[0001] 本发明属于天然药物化学技术领域，尤其是一种具有抗肿瘤活性的查尔酮类化合物及其制备方法和应用。

[0002] 癌症是威胁人类健康的最常见疾病之一，其发病率和死亡率仅次于心血管疾病，并有超过心脏病死亡率的趋势，给社会和家庭带来了沉重的经济和精神负担。传统的化学疗法和放射疗法已成为癌症治疗的主要方法，虽然在临床上有一定的疗效，但其副作用大、易产生耐药性。因此，高效、低毒、特异性强的抗肿瘤化合物的发掘具有重要意义，可为新型抗肿瘤药物的开发提供先导化合物，为肿瘤的治疗提供新途径。

[0003] 中草药含有结构多样的次生代谢产物，已成为寻找抗肿瘤先导化合物和候选药物的重要来源之一。四数九里香(Murraya tetramera)为芸香科九里香属植物，分布于广西西部(百色、德保等)、云南东南部(砚山、富宁、文山、西畴等地)，可用于治疗风湿病、感冒、咳嗽等症。据报道，其主要含有香豆素、黄酮、咔唑类生物碱等多种类型成分，并对乳腺癌细MCF7、肝癌细胞SMMC7721、肺癌细胞A549等具有一定的细胞毒性。因此，从四数九里香中发掘具有抗肿瘤活性的化合物对于新型抗肿瘤药的研发以及四数九里香药用价值的开发具有重要意义。

[0004] 通过检测，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

[0022] 下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

[0023] 本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。

[0024] 一种具有抗肿瘤活性的查尔酮类化合物，所述化合物为2’‑羟基‑3，4，5，3’，4’，6’‑六甲氧基查尔酮，其化学结构式为：

[0025]

[0026] 如上所述的具有抗肿瘤活性的查尔酮类化合物的制备方法，步骤如下：

[0027] ⑴甲醇提取物制备：取四数九里香干燥枝叶，粉碎，采用甲醇超声提取2‑3次，溶剂量为6‑8倍量，每次超声30‑60min，合并滤液，回收溶剂至浸膏，称重，即得甲醇提取物，出膏率为4％‑5％；

[0028] ⑵化合物分离：取四数九里香甲醇提取物，按甲醇提取物：硅胶的质量比为1:1将甲醇提取物、硅胶混合并干法拌样，以硅胶柱层析，依次经石油醚‑乙酸乙酯60：1、30：1、10：1、5：1、1：1，氯仿‑甲醇20：1、10：1、1：1梯度洗脱，并进行薄层层析检测，合并相同组分，得到组分90个馏分段；

[0029] 将馏分段59‑60过树脂柱，以乙醇‑水梯度洗脱，最后用HPLC制备液相分离纯化，采用C18色谱柱，以甲醇‑水为流动相进行梯度洗脱，即得具有抗肿瘤活性的查尔酮类化合物。

[0030] 较优地，所述步骤⑵中硅胶为160‑200目。

[0031] 较优地，所述步骤⑵中将馏分段59‑60过MCI GEL CHP20P快速树脂柱。

[0032] 如上所述的具有抗肿瘤活性的查尔酮类化合物在制备抗肿瘤药物方面中的应用。

[0033] 较优地，所述肿瘤细胞为小鼠黑色素瘤细胞B16、人乳腺癌细胞MDA‑MB‑231。

[0034] 具体地，相关制备及检测实施例如下：

[0035] 实施例1本发明查尔酮类化合物的制备

[0036] 1)甲醇提取物制备：取四数九里香干燥枝叶，粉碎，采用甲醇超声提取3次，溶剂量分别为8倍量、6倍量、6倍量，每次超声30min，合并滤液，回收溶剂至浸膏，称重，即得甲醇提取物，出膏率为4.4％。

[0037] 2)化合物分离：取四数九里香甲醇提取物110g，按1:1(浸膏量：硅胶量)干法拌样，以硅胶(160‑200目)柱层析，依次经石油醚‑乙酸乙酯60：1、30：1、10：1、5：1、1：1，氯仿‑甲醇20：1、10：1、1：1梯度洗脱，并进行薄层层析检测，合并相同组分，得到组分90个馏分段。将馏分段59‑60过MCI GEL CHP20P快速树脂柱，以乙醇‑水梯度洗脱，最后用HPLC制备液相分离纯化，采用C18色谱柱，以甲醇‑水为流动相进行梯度洗脱，最后得到本发明查尔酮类化合物(50mg)。

[0038] 实施例2本发明查尔酮类化合物的结构鉴定

[0039] 黄色针晶，易溶于三氯甲烷，紫外灯下(365nm)显黄绿色荧光。

[0040] 13C‑NMR(125MHz，CDCl3)谱中，给出21个碳信号，其中193.0ppm为羰基碳信号；142.8ppm为C‑β信号，126.8ppm为C‑α信号，烯键上碳信号；以上为典型的查尔酮骨架碳信号。159.4，158.5，158.4，153.4，140.2，131.0ppm为C连‑O苯环上碳信号；130.9，106.9，
105.6，87.1ppm为苯环上碳信号；以上为查尔酮母核上的碳信号。61.0，60.8，56.2，56.0，
56.0ppm为‑OCH3上碳信号。

[0041] 1H‑NMR(500MHz，CDCl3)谱中，13.97ppm处，给出1个H的s峰的信号，为2’‑OH信号；7.79，7.74ppm处，各给出1个H，偶合常数为15.5Hz的d峰信号，为H‑α，H‑β信号；由此确定该化合物为查尔酮。6.86ppm处，给出2个H的s峰信号，为典型的查尔酮H‑2’，H‑6’信号；
6.04ppm处，给出1个H的s峰信号，为H‑5’信号；3.98，3.97，3.92，3.87ppm处，给出3个H的s峰信号，为4个‑OCH3上氢信号；3.94ppm处，给出6个H的s峰信号，为2个‑OCH3上氢信号；由此确定该化合物为3，4，5，3’，4’，6’取代的查尔酮类成分。

[0042] 综合以上分析，推测其分子式为C21H24O8，将该化合物的核磁数据与文献[1](Yao H.,Jin Y.R.,Shan J.,et al.Two new natural methoxyflavonoids from leaves ofMurrayapaniculata(L.)Jack[J].Chemical Research in Chinese Universities,1 13
2013,29(5):884‑887.)报道的H‑NMR和 C‑NMR数据进行比较，本发明查尔酮类化合物鉴定为2’‑羟基‑3,4,5,3’,4’,6’‑六甲氧基查尔酮。其氢谱和碳谱数据见图1、图2。

[0043] 实施例3本发明查尔酮类化合物的抗肿瘤活性

[0044] 实验用药：本发明实施例1的查尔酮类化合物；

[0045] 阳性对照药：盐酸阿霉素；

[0046] 采用CCK‑8测试本发明查尔酮类化合物对肿瘤细胞的体外抑制活性，所筛选的肿瘤细胞株为B16和MDA‑MB‑231。具体过程如下：用DMSO将本发明查尔酮类化合物配制成20mg/mL的母液，然后用培养基稀释成100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625μg/mL的样品溶液。将B16细胞用RPMI 1640(Gibco)培养基培养，MDA‑MB‑231用DMEM(Gibco)培养基培养，培养基均含10％的胎牛血清和1％青链霉素，置于37℃，5％CO2细胞培养箱内。将处于对数生
3
长期的细胞接种于96孔板中，每孔体积100μL，每孔约含6×10个细胞，置于37℃，5％CO2细胞培养箱内培养12‑24h以允许细胞贴壁。弃孔内培养基，然后每孔加入100μL不同浓度的样品溶液，在37℃培养48h，每个样品做7个浓度，每个浓度做5个孔，实验重复3次。培养完毕，弃孔内培养基，每孔加100μL培养基和10μL的CCK‑8试剂(上海碧云天)，在37℃培养箱显色
1‑2h后，用Bio‑Rad酶标仪在450nm处测定吸光度，采用Probit(IBM SPSS V20.0)分析计算IC50，结果见表1。

[0047] 表1.本发明查尔酮类化合物的肿瘤细胞毒活性测试结果

[0048]

[0049] 以上实验结果显示，本发明查尔酮类化合物对两种肿瘤细胞有明显的抑制作用。

[0050] 尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。