[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组需钠弧菌及其构建方法和应用。

[0002] 硒作为一种类金属，因其半导体和光电特性，被广泛应用于电子、化妆品、涂料和包装等。此外，在生物医学中，硒作为人体必须的微量元素，被广泛用作食品补充剂；并且，纳米硒具有抗氧化特性，在抗肿瘤和癌症治疗等领域具有重要的应用价值。

[0003] 纳米硒可以通过多种方式获取，例如激光烧蚀、紫外线辐射、水热技术、沉淀催化还原、酸分解等。然而，这些物化方式涉及极端pH和有毒化合物的使用，使得这些方式获取的纳米硒应用于医疗领域存在安全隐患。此外，通过物理化学方法生产的纳米硒需要在合成过程中添加稳定剂，来确保较小的粒径保证其活性，这导致合成的纳米硒对人体存在健康风险，应用场景有限。相比而言，基于生物法合成的纳米硒不仅条件简单温和，而且生物相容性高、生物毒性更低，更适合作为纳米硒的工业规模合成方式。

[0004] 生物法合成的纳米硒主要通过硒氧阴离子还原作用获取，例如亚硒酸盐、硒酸盐等，但是硒氧阴离子对细胞具有毒性，会影响菌株的细胞活力，因此寻找具有强耐受特性的菌株来适应生物纳米硒的合成是非常有必要的。

[0037] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

[0038] 本申请中：

[0039] LBv2培养基为含有204mM NaC l、23.14mM MgC l 2和4.2mM KC l的LB培养基。

[0040] LB培养基成分为：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaC l。

[0041] M9矿物盐培养基成分为：葡萄糖10g/L，酵母膏2g/L，Na2HPO46g/L，NaC l 30g/L，NH4C l 1g/L，KH2PO43.5g/L，MgSO4·7H2O 246.5mg/L，CaC l 2·2H2O14.7mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L。

[0042] 废弃甘油的主要成分是甘油、甲醇和盐，由安徽天一环保科技有限公司获取，其中甘油和甲醇的浓度分别为1056g/L和162g/L。

[0043] 实施例1

[0044] 需钠弧菌在合成纳米硒中的应用，包括以下步骤：

[0045] 1)需钠弧菌培养

[0046] 将菌需钠弧菌ATCC 14048冻存管从‑80℃培养箱中取出，然后取40μL需钠弧菌菌液放入4mL LBv2培养基中，并于37℃，200rpm环境中培养12h，得到活化的需钠弧菌菌液。

[0047] 2)亚硒酸钠耐受性验证

[0048] 利用亚硒酸钠和LBv2培养基分别制备亚硒酸钠浓度为0、1、5、10、50、100mM梯度的含硒LBv2培养基，之后放置在厌氧血清瓶中，曝气15min后，经过121℃、20min高压蒸汽灭菌后，得到厌氧含硒LBv2培养基，利用注射器将活化的需钠弧菌菌液加入含硒LBv2培养基中，使初始OD600＝0.1，在30℃，200rpm摇床中培养，定时取200μL用于测定OD600，绘制菌株生长曲线，如图1所示。

[0049] 图1的生长曲线显示，加1、5、10mM亚硒酸钠时，菌株生长和对照组相比没有明显区别，外加50、100mM亚硒酸钠时，菌株的生长略受影响总体而言，在合适的亚硒酸钠浓度范围内，需钠弧菌具有较强的亚硒酸盐耐受性，可以作为生物纳米硒生产的底盘菌株。

[0050] 综合考虑细菌生长和纳米硒的生产周期，选择亚硒酸钠浓度为10mM培养基进行生物纳米硒合成实验。

[0051] 3)纳米硒合成实验

[0052] 利用M9矿物盐培养基和亚硒酸钠配制亚硒酸钠浓度为10mM的含硒发酵培养基，将活化的需钠弧菌菌液加入50mL含硒发酵培养基中，使初始OD600＝1.0。在30℃的培养箱厌氧静置培养，定时取样，检测亚硒酸钠含量，检测结果图2所示。

[0053] 图2显示发酵过程中亚硒酸盐浓度，在厌氧发酵10h后，可以还原超过50％的亚硒酸钠；发酵58h后，亚硒酸钠的含量不足10％。

[0054] 综上，需钠弧菌可以实现亚硒酸盐的还原。

[0055] 4)纳米硒的提取和纯化：将2mL发酵后培养液于EP管中，离心去上清，收集菌体，将菌体加入200uL去离子水中，在‑80℃和37℃两种温度下反复冻融3次，设置超声细胞破碎仪在35％功率下，以2s开，2s关为周期运行10min，进一步破碎细胞，使用1.5M Tr i s‑HCl(pH＝8.3)包含1％SDS溶液清洗菌体2次，每次清洗在15000g，10min离心，沉积物加入正辛醇，剧烈震荡后，在4℃静置1h，吸取底层水相，分别依次使用氯仿、无水乙醇、75wt％乙醇溶液和水在15000g，10min离心清洗，最后重悬于100μL超纯水中，得到纳米硒溶液；将纳米硒溶液滴在硅片上，待水分彻底挥发后，使用扫描电镜拍摄生物纳米硒的表面形貌，如图3所示。

[0056] 实现亚硒酸钠还原后，将发酵后的菌株进行破碎提取纳米硒，并且通过扫描电镜观察纳米硒形貌、粒径等物理特征。扫描电镜显示结果如图3显示，可以明显看到生物纳米硒颗粒的生成。

[0057] 其中，发酵后培养液中亚硒酸钠含量检测方法如下：

[0058] 使用M9矿物盐培养基和亚硒酸钠分别配制亚硒酸钠浓度为0、0.5、1、2、3、4mM的标准样品溶液，将标准样品溶液和待测样品用去离子水稀释至原体积的10倍，在1.5mL的EP管中加入80μL浓度为0.5M盐酸溶液，40μL浓度为0.1M的EDTA‑2Na溶液，20μL浓度为0.1M的NaF溶液，20μL浓度为0.1M草酸钠溶液，250μL标样溶液或待测样品，100μL浓度为0.1％的2，3‑二氨基萘无水乙醇溶液(避光加入，现用现配)。在40℃水浴40min后，吸取100μL于96孔板中，置于酶标仪中检测377nm波长下的吸光度。之后根据吸光度测算体系亚硒酸钠含量。

[0059] 实施例2

[0060] 重组需钠弧菌，所述重组需钠弧菌为过表达需钠弧菌MtrC、MtrA、MtrB、PdsA、CymA蛋白的工程菌株，MtrC的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，MtrA的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，MtrB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，PdsA的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，CymA的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

[0061] 重组需钠弧菌的构建方法，包括以下步骤：

[0062] 1)菌株培养

[0063] 将大肠杆菌Turbo冻存管和需钠弧菌ATCC 14048冻存管从‑80℃培养箱中取出，化冻后取40uL大肠杆菌菌液和40uL需钠弧菌菌液分别放入4mL LB培养基和4mL LBv2培养基中，并于37℃，200rpm环境中培养12h，得到活化后的大肠杆菌菌液以及需钠弧菌菌液,大肠杆菌在LB培养基中培养，需钠弧菌在LBv2培养基中；

[0064] 2)质粒构建

[0065] 合成需钠弧菌胞外电子传递相关基因簇(编码MtrC、MtrA、MtrB、PdsA、CymA蛋白的基因序列)，IPTG诱导型启动子基因序列和p15A质粒骨架基因序列(氯霉素抗性)，将以上基因片段通过G i bson连接，然后将连接产物转入大肠杆菌Turbo中，利用氯霉素筛选阳性克隆，最后将阳性克隆中的质粒进行提取，获取目标质粒p15A‑EET，如图4所示，IPTG诱导型启动子基因序列如SEQ ID NO:6所示，p15A质粒骨架基因序列：如SEQ ID NO:7所示。

[0066] 3)构建需钠弧菌工程菌株

[0067] 将活化的需钠弧菌菌液加入LBv2培养基中，培养至OD600＝0.4，离心去上清，收集细菌并利用冷的1M山梨醇溶液清洗三次，之后加入1M山梨醇溶液获取感受态，分装为100μL/管，所有操作均在4℃环境进行，于‑80℃储存，得到需钠弧菌感受态细胞；

[0068] 将100μL需钠弧菌感受态细胞从‑80℃冰箱中取出并于冰中融化，将1μg p15A‑EET质粒与需钠弧菌感受态细胞混合转移到1mm无菌电穿孔比色皿中，2.5kV电转5ms，得到混合液，然后立即将混合物加入1mL LBv2培养基中，并在37℃下孵育1h，然后在含有10μg/mL氯霉素的LBv2琼脂平板上选择细胞，获取阳性克隆V.NA‑p15A‑EET菌株，即重组需钠弧菌。

[0069] 对比例1

[0070] 重组需钠弧菌的构建方法，与实施例2相比，不同之处在p15A‑EET质粒替换为p15A空质粒，具体步骤如下：

[0071] 将需钠弧菌感受态细胞从‑80℃冰箱中取出并于冰中融化，将1μg p15A质粒与100μL需钠弧菌感受态细胞混合转移到1mm无菌电穿孔比色皿中，2.5kV电转5ms，得到混合液，然后立即将混合物加入1mL LBv2培养基中，并在37℃下孵育1h，然后在含有10μg/mL氯霉素的LBv2琼脂平板上选择细胞，获取阳性克隆菌株V.NA‑p15A菌株，即重组需钠弧菌。

[0072] 实施例3

[0073] 测试废弃甘油对需钠弧菌生长的影响：

[0074] 在LBv2培养基中添加废弃甘油，分别制备含废弃甘油浓度为0、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L的复合培养基。之后放置在厌氧血清瓶中，曝气15min后，经过121℃、20min高压蒸汽灭菌后，得到厌氧复合培养基。利用注射器将活化的需钠弧菌菌液加入厌氧复合培养基中，使初始OD600＝0.1，在30℃，200rpm摇床中培养。定时取200μL样品，利用酶标仪测定培养体系中的OD600，绘制菌株生长曲线，曲线如图5所示。由图5可以看出，需钠弧菌在添加5‑30g/L粗甘油后生长优于零添加组，因此，需钠弧菌具有良好的环境适应性，粗甘油中的复杂成分并不影响其正常生长。

[0075] 实施例4

[0076] 重组需钠弧菌的应用，即将实施例2获得的V.NA‑p15A‑EET菌株注入M9矿物盐培养基中进行亚硒酸钠的还原实验，具体步骤为：

[0077] 利用M9矿物盐培养基[记为M9(G l u)]和亚硒酸钠配制亚硒酸钠浓度为10mM的含硒培养基，将V.NA‑p15A‑EET菌株加入50mL含硒培养基中，使初始OD600＝1.0，再加入5μL浓度为1M的IPTG水溶液，在30℃的培养箱静置培养，得到发酵后培养液，定时取样，检测亚硒酸钠含量。

[0078] 实施例5

[0079] 重组需钠弧菌的应用，与实施例4相比于，将实施例3中M9矿物盐培养基中的10g/L葡萄糖更换为10g/L甘油，作为新的矿物盐培养基,记为M9(G l y),其余原料及过程、参数同实施例4。

[0080] 实施例6

[0081] 重组需钠弧菌的应用，与实施例5相比于，将M9(G l y)矿物盐培养基中的10g/L纯甘油更换为10g/L废弃甘油，作为新的矿物盐培养基，记为M9(Crude‑G l y)，其余原料及过程、参数同实施例5。

[0082] 对比例2

[0083] 重组需钠弧菌的应用，与实施例4相比于，将实施例4中“实施例2获得的V.NA‑p15A‑EET菌株”更换为“对比例1获得的V.NA‑p15A菌株”,其余原料及过程、参数同实施例4。

[0084] 实施例4、实施例5、实施例6、对比例2重组需钠弧菌的应用中亚硒酸钠含量测试结果如图6所示，由图6中可以看出，V.NA‑p15A‑EET菌株比V.NA‑p15A菌株纳米硒合成速率高，在含有10mM亚硒酸钠的矿物盐发酵培养中，甘油作为碳源和葡萄糖作为碳源亚硒酸钠的整体还原速率相当，但是在前9.5h，甘油组的亚硒酸钠平均还原速率为0.72mM/h，相比葡萄糖组0.65mM/h的平均还原速率提升了11％，利用废弃甘油替代纯甘油进行纳米硒发酵生产，在含有10mM亚硒酸钠的矿物盐发酵培养基中，V.NA‑p15A‑EET的生物纳米硒合成速率与纯甘油作为外加碳源无显著差异。

[0085] 综上，需钠弧菌可以高效利用粗甘油生产生物纳米硒，实现经济和环境效益双赢的目的。

[0086] 需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

[0087] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。