[0001] 本发明涉及一株产γ‑氨基丁酸短乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。

[0002] γ‑氨基丁酸，可简称为GABA，又称为氨酪酸，是一种广泛分布于自然界的非蛋白质氨基酸。在哺乳动物体内只存在于中枢神经系统，经谷氨酸脱羧酶催化由谷氨酸转化而成，具有抗疲劳、降血压、改善睡眠以及提高人体记忆力等生理功能，是一种兼具药理作用和保健功能的新型功能因子，现已被国家卫生部批准为“新资源食品”，可用于巧克力及其饮料、可可制品、糖果、饮料、膨化和焙烤食品中，但不可用于婴儿食品当中，在食品工业生产中有着良好的应用前景。GABA的制备方法主要包括植物富集法、化学合成法及微生物合成法三类，相比较而言，植物富集法产量低、成本高且难度大，化学合成法反应复杂且安全性差，而微生物发酵合成法成本低、安全性较好且条件温和，适用于大规模生产制备，是较为理想的合成方法。

[0003] 乳酸菌是可利用糖类发酵产生乳酸的一类细菌的统称，作为世界公认的食品安全级益生菌被广泛应用于泡菜和酸奶等发酵食品的生产制作，通常情况下泡菜汁中就存在着大量乳酸菌。近年来，乳酸菌的有益作用越来越受到人们的关注，大量试验结果表明，乳酸菌具有促进肠道消化、降血压血糖、提高人体免疫能力、降低人体胆固醇和抗肿瘤等功能，不同种属的乳酸菌往往具有不同的益生功能。目前，已有不少研究表明在酸奶、土壤、腌制酸菜等材料中发现了产GABA的乳酸菌株。如李远宏等从鲜奶中筛选出一株高产GABA的乳酸乳球菌，产量达到4.68 g/L；曾小群等从新疆酸马奶当中分离出一株产GABA量为1.6 g/L的戊糖乳杆菌；缪存影等从酸菜中筛选获得一株产γ‑氨基丁酸的菌株，静置发酵可得到13.45 g/L的GABA。

[0004] 直接利用微生物发酵生产GABA具有节约生产成本、缩短生产周期及降低环境污染等诸多优点。但是大部分微生物的胃肠耐受性差，不能在胃肠道中定植，一般不能直接作为食品或食品添加剂使用。

[0035] 下述实施例中涉及的培养基如下：

[0036] 种子培养基（MRS液体培养基）：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 10.0 g，酵母膏 5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰（MnSO4·H2O） 0.25 g，蒸馏水 1 000 mL。

[0037] 发酵培养基：蛋白胨 10.0 g，氯化钠0.01 g，酵母膏 5.0 g，L ‑谷氨酸40.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰（MnSO4·H2O） 0.25 g，蒸馏水 1 000 mL。

[0038] 实施例1 短乳杆菌的分离与筛选

[0039] 具体步骤如下：

[0040] 在陕南地区共采泡菜汁样品33份，进行菌株筛选分离。

[0041] 1) 样品中菌株的活化：取1 mL泡菜汁加入到5 mL MRS液体培养基中，振荡混匀，在37 ℃恒温培养箱中活化24 h。

[0042] 2) 菌株的分离纯化及形态鉴别：吸取200 μL活化后的菌液涂布于MRS固体培养基平板，于37 ℃下培养48 h。挑取生长状况较好的单菌落，划线法接种于MRS固体培养基平板，放入37 ℃恒温箱中培养48 h，记录各菌落形态特征。

[0043] 3) 乳酸菌的初步鉴定：经革兰氏染色和接触酶检测初步鉴定样品菌株是否为乳酸菌。用接种环挑取各菌株涂抹于滴有3%过氧化氢溶液的玻片上，有气泡产生为阳性，无气泡为阴性。接触酶检测呈阴性，革兰氏染色为阳性的菌株可初步鉴定为乳酸菌。

[0044] 4) 产酸菌株的筛选：产酸量较大菌株可水解固体培养基中添加的CaCO3，进而形成水解圈，因此可依据水解圈大小来判断菌株的产酸能力。将初筛得到的乳酸菌涂布于含CaCO3的MRS固体培养基平板上，筛取水解圈清晰可见且直径大于0.3 cm的产酸菌株进行划线分离。

[0045] 将分离得到的71株乳酸菌，分别接种于发酵培养基培养，于32℃培养48 h后，进行GABA产量的测定，选择高产γ‑氨基丁酸菌株。试验共获得8株产γ‑氨基丁酸乳酸菌，其中编号p62的菌株γ‑氨基丁酸产量最高，将其命名为NUFF 0112（图1）。

[0046] 实施例2 短乳杆菌的鉴定

[0047] （1）形态特征、培养特征及生理生化试验

[0048] 乳酸菌NUFF 0112在MRS固体培养基上，37℃恒温培养48 h后即可形成肉眼可见的明显菌落，乳酸菌NUFF 0112的菌落形态呈圆形，乳白色不透明，表面光滑，有凸起，边缘整齐，不产生色素，挑取能拉丝。

[0049] 挑取乳酸菌NUFF 0112的单菌落涂片后，进行革兰氏染色并在显微镜下观察其形态结构，革兰氏染色结果显示紫色，表明此菌株是革兰氏阳性菌，且菌株形态为短杆状。

[0050] 将实施例1分离得到的乳酸菌NUFF 0112菌株接种于MRS液体培养基，在37℃恒温培养箱中培养24 h，每隔2 h取样一次，在600 nm波长处测菌液OD值，如图2所示，乳酸菌8
NUFF 0112在2 h时开始进入对数生长期，培养10 h后到达稳定期，活菌数可达到10 CFU/mL。

[0051] （2）16S rDNA序列分析鉴定

[0052] 将实施例1筛选得到的乳酸菌NUFF 0112加入10μL无菌水溶解，备用。

[0053] 采用引物27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT进行PCR扩增，将PCR产物经电泳后送至上海生工生物技术公司进行测序。

[0054] 利用形态特征、生理生化特征等微生物学特性及经16S rDNA鉴定后，确定乳酸菌NUFF 0112为短乳杆菌（Lactobacillus brevis），于2018年11月21日保藏与中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.16763。

[0055] 实施例3 短乳杆菌NUFF 0112发酵生产GABA

[0056] （1）发酵温度对GABA产量的影响

[0057] 将实施例1筛选到的短乳杆菌NUFF 0112接种于MRS液体培养基，在37℃恒温活化2 h得到种子液，将种子液按体积比2%的接种量接种于初始pH值为6.0的发酵培养基中，分别置于30℃、32℃、34℃、36℃、38℃下静置发酵3天后，测定发酵液中GABA含量。

[0058] 结果如图3所示，发酵温度在32℃ 36℃范围内，GABA产量较高；当发酵温度为36℃~时，短乳杆菌NUFF 0112的GABA产量最高为1.393 mg/mL。

[0059] （2）发酵pH值对GABA产量的影响

[0060] 将实施例1筛选到的短乳杆菌NUFF 0112接种于MRS液体培养基，在37℃恒温活化2 h活化得到种子液，将种子液按体积比2%的接种量分别接种于初始pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的发酵培养基中，于36℃下，恒温静置发酵3天后，测定发酵液中GABA含量。

[0061] 结果如图4所示，当初始pH范围在6.0‑7.0间，GABA的产量较高；当初始pH值为6.5时，GABA产量最高为0.774 mg/mL。

[0062] （3）短乳杆菌NUFF 0112接种量对GABA产量的影响

[0063] 将实施例1筛选到的短乳杆菌NUFF 0112接种于MRS液体培养基，在37℃恒温活化2 h活化得到种子液，将种子液分别按体积比0.5%、1%、2%、3%、4%的接种量接种于发酵培养基（pH=6.0）中，36℃下，恒温静置发酵3天后，测定发酵液中GABA含量。

[0064] 结果如图5所示，当短乳杆菌NUFF 0112以体积比2% 4%的接种量接种时，GABA产量~较高；当短乳杆菌NUFF 0112以体积比3%接种量接种时，GABA产量最高为1.006 mg/mL。

[0065] （4）发酵培养基中L‑谷氨酸添加量对GABA产量的影响

[0066] 将实施例1筛选到的短乳杆菌NUFF 0112接种于MRS液体培养基，在37℃恒温活化2 h活化得到种子液，将种子液接种于含有2%、4%、6%、8%、10%（w/v）的L‑谷氨酸的发酵培养基（pH=6.0）中，36℃下，恒温静置发酵3天后，测定发酵液中GABA含量。

[0067] 结果如图6所示，L‑谷氨酸添加量对短乳杆菌NUFF 0112的GABA产量有一定影响，当其添加量为4%时，GABA产量最高为1.117 mg/mL。

[0068] （5）优化的发酵条件

[0069] 以步骤（1）（4）筛选得到的有利于GABA发酵生产的初始pH值、菌株接种量和发酵~3
温度为正交试验的3个考察因素，各因素水平见表2，以GABA产量为指标，选用L9（3）正交表进行正交试验。

[0070] 表1 L9（33）正交试验因素水平表

[0071]

[0072] 结果表明，发酵液pH值对GABA产量影响最显著，其次是菌株接种量，再次是发酵温度。短乳杆菌NUFF 0112的最佳发酵条件发酵pH为7.0，菌株接种量为2%，发酵温度为36℃，发酵培养基中L ‑谷氨酸添加量为4%时，在该发酵条件下GABA产量为4.046 mg/mL。

[0073] 实施例4 短乳杆菌NUFF 0112的性质测定

[0074] （1）短乳杆菌NUFF 0112的耐酸性

[0075] 将实施例1筛选到的短乳杆菌NUFF 0112接种于MRS液体培养基，在37℃恒温活化2 h活化得到种子液，将种子液分别接种于pH值为2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5和7.0的MRS液体培养基中，充分混匀，在36℃下培养20 h，于600 nm波长下测菌液OD值。

[0076] 结果如图7所示，短乳杆菌NUFF 0112在pH=2.0时的酸性环境下仍可生长，由此可判断该菌具有良好的耐酸性，该菌株可以在较为广泛的pH条件下生长，有在胃液和肠液存活并增殖的潜力。

[0077] （2）短乳杆菌NUFF 0112对NaCl的耐受能力

[0078] 将实施例1筛选到的短乳杆菌NUFF 0112接种于MRS液体培养基，在37℃恒温活化2 h活化得到种子液，将种子液分别接种于含有0%、2%、4%、6%、7%、8%、9%（w/v）的NaCl的MRS液体培养基中，充分混匀，在36℃下培养20 h，于600n m波长下测菌液OD值。

[0079] 结果如图8所示，短乳杆菌NUFF 0112对的NaCl的耐受能力较好，在NaCl浓度达到9%时仍能生长，当氯化钠浓度大于2%时，短乳杆菌NUFF 0112的生长能力大幅度下降。

[0080] （3）短乳杆菌NUFF 0112对葡萄糖的耐受能力

[0081] 葡萄糖不仅是菌株生长的能源物质也是其生长主要碳源，但环境的葡萄糖浓度过高又会对菌株生长造成抑制，同时，高渗透压会造成菌体细胞失水失活。

[0082] 将实施例1筛选到的短乳杆菌NUFF 0112接种于MRS液体培养基，在37℃恒温活化2 h活化得到种子液，将种子液分别接种于含有10%、20%、30%、40%、50%、60%（w/v）的葡萄糖的MRS液体培养基中，在36℃下培养20 h，于600 nm波长下测菌液在OD值。

[0083] 结果如图9所示，短乳杆菌NUFF 0112，短乳杆菌NUFF 0112对葡萄糖耐受能力良好，虽然在糖浓度大于30%时其生长能力大幅度下降，但当葡萄糖浓度达60%时短乳杆菌NUFF 0112仍能生长。

[0084] （4）短乳杆菌NUFF 0112的耐胆盐能力分析

[0085] 将实施例1筛选到的短乳杆菌NUFF 0112接种于MRS液体培养基，在37℃恒温活化2 h活化得到种子液，将种子液分别接种于含有或不含0.3%胆盐的MRS‑THIO(MRS含有0.2%的巯基乙酸钠)培养中，充分混合均匀，在36℃下培养。记录培养基吸光值到达0.3个单位时各组所需的时间，不加胆盐与加了胆盐两组的时间差即为短乳杆菌NUFF 0112在胆盐中生长的延迟时间(LT)，延迟时间的长短，反映了乳酸菌对胆盐的耐受能力。

[0086] 表2 胆盐对短乳杆菌NUFF 0112生长的作用

[0087]未加胆盐(h) 加胆盐（h） LT(h)
4.07±0.05 4.92±0.08 0.94±0.03

[0088] 评价菌株是否能够在肠道中生存与定殖的一个重要指标就是菌株对于胆盐的耐受能力。表1中所示，本实验中的短乳杆菌NUFF 0112对于胆盐的延迟时间为0.94 h，说明此菌株对胆盐具有很好的耐受性，有利于菌株在肠道内定植。

[0089] 实施例5 短乳杆菌NUFF 0112的应用

[0090] 短乳杆菌NUFF 0112可用于制备发酵乳，发酵乳的具体制备过程如下：

[0091] （1）将实施例1获得的短乳杆菌NUFF 0112活化的种子液以2%（v/v）的接种量接种到发酵培养基中，37℃培养36 h，6000 r/min离心20 min，收集菌泥；使用PBS对菌泥进行清10
洗后，用保护剂重悬至浓度为1×10 CFU/mL，得到悬浮液；将悬浮液在温度37℃下预培养60 min后冻干，得到冻干粉；

[0092] 保护剂的成分包含：100 g/L脱脂奶粉、30 mL/L甘油、100 g/L麦芽糊精、150 g/L海藻糖、10 g/L L‑谷氨酸钠；

[0093] （2）将冻干粉与商业干粉发酵剂保加利亚乳杆菌和商业干粉发酵剂嗜热链球菌按照质量比1:1:1的比例混合，得到发酵剂；

[0094] （3）将糖添加至鲜奶中至浓度为5%，得到混合液；将混合液在65℃、20 MPa的条件下进行均质后在95℃下保温杀菌5 min，得到发酵原料；将发酵原料降温至35℃后以0.03%（v/v）的接种量将步骤（2）制得的发酵剂接种至发酵原料中，于35℃下保温发酵16 h，得到发酵乳；将发酵乳于42℃的条件下凝乳后，在4℃下冷藏24 h进行后熟，得到发酵乳成品。

[0095] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。