技术领域
[0001] 本发明涉及嗜酸乳杆菌，具体运用一株嗜酸乳杆菌在高效富硒中的应用。
相关背景技术
[0002] 硒最初被认为是一种有毒元素，随着对硒参与的各种生理生化反应的不断研究，发现硒是机体必不可少的膳食补充剂，被联合国FAO/IAEA/WHO共同确认为人体必需的重要微量元素之一，它与维持机体正常生理功能及对抗多种疾病的产生有着紧密联系。多项数据显示，在安全阈值范围内，硒不仅具有抗氧化、抗衰老、保护和修复细胞的活性等多重功能，还可以改善机体的免疫系统和解毒功能，而在安全阈值外，缺硒可导致克山病和大骨节病，过量摄入硒则可能导致硒中毒，对机体造成不可估量的损害。
[0003] 研究表明，无机硒经生物转化后形成毒性更小、更有利于动植物吸收及安全利用的有机硒化物，其在激活生物免疫反应的方面显著优于无机硒化物，这对于我国推广并改善硒缺乏的现状有极大意义与研究前景。硒的生物转化也逐渐成为人们关注的焦点。益生菌是富硒微生物转化研究领域的主要对象，包括富硒酵母、富硒乳酸菌和富硒双歧杆菌。富硒益生菌已通过实验证实具有多种益处，如抗氧化、抗致病、抗诱变、抗癌和抗炎活性。
[0004] 乳酸菌普遍存在于人体与动物肠道中，其数量超过百万亿个，具有多种保健功效，常作为益生菌添加于食品中以改善人体健康状况。益生菌大多数是乳酸菌中的乳杆菌和双歧杆菌。应用于食物中的富硒益生菌具有多种保健作用：维持微生态平衡和肠道机能，缓解乳糖不耐症，增强机体免疫力，改善肝功能，降低血清胆固醇，增强免疫功能以及抗肿瘤等作用。
具体实施方式
[0023] 下面结合具体实施例及附图对本发明进行进一步说明。
[0024] 实施例1：明确一株嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为优势富硒益生菌[0025] (1)菌种复活：取4℃保存的嗜酸乳杆菌冻干管，用75％酒精棉擦拭冻干管表面进行消毒，用无菌吸管吸取0.5ml左右CM0006液体培养基于冻干管中将冻干粉全部溶解，将溶解后的菌悬液转移至盛有4‑5ml CM0006液体培养基的试管中混匀，残留在吸管中的1‑2滴菌悬液转接至CM0006固体培养基上，37℃静置培养48h。
[0026] (2)菌种活化：将所得的菌液和平板转接至2‑3代恢复活力。再将固体培养基平板上的嗜酸乳杆菌接种至pH 6.8的CM0006液体培养基中，37℃摇床160rpm振荡培养12h，得到种子液。
[0027] (3)配制亚硒酸钠储备液：首先称取2.19g亚硒酸钠溶于100mL去离子水中，配制10g·L‑1的含硒储备液。
[0028] (4)转化验证：将种子液以3％(V/V)的接种量接种至装有CM0006液体培养基的厌氧瓶中，37℃摇床160rpm振荡培养12h，之后加入无菌处理的亚硒酸钠储备液(用无菌注射器将亚硒酸钠储备液经过无菌0.22μm的尼龙膜处理)，37℃摇床160rpm振荡培养24h。由于亚硒酸钠溶液为无色而经生物转化后的纳米硒为红色，因此可以观察菌悬液培养前后颜色由无色转变为红色。如图1所示。
[0029] 实施例2：嗜酸乳杆菌转化亚硒酸钠为纳米硒的富硒培养
[0030] (1)菌种复活：取4℃保存的嗜酸乳杆菌冻干管，用75％酒精棉擦拭冻干管表面进行消毒，用无菌吸管吸取0.5ml左右CM0006液体培养基于冻干管中将冻干粉全部溶解，将溶解后的菌悬液转移至盛有4‑5ml CM0006液体培养基的试管中混匀，残留在吸管中的1‑2滴菌悬液转接至CM0006固体培养基上，37℃静置培养48h。
[0031] (2)菌种活化：.将所得的菌液和平板转接至2‑3代恢复活力。再将固体培养基平板上的嗜酸乳杆菌接种至pH 6.8的CM0006液体培养基中，37℃摇床160rpm振荡培养12h，得到种子液。
[0032] (3)配制亚硒酸钠储备液：首先称取2.19g亚硒酸钠溶于100mL去离子水中，配制10g·L‑1的含硒储备液。
[0033] (4)制备富硒嗜酸乳杆菌：将种子液以3％(V/V)的接种量接种至装有CM0006液体培养基的厌氧瓶中，30℃摇床160rpm振荡培养12h，之后加入无菌处理的亚硒酸钠储备液(用无菌注射器将亚硒酸钠储备液经过无菌0.22μm的尼龙膜处理)，30℃摇床160rpm振荡培养24h。由于亚硒酸钠溶液为无色而经生物转化后的纳米硒为红色，因此可以观察菌悬液培养前后颜色由无色转变为红色。
[0034] (5)嗜酸乳杆菌对亚硒酸钠的转化率
[0035] 绘制硒标准曲线：取硒1000mg·L‑1的标准溶液1mL用10％的稀盐酸定容至100mL，‑1作为10mg·L 硒标准中间液，硒标准中间液用10％的稀盐酸进一步稀释至1、2、5、10、20μ‑1
g·L 不同浓度梯度。用氢化法原子荧光光谱仪进行检测，仪器的还原液为15％的硼氢化钾水溶液。以浓度梯度为横坐标，荧光强度作为纵坐标绘制标准曲线，如图2所示。
[0036] 对经过生物转化后的红色菌悬液进行离心，取上清液稀释到一定倍数经原子荧光光谱仪检测其中未转化硒的浓度Ct，仪器的还原液为15％的硼氢化钾水溶液。
[0037]
[0038] 上式中：
[0039] C0——嗜酸乳杆菌转化亚硒酸钠的初始硒浓度
[0040] Ct——经过t时间后上清液中未转化硒的浓度
[0041] 实施例3：嗜酸乳杆菌在CM0006液体培养基初始pH不同的条件下对亚硒酸钠的生物转化情况
[0042] 将嗜酸乳杆菌接种至CM0006液体培养基培养12h，作为种子液，嗜酸乳杆菌在CM0006液体培养基初始pH不同的条件下对亚硒酸钠的生物转化情况。将CM0006培养基分成‑1 ‑17组，每组3个平行，在使用前用0.1mol·L HCl和0.1mol·L NaOH溶液校正CM0006培养基初始pH值，使7组CM0006培养基初始pH值分别为3、4、5、6、7、8、9。将3％的种子液接种至不同初始pH值的CM0006液体培养基中，置于温度为37℃，转速为160rpm的培养箱中连续发酵‑1
12h，随后加入无菌亚硒酸钠储备液使菌悬液中硒浓度为100mg·L ，并继续发酵24小时，得到终点嗜酸乳杆菌菌液。对终点菌液进行离心分离上清液，并通过原子荧光分析仪检测上‑1
清液中未转化硒的浓度，进而确定嗜酸乳杆菌在不同pH情况下对硒浓度为100mg·L 的亚硒酸钠的生物转化情况(表1和图3)。
[0043] 表1嗜酸乳杆菌在不同初始pH的CM0006培养基条件下对Na2SeO3转化率[0044]
[0045] 如图3所示，在CM0006初始培养基pH为3～4时，亚硒酸钠经过嗜酸乳杆菌24h的转化上清液中未转化硒的浓度减小，即亚硒酸钠的生物转化效果越好。当pH为4～7时，上清液中未转化硒的浓度随pH的上升而增大，到pH为7时，上清液中未转化硒的浓度又降低。因此在CM0006初始pH为4时嗜酸乳杆菌对亚硒酸钠的转化率最高，为59.81％。
[0046] 实施例4：嗜酸乳杆菌在不同温度条件下对亚硒酸钠生物转化情况
[0047] 将嗜酸乳杆菌接种于CM0006液体培养基培养12h，作为种子液，研究嗜酸乳杆菌在不同温度条件下对亚硒酸钠转化情况。将CM0006培养基分成5组，每组3个平行，将种子液以3％的接种量加入各组CM0006液体培养基中，各组分别在20、25、30、35、40℃培养箱中‑1
160rpm振荡培养12h，随后加入无菌亚硒酸钠储备液使菌悬液中硒浓度为100mg·L ，使其继续生长24小时，得到终点嗜酸乳杆菌菌液。取终点菌液进行离心分离上清液，并通过原子荧光分析仪检测上清液中未转化硒的浓度，进而确定嗜酸乳杆菌在不同培养温度条件下对亚硒酸钠的生物转化情况(参见表2和图4)。
[0048] 表2嗜酸乳杆菌在不同温度培养条件下对Na2SeO3转化率
[0049]
[0050] 如图4所示，嗜酸乳杆菌在不同温度培养条件下转化Na2SeO324h，在温度为20～30℃时，亚硒酸钠经过嗜酸乳杆菌24h的转化后上清液中未转化硒的浓度随温度增大而减小，当温度为30～40℃时，上清液中未转化硒的浓度随温度增大而增大，30℃上清液中未转化‑1硒的浓度最小，为28.91mg·L 。因此在温度为30℃时嗜酸乳杆菌对亚硒酸钠的转化率最高，为74.51％。
[0051] 综上，选择在30℃培养箱160rpm振荡培养12h后加入亚硒酸钠，继续在该条件下培养24h使得嗜酸乳杆菌对亚硒酸钠转化率为74.51％。以上对本发明的实例进行了详细说明，但所述内容不认为限定本发明的实施范围，对于本领域技术人员凡在本发明基础上依托本发明精神的进行修改和改进，均属于本发明的保护范围。
