技术领域
[0001] 本发明涉及堆肥技术领域，具体而言，涉及一种复合菌剂及好氧堆肥的方法。
相关背景技术
[0002] 堆肥是实现畜禽粪污无害化、资源化和减量化的重要技术。嗜热菌在堆肥过程有机质降解、有害气体排放发挥着主导作用。由于堆肥接种的传统生物制剂活性在嗜热阶段迅速下降，因而有必要开发具有嗜热生物活性的复合接种剂以提升堆肥效率。
[0003] 现有研究表明，狐、貉等犬科动物由于进食高蛋白和高脂肪的日粮，其粪便存留大量的未消化的高蛋白质和高脂肪，存在堆肥腐熟周期长，营养物质损失大，有机质降解慢的问题，目前尚无高效便捷的方法提升狐、貉等犬科动物粪污堆肥效率。
[0004] 鉴于此，特提出本发明。
具体实施方式
[0046] 现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
[0047] 除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methodsin Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbookof Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
[0048] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0049] 第一方面，本发明提供了一种复合菌剂，其包括：解硫铵素芽孢杆菌(Aneurinibacillusaneurinilyticus)、暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和产朊假丝酵母菌(Candida utilis)，解硫铵素芽孢杆菌为保藏编号为CCTCC NO：M 20232662的细菌，暹罗芽孢杆菌为保藏编号为CCTCC NO：M 20232663的细菌，枯草芽孢杆菌为保藏编号为CGMCC No.12484的细菌，地衣芽孢杆菌为保藏编号为CGMCC No.12486的细菌，产朊假丝酵母菌为编号为AY91011的产朊假丝酵母。
[0050] 枯草芽孢杆菌为保藏编号为CGMCC No.12484的细菌即为专利公开号为CN107058181B的枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌为保藏编号为CGMCC No.12486的细菌即为专利公开号为CN107043724B的地衣芽孢杆菌。
[0051] 保藏编号为CCTCC NO：M 20232663的细菌，暹罗芽孢杆菌为发明人从乌苏里貉自然堆肥中分离获得一株耐热降解有机质的菌株CFMM011，经过16S rRNA鉴定，在NCBI数据库中序列的BLAST分析显示，分离株CFMM011在系统发育树上与Bacillus siamensisCR‑502(AY603658)具有99.93％的同源性，因此将其命名为暹罗芽孢杆菌。CFMM011为革兰氏阳性菌，在LB固体培养基上菌落乳白色，呈圆形，边缘不规则，不透明，菌落粘稠，有褶皱，菌株成短杆状，长1.5‑2μm、宽0.4‑0.6μm。其在52℃下可正常生长，57℃下仍可增值，62℃下停止生长，具有较好的耐热性。该菌株的最适pH为5.0～7.0，具有高盐耐受能力。保藏日期为2023年12月25日，分类命名为暹罗芽孢杆菌CFMM011 Bacillussiamensis CFMM011，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，鉴定结果为存活。
[0052] 解硫铵素芽孢杆菌为保藏编号为CCTCC NO：M 20232662的细菌，是发明人从乌苏里貉自然堆肥中分离获得一株耐热降解有机质的菌株CFMM007，经过16s rRNA鉴定，在NCBI数据库中序列的BLAST分析显示，分离株CFMM007在系统发育树上与Aneurinibacillus aneurinilyticus ATCC 12856(KE952670)处于同一簇中，具有99.79％的同源性，因此将其命名为解硫铵素芽孢杆菌。CFMM007为革兰氏阳性菌，菌落在LB固体培养基上呈圆形，边缘不规则，半透明，表面蜡样，质地粘稠，菌株呈杆状，长2.5‑3μm、宽1.0‑1.4μm。其在52℃下可正常生长，57℃下仍可增殖，62℃下停止生长，具有较好的耐热性。该菌株的最适pH为6.0～7.0，在3％的盐浓度下具有极好的耐盐特性。解硫铵素芽孢杆菌仅对多粘菌素B具耐药性，对呋喃唑酮中度敏感，除了对丁胺卡那、卡那霉素耐药之外，其对大多数临床用药具敏感性，因此，应用解硫铵素芽孢杆菌时携带与传播耐药性风险很低。保藏日期为2023年12月25日，分类命名为解硫铵素芽孢杆菌Aneurinibacillusaneurinilyticus CFMM007，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，鉴定结果为存活。
[0053] 发明人经过长期大量的筛选，发现将解硫铵素芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌进行组合，能够用于堆肥菌剂的添加菌。添加上述复合菌剂后，能够显著提升堆肥效率。
[0054] 该复合菌剂能够显著加快升温速率，加速腐熟；能够延长堆肥温度峰值的维持时间、降低嗜热期pH值、提高腐殖质含量。经检测，本发明提供的复合菌剂降低了嗜热期堆肥+ ‑中的NH4‑N水平，提高了堆肥中的NO3‑N含量，提高了嗜热期与腐熟期微生物群落丰度，从根本上提高了堆肥效率。
[0055] 在本发明应用较佳的实施方式中，复合菌剂中总活菌数量为大于1×108CFU/g。在上述活菌数量下具有较好的堆肥效果。
[0056] 在本发明应用较佳的实施方式中，复合菌剂中解硫铵素芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和产朊假丝酵母菌的质量比或体积比为：(1‑3):(1‑3):1:1:2。
[0057] 在上述配合比例下，具有比单一的菌具有更高的堆肥效率。上述的复配比例有助于提高腐殖质含量。上述复合菌中，解硫铵素芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和产朊假丝酵母菌分别起到了高效分解蛋白质、淀粉、纤维素及油脂的作用。
[0058] 复合菌剂中解硫铵素芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌的质量比或体积比例如为：1:1:1:1:2、2:2:1:1:2或3:3:1:1:2。
[0059] 在一种可选的实施方式中，复合菌剂中解硫铵素芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌的质量比为：3:3:1:1:2。经过筛选，在该质量比下，接种菌‑剂后在加速腐熟、堆肥温度峰值维持时间、提高发芽指数、腐殖质含量和NO3 ‑N含量上效果最好。因此，利用3:3:1:1:2的菌剂比例能更好的提高牛粪堆肥中微生物群落丰度，提高堆肥效率。
[0060] 第二方面，本发明还提供了复合菌剂在农业废弃物资源化和/或城市固体有机废物资源化中的应用。
[0061] 在本发明应用较佳的实施方式中，农业废弃物资源化和/或城市固体有机废物资源化为废弃物饲料化、废弃物能源化或废弃物肥料化。通过将农业废弃物资源化和/或城市固体有机废物资源化，可以实现废弃物的回收再利用，有助于降低能源消耗，提高资源使用率。
[0062] 在本发明应用较佳的实施方式中，在废弃物饲料化中的应用包括：
[0063] 以复合菌剂发酵废弃物用于制备动物饲料。
[0064] 在一种可选的实施方式中，动物饲料为禽畜或昆虫饲料。
[0065] 禽畜的粪便中残留有矿物质和蛋白质，因此，以复合菌剂对动物粪便发酵，经过风干或烘干处理后可以加入昆虫等不可食用动物的饲料中，作为昆虫等动物饲料添加剂的一种。在一种可选的实施方式中，可以利用农业废弃物，如秸秆、藁秕、麸糠等进行发酵，作为畜禽饲料。
[0066] 在一种可选的实施方式中，在废弃物能源化中的应用包括：以复合菌剂发酵废弃物产生沼气；包括不限于将农作物的秸秆或禽畜的粪便进行发酵，转化为沼气，用于人们的日常生活。
[0067] 随着土地的开发程度越来越高，土壤的肥力下降，土壤品级，可耕作能力也越来越低。将废弃物发酵后回填至土地，可以作为肥料。不但能够帮助农作物生长，还能促进土壤的肥力上升，更容易被农作物吸收，减少化学肥料的使用。
[0068] 在一种可选的实施方式中，在废弃物肥料化中的应用包括：以复合菌剂发酵废弃物用于制备土地肥料；
[0069] 在一种可选的实施方式中，制备土地肥料是：向农业废弃物和/或城市固体有机废物中添加复合菌剂，进行堆肥。
[0070] 复合菌剂在堆肥中的应用包括如下至少一种用途：
[0071] (1)加快升温速率；
[0072] (2)延长堆肥温度峰值的维持时间；
[0073] (3)降低嗜热期pH值；
[0074] (4)提高腐殖质含量；
[0075] (5)降低嗜热期堆肥基质中的NH4+‑N水平；
[0076] (6)提高堆肥基质中的NO3‑‑N含量；
[0077] (7)提高嗜热期与腐熟期微生物群落丰度；
[0078] (8)降低堆肥基质中厚壁菌门的丰度。
[0079] 在本发明应用较佳的实施方式中，农业废弃物资源化和/或城市固体有机废物资源化为废弃物生态化。例如农业废弃物在生态环境中的利用可以促使其在生产链中发挥较大的作用，从而形成生态化的模式，这种模式包括不限于：秸秆发酵还田、粪污发酵养虫等形式，其在资源空间利用上进行优势互补，形成复合式的生产体系，发挥生物共生的作用。
[0080] 在本发明应用较佳的实施方式中，农业废弃物选自动物粪污和植物废弃物中的至少一种；
[0081] 在一种可选的实施方式中，动物粪污选自人、禽、畜和狐、貉等犬科动物粪污中的至少一种；
[0082] 在一种可选的实施方式中，植物废弃物选自玉米秸秆、水稻秸秆、芦苇杆、高粱杆和大豆秸秆废弃物中的至少一种。
[0083] 在本发明应用较佳的实施例中，上述复合菌为复合菌的浓缩物、糊化物、干燥物和液态物中的至少一种。
[0084] 干燥物包括不限于喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空干燥物、滚筒干燥物，本领域的技术人员可以根据需要调整复合菌剂的形态。
[0085] 第三方面，本发明还提供了采用复合菌剂进行好氧堆肥的方法，其包括如下步骤：向农业废弃物中接种1‑5％的复合菌剂，进行发酵腐熟。
[0086] 例如向农业废弃物中接种1％、2％、3％、4％或5％的复合菌剂。
[0087] 在本发明应用较佳的实施方式中，进行发酵腐熟的时间为25d‑30d。本发明提供的方法相比于现有技术，大幅缩短了发酵腐熟时间，提高了堆肥效率。
[0088] 第四方面，本发明还提供了一种堆肥基质，其上述的方法制得。
[0089] 堆肥基质包括不限于：动物粪便堆肥物和/或植物废弃物堆肥物。
[0090] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0091] 实施例1
[0092] 本实施例提供了菌株的分离、纯化和鉴定方法。
[0093] (1)菌种富集、分离与纯化
[0094] 取采集的乌苏里貉粪污样本10g，加入到装有90ml无菌水的三角瓶中，于180rpm恒温摇床上振荡2h，制成菌悬液。吸取2ml菌悬液加入装有100ml LB培养基的三角瓶中，在1 4 3
180rpm、37℃下富集孵育2d。取1ml富集培养液放入试管，分别稀释10 ～10倍，将稀释10 、
4
10 倍的菌悬液放入80℃水浴锅孵育10min。取水浴后的菌悬液100uL，涂布于LB固体培养基，37℃倒置培养2d。挑出形态特征明显不同的单一菌落，采用平板画线法2～3次，纯化得到单菌落。
[0095] 80℃条件下分离出20株菌，通过菌落形态和显微镜观察，挑选出其中两株生长性能最好的革兰氏阳性菌，编号编号分别为CFMM007和CFMM011。CFMM007菌落在LB固体培养基上呈圆形，边缘不规则，半透明，表面蜡样，质地粘稠，菌株呈杆状，长2.5‑3μm、宽1.0‑1.4μm。CFMM011菌落乳白色，呈圆形，边缘不规则，不透明，菌落粘稠，有褶皱，菌株成短杆状，长1.5‑2μm、宽0.4‑0.6μm。
[0096] (2)CFMM007的分子生物学鉴定：
[0097] 吸取培养好的菌液，使用索莱宝细菌基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，使用细菌通用引物27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R:ACGGCTACCTTGTTACGACTT通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目标菌株16S rRNA基因。PCR反应体系(25μL)：模板DNA2μL，引物各5μL，Taq酶0.2μL,10×Taq Buffer缓冲液2.5μL，dNTPs(各2.5mmol/L)2μL,ddH2O 8.3μL。PCR反应条件：94℃10min；58℃30s，72℃45s，30个循环；72℃5min。扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测并回收后送至武汉天一华煜基因科技有限公司检测。将测得菌株的序列在NCBI数据库中进行BLAST对比，基于16S rRNA基因序列比对结果以Paenibacillus polymyxa DSMZ 36(AJ320493)为外枝构建的Neighbor‑Joining系统发育树。
[0098] 根据测得的细菌16S rRNA基因序列，在NCBI数据库中序列的BLAST分析显示，分离株CFMM007在系统发育树上(即图6中的测序编号D007)与Aneurinibacillusaneurinilyticus ATCC 12856(KE952670)处于同一簇中，具有99.79％的同源性；考虑到分离株形态学和生理生化特征，分离株CFMM007判定为解硫铵素芽孢杆菌。
[0099] 16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示：
[0100] TGCAGTCGAGCGGACCAAAGAAGAGCTTGCTCTTCGGCGGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCTGTACGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATACGTTTTTCAGACCGCATGGTCTGAAAGAGAAAGACCTTTGGTCACGTACAGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGAAGAACCGCCGGGATGACCTCCCGGTCTGACGGTACCTAACGAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTTCTTAAGTCAGGTGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGCCACTTGAAACTGGGAGGCTTGAGTGCAGGAGAGGAGAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCCGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGCCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGAGTGCTAGGTGTTGGGGACTCCAATCCTCAGTGCCGCAGCTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATCCCGCTGTCCCTCCTAGAGATAGGAGCTCTCTTCGGAGCAGCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGGGAGACTGCCGTCGACAAGACGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGAACAACGGGCAGCCAACTCGCGAGAGTGCGCCAATCCCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGCAGATGAT。
[0101] (3)CFMM011的分子生物学鉴定
[0102] 吸取培养好的菌液，使用索莱宝细菌基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，使用细菌通用引物27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R:ACGGCTACCTTGTTACGACTT。通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目标菌株16S rRNA基因。
[0103] PCR反应体系(25μL)：模板DNA 2μL，引物各5μL，Taq酶0.2μL,10×Taq Buffer缓冲液2.5μL，dNTPs(各2.5mmol/L)2μL,dd H2O 8.3μL。PCR反应条件：94℃10min；58℃30s，72℃45s，30个循环；72℃5min。扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测并回收后送至武汉天一华煜基因科技有限公司检测。将测得菌株的序列在NCBI数据库中进行BLAST对比，基于16S rRNA基因序列比对结果以Paenibacillus siamensis DSMZ 36(AJ320493)为外枝构建的Neighbor‑Joining系统发育树。
[0104] 分离株CFMM011(也即图7中的测序编号DO11)在系统发育树上(图7所示)与BacillussiamensisCR‑502(AY603658)具有99.93％的同源性。
[0105] 考虑到分离株形态学和生理生化特征，分离株CFMM011判定为暹罗芽孢杆菌。
[0106] 分离株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.2所示：
[0107] AAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGG。
[0108] (4)解硫铵素芽孢杆菌为保藏编号为CCTCC NO：M 20232662的细菌，暹罗芽孢杆菌为保藏编号为CCTCC M 20232663的细菌，枯草芽孢杆菌为保藏编号为CGMCCNo.12484的细菌，地衣芽孢杆菌为保藏编号为CGMCC No.12486的细菌，酵母菌为购买自中国工业微生物菌种保藏中心的产朊假丝酵母，编号为AY91011。其中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌均来源于健康特种动物肠道分离获得。
[0109] (5)进行种子液的制备
[0110] 将分离出的CFMM007和CFMM011菌株接种在LB琼脂培养基上，在37℃下培养24小时。将酵母菌接种在麦芽汁琼脂培养基中，随后在37℃培养24小时，通过梯度稀释板计数8
法，培养菌株的浓度均大于1×10cfu/ml，并用作接种剂的种子溶液(Xu等人，2022)。
[0111] 实施例2
[0112] 本实施例提供了采用复合菌剂对浣熊粪便和玉米秸秆进行堆肥的方法，复合菌剂中的各菌来自实施例1。采用的复合菌剂中解硫铵素芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌的质量比1:1:1:1:2，即为T1菌剂组。
[0113] 堆肥方法如下：
[0114] (1)分别从左家镇(中国吉林)的毛皮动物养殖场和附近的村庄收集了貉粪便和玉米秸秆。在开始堆肥之前，将玉米秸秆粉碎成1至2厘米大小的碎片，并与新鲜的貉粪便均匀混合。用于堆肥的原料的物理化学性质如表1所示。
[0115] 表1堆肥原料理化指标
[0116] 参数 貉粪便 玉米秸秆水分含量(％) 75.06±1.09 10.29±0.19
pH 8.15±0.10 5.70±0.10
TOC(％) 69.236±8.10 64.803±1.80
TN(％) 4.458±0.478 1.270±0.01
C/N 15.55±0.67 50.55±0.49
EC(mS/cm) 3.91±0.03 1.47±0.03
[0117] 注：TOC，总有机碳；TN，总氮；EC，电导率；C/N、碳氮比。结果为三次重复的平均值±标准偏差。
[0118] (2)选用190升便携式旋转堆肥桶作为试验容器。
[0119] 将貉粪便与秸秆碎按照质量比为2:1的比例混合均匀，并加入2％的复合菌。堆体总体C/N比约为27(Cerda等人，2018)，调节堆肥湿度均控制在60％(Rijal和Lin，2021)。堆肥桶由可回收塑料制成，壁厚3毫米，侧面有一个通风孔，里面有一根空气管和一个辅助堆放装置。大小为99.5×79×90cm。试验在一个有氧堆肥室中进行，为期30天。旋转堆肥桶混合物的负载为35kg(基质深度70cm)。对于实验的前10天，每3天进行一次反向堆叠，而对于第二个20天，每5天进行一次达60转的反向堆叠。
[0120] 实施例3
[0121] 与实施例2相比，区别在于堆肥采用的复合菌剂不同，其余步骤相同。
[0122] 采用的复合菌剂中解硫铵素芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌的质量比2:2:1:1:2，即为T2菌剂组。
[0123] 实施例4
[0124] 与实施例2相比，区别在于堆肥采用的复合菌剂不同，其余步骤相同。
[0125] 采用的复合菌剂中解硫铵素芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母的质量比3:3:1:1:2，即为T3菌剂组。
[0126] 实验例1
[0127] 样品采集与分析。采集实施例2‑4和对比例1的样品进行监测温度、测定水分含量、pH、电导率(EC)。
[0128] 在堆肥的第0、3、7、10、15、20、25和30天搅拌基质后，通过五点取样法收集样品(Lu等人，2021；Ren等人，2020)。将采集的不少于500克的样品分为两部分，一部分保存在‑20℃的试验中用于新鲜样品的试验，一部分干燥用于干燥样品的分析。
[0129] 根据堆肥预试验的温度变化特点，在第1、5、13和30天采集样品，并在‑80℃下保存，进行测序分析。每天上午8点和下午18点测量堆肥温度，并监测环境温度。表层(10‑20厘米)、中层(20‑50厘米)和底层(50‑70厘米)的平均温度是当时的温度，每天两次的平均温度就是当天的温度。
[0130] 为了测定水分含量，将一部分样品在65℃下干燥，直到达到恒定重量。
[0131] 随后，使用粉碎机对其进行粉碎以进行其他指标测量。根据农业行业标准(NY525‑2021)测量pH、电导率(EC)。新鲜堆肥样品与去离子水以1:10(25℃)的比例混合，并在摇床中以180r/min的速度振荡2小时。之后，将混合物静置20分钟，然后使用便携式pH计(PHS‑
3C，中国上海雷磁)和电导率计(DDB‑303A，中国上海雷磁)测量pH和电导率(EC)。
[0132] 结果参照图1所示，T1菌剂组、T2菌剂组和T3菌剂组三个处理组的温度趋势与对照组非常相似(图1a，Ambient为环境温度)。在堆肥的第3天，温度迅速升高。这可能是由于堆肥翻转和混合增强了基质和氧气之间的接触(Pinto等人，2023)。此时，T1‑T3处理组测得的平均温度均超过50℃。与对照组相比，接种剂的添加显著加速了堆肥的升温(4天，P<0.05)。CK‑T3处理组在第6、5、5和4天达到最高温度，峰值温度分别为65.4℃、66.5℃、67.7℃和
67.2℃。根据《中国动物粪便堆肥技术规范》(NY/T 3442‑2019)，堆肥温度超过55℃并保持5天或更长时间可以达到卫生标准(Zhang et al.，2023)。CK‑T3治疗组的嗜热期持续时间分别为6、6、6和7天，均符合卫生标准。随着可溶性有机物的快速消耗，堆肥堆的温度在第10天开始下降。观察温度变化曲线，很明显，与未处理的对照组(CK)相比，添加接种物(T1‑T3)导致显著更快的温度上升和更高的温度峰值。接种微生物菌剂后，微生物的快速增殖和代谢，以及有机物的加速分解，释放出大量的生物热，从而提高了菌堆的温度(Fan等人，2021；
Yang等人，2020)。同时，提高堆肥堆内的温度可以加速有机物的降解，从而提高生物降解率(Rastogi等人，2019)。
[0133] 水分含量是影响自由空气空间、微生物活性和温度以及其他过程因素的关键参数(Rastogi等人，2020)。堆肥过程中的水分含量保持在55％至70％的范围内(图1b)，这在适当的湿度范围内(Luo和Chen，2004)。通风、翻耕、蒸发、浸出、堆肥方法等因素都会导致堆肥堆内水分含量的波动(Liu et al.，2017)。
[0134] 本发明使用旋转堆肥箱有助于最大限度地减少水分损失，任何凝结在堆肥箱顶部内表面的蒸发水分都可以流回堆肥堆。图1b中观察到的水分含量最初略有增加可能是有机物快速分解的结果，在此过程中，基质中的结合水由于微生物活性而转化为游离水。(陈等，2022；程等，2022)。生物降解会导致堆肥堆基质软化、水分饱和度过高和沉降，导致渗滤液流出。此外，易得有机物的快速消耗降低了生物活性，随后导致水分含量降低。
[0135] 堆肥基质的pH值在堆肥的初始阶段开始上升，如图1c所示，在嗜热阶段达到峰值。随着堆肥进入冷却阶段，基质pH值开始下降，在成熟阶段达到最低点。堆肥加热和高温阶段pH值的增加归因于有机物的降解以及氨化导致的氨的大量产生和积累(Li et al.，2021)。
高温阶段后，氨化作用减弱，硝化和亚硝化过程将氨转化为硝酸盐(Wang et al.，2016)。同时，伴随着有机酸的产生，这导致堆肥的pH值降低(Yang等人，2019)。在堆肥的第7天，四组CK‑T3的pH值分别增加到8.40、8.23、8.10和8.13。在堆肥的高温阶段，添加微生物制剂显著降低了pH值(P<0.05)。如图1c所示，添加微生物剂显著降低了堆肥的加热阶段、高温阶段和冷却阶段的pH值，这对提高堆肥质量非常有益(Zhou et al.，2019)。由于pH值较低，它减轻了氨化作用造成的氮损失(Chen et al.，2020)。
[0136] 电导率(EC)直接反映堆肥中盐离子的浓度，通常用于评估堆肥的成熟度及其对植‑1物的植物毒性(Bernal等人，2009；张等人，2014)。当电导率低于4mS/cm 时，被认为对植物来说是可以容忍的(Waqas等人，2018)。堆肥混合物的电导率与其原料成分有关，将粪便与有机添加剂混合可以有效缓解EC值过高的问题(Manu等人，2021)。该实验证明了类似的效果，粪便原料在堆肥前的EC值为3.91，与玉米秸秆混合后的平均EC值为3.15。通常，在堆肥的初始阶段，由于小分子无机物质的形成，有机物的快速分解导致电导率的快速增加(Chen等人，2020)。随后，在固化和沉降阶段，EC值降低(Waqas等人，2018)。然而，从图1d中观察到，堆肥的EC在相对较窄的范围内仅表现出较小的波动，没有显示出显著差异(P>0.05)。在本实验中，水分含量保持稳定，因此阻止了水溶性营养素浓度的富集(Manu et al.，2017)。
[0137] 实验例2
[0138] 本实验例进行堆肥过程中接种物对碳转化和纤维素降解的影响实验。
[0139] 使用连续流动稳定同位素质谱仪(Isoprime 100，德国)检测实施例2‑4以及对比例1中堆肥总有机碳和总氮含量。将这些测量结果进行比较，得出C/N比。基于Van Soest的中性洗涤剂纤维(NDF)、酸性洗涤剂纤维(ADF)和酸性洗涤剂木质素(ADL)技术，使用自动纤维分析仪器(ANKOM 2000i，上海)分析堆肥纤维素(Van Soest等人，1991)。
[0140] TOC是堆肥基质中有机碳质量的总和，存在于各种含碳有机化合物中(Mahmoud等人，2007)。如图2中a所示，在堆肥过程中，有机物不断分解，释放出二氧化碳，导致TOC含量呈下降趋势(Awasthi等人，2016)。TOC在最初的10天内迅速下降，随后稳定且逐渐下降。在最初的堆肥阶段，可快速降解的有机物被快速消耗，导致有机碳含量快速降低。在后期阶段，不易降解的有机物质以较慢的速度分解，导致TOC在随后的二十天内逐渐下降，甚至趋于平稳。堆肥完成后，CK‑T3的TOC含量分别为34.82％、36.06％、36.09％和36.56％。相比之下，对照组的TOC水平明显较低，这些差异主要发生在堆肥的后期，如图2中a所示。在堆肥的前10天，CK‑T3的TOC消耗率分别为8.10％、9.42％、9.16％和8.67％。微生物制剂处理组在堆肥的早期阶段显著加快了有机物的降解速度。这一发现与王(Wang etal.，2021b)和段(Duan et al.，2020)进行的研究密切一致。微生物制剂能抑制堆肥分解过程中TOC的降解。本发明的发现与几篇报道外源性细菌制剂可以刺激TOC降低的论文不一致(Wang等人，
2021a)。
[0141] 纤维素是有机废物堆肥的关键成分，是最稳定、最难分解的有机碳部分，也是限制堆肥效率和腐殖质形成的关键因素(Jurado等人，2015)。在纤维素含量的波动中，微生物处理组(T1‑T3)呈下降趋势，在升温期间快速增加，在高温期间急剧减少，在冷却期间逐渐稳定。随后，在成熟期，出现了另一次下降(图2中b)。与此相比，对照组的纤维素含量呈现出更为平缓的趋势。在堆肥的早期阶段，纤维素和半纤维素都富集，导致其含量增加。这种现象部分归因于易降解有机物的消耗，另一方面，归因于木质素‑半纤维素复合物对纤维素酶促水解的抑制(Shen et al.，2015)。第四天，纤维素水平迅速下降，接种微生物处理组表现出更高的降解率。到第10天，四组的纤维素降解率分别为7.03％、13.49％、14.06％和10.09％。结果与Xu等人一致。(Xu et al.，2019)，表明接种微生物制剂显著提高了堆肥高温阶段纤维素分解的效率(P<0.05)。
[0142] 半纤维素含量的变化趋势与纤维素相似，如图2中c所示。半纤维素是一种低分子量多糖，在高温阶段的分解效率高于纤维素和木质素(Xu et al.，2019)。在图表中，很明显，添加微生物制剂的组在高温阶段表现出更高的半纤维素降解率，T3组表现出最有效的结果，与先前的发现一致(Mei等人，2020；朱等人，2021)。堆肥结束时，CK‑T3组的半纤维素降解率分别为12.63％、17.22％、14.14％和17.83％，其中T3组表现出最有利的性能。这可能是由于接种堆肥堆中的温度较高，提高了半纤维素分解的效率(Zhou et al.，2023)。
[0143] 随着堆肥的进展，木质素含量逐渐增加(图2中d)。纤维素的变化与基质中木质素的变化密切相关。当大量的纤维素和半纤维素被去除时，内部木质素成分变得更加暴露。实验结果表明，不同处理组对堆肥基质中木质素的去除没有显著差异。
[0144] 实验例3
[0145] 本实验例进行堆肥过程中接种物氮转化的影响实验。使用连续流动稳定同位素质谱仪(Isoprime 100，德国)堆肥总有机碳和总氮含量。将这些测量结果进行比较，得出C/N比。硝酸盐氮和铵态氮采用稳定同位素质谱仪(ATC‑185)NY/T 1116‑2014法测定。
[0146] 在堆肥过程中，无机氮的主要形式是铵态氮(NH4+‑N)和硝酸态氮(NO3‑‑N)。从图3中a可以看出，总氮含量分两个阶段变化：在堆肥早期快速下降，然后在高温阶段后持续增加。在堆肥的早期阶段，含氮有机物被好氧细菌矿化，导致总氮含量下降(Wang et al.，2020)。氮的损失主要发生在嗜热阶段，NH3大量释放(Nigussie等人，2016)。因此，当堆肥从第四天开始进入高温阶段时，高温阶段导致总氮含量最低。随着堆肥堆逐渐冷却，总氮含量增加。氮的相对富集与有机物的分解和堆肥质量的减少有关(Yang et al.，2020)。堆肥过程结束时，四个处理组的总氮含量分别为2.81％、2.81％、2.76％和2.74％，差异无统计学意义(P>0.05)。但从图3中a可以观察到，与对照组相比，添加微生物制剂后，组内总氮含量开始增加的时间更早(第3天)。这种现象可能与温度水平有关。
[0147] 在整个堆肥过程中，NH3(NO3‑‑N)的排放是氮损失的主要途径，而高温阶段是NH3排+放的主要阶段(Nigussie等人，2016；Sun等人，2020)。每组堆肥样品中铵态氮(NH4‑N)含量的变化如图3中b所示。铵态氮在增温阶段迅速增加，在第4天和第7天达到峰值，峰值分别为
843.5mg/kg、736.3mg/kg、786.2mg/kg和723.8mg/kg。这表明在堆肥阶段有机氮化合物有很强的矿化和氨化作用。值得注意的是，在高温期的第7天，CK处理组的铵态氮含量显著高于+
T1、T2和T3处理组(P<0.05)。这可能是由于微生物接种增强了堆肥中的氨氧化过程，将NH4‑‑
N转化为NO2‑N，这有利于随后的硝化作用(An等人，2020；钟等人，2020)。微生物接种剂和在+
堆肥中添加强氧化剂具有非常相似的效果。它们降低了处理中的pH值和最大NH4‑N含量，最+
大限度地减少了氮损失，并增强了NH4‑N的氧化作用(Mei等人，2022)。在用微生物接种物处理的堆肥中，总氮含量从第4天到第7天开始上升(图3中a)。随后，由于微生物的嗜热活性降+
低和含氮有机物的降解，NH4‑N含量逐渐降低(赵等人，2020)。
[0148] 先前的研究表明，高温阶段不利于硝化，硝酸盐氮的积累主要发生在冷却阶段(Li et al.，2019；袁等人，2018)。硝酸盐氮含量的变化如图3c所示，在堆肥的前10天，含量没有显著变化。随着堆肥堆逐渐冷却，所有组的硝酸盐氮水平都开始增加。堆肥结束时，各组硝酸盐氮含量分别为1446.0mg/kg、1925.9mg/kg、1723.6mg/kg和1998.8mg/kg，T1和T3处理组的硝酸盐氮浓度明显高于对照组(P<0.05)。这与Xu等人的研究结果一致。(Xu等人，2022)，其中微生物接种增加了堆肥中的硝酸盐氮含量。在好氧条件下，微生物接种剂可以加速NH4+ ‑ ‑ ‑‑N向NO2‑N的转化，为NO2‑N向NO3 ‑N的进一步硝化创造有利条件(Rintala等人，2008；钟等人，2020)。
[0149] 实验例4
[0150] 进行堆肥成熟度分析。
[0151] 使用连续流动稳定同位素质谱仪(Isoprime 100，德国)检测实施例2‑4以及对比例1中堆肥总有机碳和总氮含量。将这些测量结果进行比较，得出C/N比。堆肥腐殖质的测定：焦磷酸钠‑氢氧化钠萃取‑钾‑双复合物酸氧化容量法(NY/T 1867‑2010)。
[0152] 按照如下方法进行发芽指数实验：
[0153] 将堆肥样本按1：9的比例添加去离子水，于180r/min、25℃浸提24h，即得到浸出液，然后通过离心获得上清液，用于发芽指数测量。将5毫升上清液放入衬有两张滤纸的培养皿中。对照组使用去离子水。
[0154] 将10个胡萝卜种子均匀分布在滤纸上，并在25℃下孵育72小时(Khan等人，2014)。使用以下公式计算发芽指数(GI)：
[0155]
[0156] C/N是堆肥成熟度的重要指标。如图4中a所示，堆肥堆中的C/N比最初在堆肥早期阶段增加，然后在高温阶段降低。C/N由有机物降解速率和氮转化率决定(Xu et al.，2022)。堆肥过程中C/N的最初增加是由于氨的过度释放，导致氮的损失超过了有机物的降解速度。随后，硝化作用减少了氮的损失，随着有机物的降解，C/N逐渐减少。堆肥结束时，各组的C/N比值均低于14，差异无统计学意义(P>0.05)，均满足小于20的理想C/N值(He et al.，2022)。
[0157] 发芽指数(GI)被广泛用于评估堆肥的成熟度和植物毒性。当堆肥的GI超过70％时，堆肥被认为是成熟的，GI超过80％表示无毒且完全分解(Kong等人，2023；李等人，2022)。在每个处理组中，随着堆肥的进行，发芽指数(GI)继续增加，如图4中b所示。GI指数在第4天和第7天略有下降，这可能与氨水平升高和pH值升高引起的不利条件有关(Kong等人，2023；Wang等人，2022)。堆肥结束时，各组的GI值分别达到87.8％、92.6％、92.7％和
101.1％。这些结果表明，微生物接种可以提高堆肥的GI值，有效降低最终产品的植物毒性。
[0158] 腐殖质的主要成分是腐殖酸和黄腐酸，它们的变化反映了堆肥中的腐殖化程度(赵etal.，2022)。腐殖质含量呈下降趋势，从368.0mg/kg降至379.7mg/kg，从318.0mg/kg降至344.2mg/kg(如图4中c所示)。腐殖质的积累和降解是两个独立的事件。在堆肥的早期阶段，腐殖质含量略有增加，随后在堆肥的高温和冷却阶段迅速下降。微生物接种剂显著增加了腐殖质含量的变异性。这表明，添加微生物接种剂同时提高了与腐殖质降解相关的微生物的数量和活性(赵等人，2022)。到成熟阶段，使用微生物接种剂(T2)的组表现出稳定的腐殖质含量，实现了积累和降解之间的平衡。最后，T2组的腐殖质含量最高，其次是T3、T1和对照组(CK)。总体而言，微生物接种物的添加促进了腐殖质的积累，这与邱等人的研究结果一致。(邱等人，2021)。堆肥中腐殖质含量和腐殖化水平的增加对土壤改良和农业可持续性具有重要意义。
[0159] 实验例5
[0160] 本实验例研究堆肥过程中细菌和真菌的群落组成。
[0161] 16S rDNA扩增子测序使用引物341F(5’‑CTTAYGGGRBGCASCAG‑3’)和806R(5’‑GACTACHVGGGTATCTAATCC‑3’)对V34区域进行PCR扩增。ITS rDNA扩增子测序利用引物ITS3‑024F(5'‑GCATCGATGAAGACGCAGC‑3')和ITS4‑2409R(5'‑TCCTCCGTTATTGATATGC‑3')对ITS2区域进行PCR扩增。根据扩增区域的特征构建短片段文库，并在Illumina NovaSeq PE250平台(中国北京)上进行配对末端测序。随后，DADA2用于基于高质量数据的去噪，并滤除丰度低于5的序列，得到最终的Amplicon序列变体(ASV)(Lin等人，2022)。QIME2中的分类sklearn算法用于每个ASV的物种注释。使用Tukey和Kruskal‑Wallis秩和检验分析阿尔法多样性指数，然后使用Unifrac距离计算贝塔多样性，所有多样性分析均使用R软件(4.0.3版)进行。
[0162] 统计方法如下：
[0163] 所有参数测量三次，数据使用SPSS26.0进行单因素方差分析(ANOVA)(p<0.05)。结果以平均值±标准误差(M±SE)表示，并使用GraphPad Prism 8.0生成图形表示。
[0164] Alpha多样性指数以箱形图形式展示，同时，通过Tukey和Kruskal‑Wallis秩和检验分析组间物种多样性差。首先对所有样本的物种注释结果和特征序列的丰度信息，进一步计算Unifrac距离(weighted unifrac)，构建UPGMA样本聚类树。
[0165] 阿尔法多样性指数以箱形图形式展示，同时，通过Tukey和Kruskal Wallis秩和检验分析组间物种多样性差。首先对所有样本的物种注释结果和特征序列的丰度信息，进一步计算Unifrac距离(加权unifrac)构建UPGMA样本聚类树。
[0166] 利用R软件(2.2.15版本)中的WGCNA、stats、ggplot3和vegan软件包绘制主坐标分析(PCoA)和NMDS(Non‑Metric Multi‑Dimensional Scaling)图，认知堆肥过程中的细菌多样性。采用CANOCO5.0软件进行冗余分析(RDA)。利用R(v2.15.3)软件实现网络、热图和方差偏分析(VPA)可视化，分析环境因素与细菌群落结构的相关性。
[0167] 利用R软件(2.2.15版本)中的WGCNA、stats、ggplot3和vegan软件包绘制主坐标分析(PCoA)和NMDS(非度量多维标度)图，认知堆肥过程中的细菌多样性。采用CANOCO5.0软件进行冗余分析(RDA)利用R(v2.15.3)软件实现网络、热图和方差偏分析(VPA)可视化，分析环境因素与细菌群落结构的相关性。
[0168] 16S rRNA和ITS基因扩增子测序是了解生境中微生物群落组成和丰度的有效方法。在分析中，Alpha‑diversity主要关注局域均匀生境下的物种数目,选取Observed‑species，Chao1，Shannon，Simpson，Goodcoverage几种不同的Alpha多样性指数，以表征样品中物种分布的多样性和均匀度，并直观展示测序深度和数据量情况(Li et al.,2013)。图5(上图)显示了四个时期样本的Chao1指数，16S rRNA详细的数值信息见表2。测序结果显示，堆肥嗜热期(第五天：B1‑B4)菌群丰度下降，菌剂接种提升了该时期的群落丰富度，其中以T1处理组最为显著(P<0.05)。可能是因为接种外源性微生物会导致内源性微生物丰度的增加(Duan et al.,2019)。
[0169] 16S rRNA和其基因扩增子测序是了解生境中微生物群落组成和丰度的有效方法。在分析中，Alpha多样性主要关注局域均匀生境下的物种数目,选取观察物种，Chao1，Shannon，Simpson，Goodcoverage几种不同的阿尔法多样性指数，以表征样品中物种分布的多样性和均匀度，并直观展示测序深度和数据量情况(李等，2013)图5上图显示了四个时期样本的Chao1指数，16S rRNA详细的数值信息见表2。测序结果显示，堆肥嗜热期(第五天：
B1‑B4)菌群风度下降，菌剂接种提升了该时期的群落丰富度，其中以T1处理组最为显著(P＜0.05)可能是因为接种外源性微生物会导致内源性微生物丰度的增加(段等，2019)。
[0170] 表2.16S rRNA详细的数值信息
[0171]
[0172]
[0173] 在堆肥细菌门水平相对丰度中(图5下图)，最常检测到的优势菌门分别是厚壁菌门(7.30‑53.92％)、拟杆菌门(10.98‑47.6％)、变形菌门(16.13‑35.63％)和放线菌门(1.76‑27.16％)，这与之前报道的结果相似(Liu et al.,2022a)。同时有报道称，上述四类门水平上最丰富的细菌在嗜热阶段加快了有机质的降解和腐殖质形成，改善了堆肥过程(Wei et al.,2018)。厚壁菌门是堆肥热发酵阶段最丰富的菌门，其次是变形菌门，两类菌是参与氮转化的主要细菌门(Zhang et al.,2018)。其中，变形菌门中Nitrospirae物种和‑氨氧化菌有助于提升NO3‑N含量(Zhong et al.,2018)。一些拟杆菌属在堆肥成熟和有机质降解中发挥重要作(Wang et al.,2018)。weighted Unifrac Distance结果显示(图5下图)，堆肥初期和嗜热期样品菌落组成相较为相近，而厚壁菌门的相对丰度按照处理顺序降低：CK>T1>T3>T2。与对照组相比，菌剂接种降低了嗜热期厚壁菌门的丰度(5.30‑10.02％)。
可能是因为菌剂中四中芽孢杆菌接种抑制了其他芽孢杆菌的生长。
[0174] 与对照组相比，接种MT‑AOB‑2‑4(T4)显著提高了堆肥过程中厚壁菌门的丰度(5.30‑10.02％)(P<0.05)。这可能是因为两种接种的细菌属于芽孢杆菌，并可能促进其他芽孢杆菌的生长(Hu等人，2019)。此外，与嗜热期相比，成熟期厚壁菌门的丰度显着降低，而其他几个细菌门的丰度在该阶段显着增加(Hu et al.，2019)。这可以通过以下概念来解释：随着温度的降低，其他细菌的活性逐渐增加，因此堆肥由于多种微生物的活动而达到成熟(Xiao等人，2011)。
[0175] 与对照组相比，接种MT‑AOB‑2‑4(T4)显著提高了堆肥过程中厚壁菌门的丰度(5.30‑10.02％)(P<0.05)这可能是因为两种接种的细菌属于芽孢杆菌，并可能促进其他芽孢杆菌的生长(胡等人，2019)此外，与嗜热期相比，成熟期厚壁菌门的丰度显着降低，而其他几个细菌门的丰度在该阶段显着增加(胡等，2019)这可以通过以下概念来解释：随着温度的降低，其他细菌的活性逐渐增加，因此堆肥由于多种微生物的活动而达到成熟(肖等人，2011)。
[0176] 综上，本发明通过在乌苏里貉粪污堆肥中接种高温分离的解硫铵素芽孢杆菌(CFMM007)、暹罗芽孢杆菌(CFMM011)、以及实验室保藏的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和购买的酵母菌五种菌的不同比例的组合(2％，v/w)研究了其对堆肥中碳氮有机质的转化、堆肥成熟和微生物群落的影响。在堆肥30天堆肥期间，与对照相比，接种菌剂显著加快升温速+率、延长了高温期，降低嗜热期pH值，加速了堆肥腐熟，降低了嗜热期NH4 ‑N水平(6.8％～‑
14.2％)提高了NO3‑N含量(19.2％～38.2％)提高了嗜热期与腐熟期微生物群落丰度。此外，接种实施例4的复合菌剂T3组在加速腐熟、堆肥温度峰值维持时间、提高发芽指数、腐殖‑
质含量和NO3‑N含量上效果最好。因此，利用T3菌剂比例能更好地提高牛粪堆肥中微生物群落丰度，提高堆肥效率。
[0177] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
