列数据肩标不同字母表示差异显著(0.010.05)。

[0055] 嗜酸乳杆菌和EGCG联合应用能够有效竞争抑制大肠杆菌E27对鸡小肠上皮细胞的粘附，并且效果优于嗜酸乳杆菌或EGCG单独使用。

[0056] ③置换抑制试验：向24孔细胞培养板中加入CSIEC(1×105cells/孔)，CO2培养箱中5 7
培养细胞生长汇合至80％左右(此时每孔细胞约为4×10个)；每孔中加入2×10 CFU的大肠
8
杆菌E27，培养1h；共设置3个试验组，分别单独或联合加入浓度为1×10 CFU/mL嗜酸乳杆菌和156μg/mL EGCG的DMEM，对照组加入等量的DMEM，培养1h；用PBS洗涤细胞以去除未结合的大肠杆菌E27，使用200μL含1％Triton X‑100的PBS处理10min，然后加入800μL PBS终止反应；进行菌落计数并计算竞争抑制率。抑制率＝(对照组大肠杆菌数‑试验组大肠杆菌数)/对照组大肠杆菌数×100％。

[0057] 表4嗜酸乳杆菌和EGCG联用置换抑制大肠杆菌E27对CSIEC的粘附

[0058]

[0059]

[0060] 注:同列数据肩标不同字母表示差异显著(0.010.05)。

[0061] 嗜酸乳杆菌和EGCG联合应用能够有效置换抑制大肠杆菌E27对鸡小肠上皮细胞的粘附，并且效果优于嗜酸乳杆菌或EGCG单独使用。

[0062] (5)EGCG和嗜酸乳杆菌联用对感染大肠杆菌的CSIEC培养液上清中细胞因子含量的影响

[0063] 向24孔细胞培养板中加入CSIEC(1×105cells/孔)，CO2培养箱中培养细胞生长汇5
合至80％左右(此时每孔细胞约为4×10个)；共设置3个试验组，分别单独或联合加入浓度
8
为1×10CFU/mL嗜酸乳杆菌和156μg/mL EGCG的DMEM，对照组加入等量的DMEM，培养1h；每
7
孔中加入2×10 CFU的大肠杆菌E27，培养2h；将细胞培养液3000rpm/min离心10min，取上清液，用ELISA试剂盒检测上清液中TNF‑α、IL‑1β和IL‑10的含量。

[0064] 试验结果见图3、图4和图5，与模型组相比，嗜酸乳杆菌和EGCG联用可以降低TNF‑α和IL‑1β的含量至空白组水平、提高IL‑10的含量，且效果优于嗜酸乳杆菌或EGCG单独使用。

[0065] 实施例2EGCG和嗜酸乳杆菌联用对大肠杆菌病的体内预防作用

[0066] (1)大肠杆菌感染雏鸡模型的建立

[0067] 选择90只1日龄雏鸡建立大肠杆菌E27感染动物模型，1‑2日龄的雏鸡自由采食饮水，于3日龄对雏鸡进行随机分组，每组15只。同一组内，体重差异应小于平均体重的10％，组间体重平均值的差异应小于5％。随机将6组雏鸡分别编为空白对照组、模型组、嗜酸乳杆菌组、EGCG组，嗜酸乳杆菌+EGCG组和多粘菌素组，并按照表5进行处理。

[0068] 表5试验分组及处理

[0069]

[0070] 给药剂量：

[0071] 嗜酸乳杆菌组：饲喂嗜酸乳杆菌，剂量为108CFU/只；

[0072] EGCG组：饲喂EGCG，剂量为50mg/kg b.w.；

[0073] 嗜酸乳杆菌+EGCG组：饲喂LA和EGCG，剂量分别为108CFU/只和50mg/Kg b.w；

[0074] 多粘菌素组：饲喂多粘菌素，剂量为10g/1000Kg饲料；

[0075] 大肠杆菌E27感染剂量：于雏鸡7日龄灌服0.5mL 1×1010CFU/mL大肠杆菌E27菌液。

[0076] (2)各试验组雏鸡发病情况

[0077] 记录攻毒后各组雏鸡不同时间的发病情况，计算各组发病率。

[0078] 结果如图6所示，嗜酸乳杆菌和EGCG联用可以降低雏鸡的发病率，且效果优于嗜酸乳杆菌、EGCG和多粘菌素单独使用。

[0079] (3)各试验组雏鸡的免疫器官指数测定

[0080] 于14日龄采集各组雏鸡的免疫器官(胸腺、脾脏和法氏囊)，并称重，计算免疫器官指数。

[0081] 免疫器官指数＝免疫器官重量(g)/体重(kg)。

[0082] 表6各组雏鸡的免疫器官指数(g/kg)

[0083]

[0084]

[0085] 注:同列数据肩标不同字母表示差异显著(0.010.05)。

[0086] 与模型组相比，嗜酸乳杆菌和EGCG联用可显著提高感染雏鸡的胸腺和法氏囊指数，降低脾脏指数至正常水平。

[0087] (4)各试验组雏鸡血液生理指标检测

[0088] 于14日龄取雏鸡血液约200μL于1.5mL抗凝管中，使用血液分析仪进行血液生理指标检测。检测白细胞总数(WBC)、淋巴细胞数(LYM)、单核细胞数(MON)、中性粒细胞数(GRA)、血红蛋白含量(HGB)和红细胞总数(RBC)。

[0089] 表7各组雏鸡的血液生理指标

[0090]

[0091]

[0092] 注:同列数据肩标不同字母表示差异显著(0.010.05)。

[0093] 与空白组相比，模型组雏鸡中性粒细胞显著升高，淋巴细胞和血红蛋白显著降低，表明大肠杆菌感染可造成雏鸡炎症反应，但嗜酸乳杆菌和EGCG联用可使血液生理指标恢复至接近正常水平。

[0094] (5)各试验组雏鸡小肠组织细胞因子含量检测

[0095] 称取0.1g鸡小肠组织，置于1.5mL离心管中，加入0.9mL的PBS，匀浆后，5000r/min离心10min，取上清，备用。取ELISA试剂盒检测IL‑1、TNF‑α和IL‑10含量，检测步骤严格按照说明书进行。用多功能微孔板检测仪检测各孔的OD值(波长450nm)，计算小肠组织细胞因子含量(IL‑1、TNF‑α和IL‑10)含量。

[0096] 试验结果如图7、图8和图9所示。与模型组相比，嗜酸乳杆菌和EGCG联用能够极显著降低TNF‑α的含量，且效果优于嗜酸乳杆菌单独使用；与模型组相比，嗜酸乳杆菌和EGCG联用能够极显著增加IL‑10的含量，且效果优于嗜酸乳杆菌或EGCG单独使用。

[0097] (6)qRT‑PCR检测各试验组雏鸡盲肠内容物中嗜酸乳杆菌和大肠杆菌的含量[0098] 以细菌通用16S rRNA为内参基因，大肠杆菌16S rRNA、嗜酸乳杆菌16S rRNA为目的基因，建立实时荧光定量PCR标准曲线，并检测雏鸡盲肠内容物基因组DNA中大肠杆菌E27和嗜酸乳杆菌16S rRNA的相对含量。

[0099] 结果如图10和图11所示。与模型组相比，嗜酸乳杆菌和EGCG联用能极显著降低盲肠中大肠杆菌数量，且效果优于嗜酸乳杆菌或EGCG单独使用。

[0100] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。