具体技术细节
[0006] 本发明的目的主要是通过构建了猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株感染性克隆，成功拯救并繁殖了病毒，通过动物试验确定病毒可作为能区分免疫和自然感染(DIVA)的疫苗候选毒株，进而制备出DIVA的猪瘟疫苗。
[0007] (1)该疫苗主要含有猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株，该病毒株含有序列15所述的核苷酸和序列16所述的氨基酸序列的多肽；该病毒毒株已于2011年06月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.4975；
[0008] (2)该疫苗免疫猪体后，引起高效免疫应答，产生体液免疫可产生序列16所述的氨基酸序列的多肽的特异抗体，通过检测特异性抗体可区分免疫和自然感染。
[0009] 本发明是通过以下技术方案来实现的：
[0010] 1.猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株的构建
[0011] (1)标记蛋白基因的引入：是以猪瘟病毒兔化弱毒株全长感染性克隆为载体pAC-CS，插入一段外源DNA序列(序列No.15)构建成猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株。
[0012] (2)猪瘟兔化弱毒标记疫苗病毒的拯救；
[0013] (3)病毒的繁殖
[0014] 2.以猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株作为疫苗生产毒种，接入生长良好的SK6、ST和PK15细胞中的任一种传代细胞，按常规细胞活疫苗的制造方法制成猪瘟兔化弱毒标记疫苗；或接种日本大耳白家兔，按照猪瘟脾淋苗的制造方法生产猪瘟兔化弱毒标记疫苗。具体实施方案
[0015] 一、猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株的构建
[0016] 猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株的构建是通过以下技术方案实现的：
[0017] 1.猪瘟病毒C株全长感染性克隆的构建：
[0018] (1)RNA提取，反转录，PCR扩增：取猪瘟病毒C株作为疫苗生产毒种，由国内生产厂家生产的猪瘟活疫苗商品(保存于中国兽医药品监察所)，加入适量磷酸盐缓冲液稀释至2头份/mL，提取总RNA，反转录，根据发表于Genebank(登录号：AY805221)的猪瘟序列设计6对引物(见表1)，将猪瘟C株基因组分6段扩增，分别命名为S1、S2、S3、S4、S5、S6，全部克隆至pMD18-T载体(Takara公司)，选取阳性克隆，提取质粒，分别命名为pS1，pS2，pS3、pS4、pS5、pS6；
[0019] (2)猪瘟病毒C株5’半长cDNA和3’半长cDNA构建取pS1，pS2质粒同时用NotI/BspDI(NEB公司)双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物(天根生物技术有限公司)，将S1片段连接至pS2载体中，转化，筛选获得阳性克隆命名为为pS1-S2。将pS1-S2，pS3质粒同时用NotI/NsiI双酶切，琼脂糖回收酶切产物，将S1-S2片段连接至pS3载体中，转化，筛选获得阳性克隆命名为pS1-S2-S3，即为猪瘟病毒C株5’半长cDNA。取pS4，pS5质粒同时用BamHI/Xbal双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物，将S4片段连接至pS5载体中，转化，筛选获得阳性克隆命名为pS4-S5。将pS4-S5，pS6质粒同时用BamHI/HindIII双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物，将S4-S5片段连接至pS6载体中，转化，筛选获得阳性克隆命名为pS4-S5-S6，即为猪瘟病毒C株3’半长cDNA。
[0020] (3)猪瘟病毒C株全长感染性克隆cDNA的连接将猪瘟病毒5’半长cDNA阳性质粒pS1-S2-S3与本实验室构建的pAC载体同时用NotI/BamHI双酶切，琼脂糖电泳回收S1-S2-S3片段和pAC载体，连接转化，筛选获得阳性克隆pAC-5’CS。将pAC-5’CS和pS4-S5-S6质粒用BamHI/NgoMIV酶切，琼脂糖回收pAC-5’CS载体和S4-S5-S6片段，连接转化，筛选获得阳性克隆命名为pAC-CS即为猪瘟病毒C株全长感染性克隆(如图1所示)。
[0021] 表1引物表
[0022]
[0023]
[0024] 注：划线部分为用到的酶切位点
[0025] 2.标记蛋白基因的引入方法：
[0026] 取引物No.13(100μmol/L)与No.14(100μmol/L)各10μL混合，煮沸，自然冷却，此样品为插入片段。然后将猪瘟兔化弱毒株5’半长感染性克隆cDNA的质粒pAC-5’CS用SpeI、NgoMⅣ酶切，琼脂糖凝胶电泳回收，加入以上处理好的引物(No.13和No.14)插入片段，连接转化，筛选获得含标记的pAC-5’CS-marker。将pAC-5’CS-marker和pS4-S5-S6质粒同时用BamHI/NgoMIV双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收，连接转化，筛选获得猪瘟病毒C株标记疫苗全长感染性克隆pAC-CS-marker(如图2所示)。引入的外源基因(其核苷酸序列No.15，编码的氨基酸序列为No.16)插入到了猪瘟病毒C株的E1蛋白末端。
[0027] 3.体外转录：将猪瘟病毒C株标记疫苗全长感染性克隆pAC-CS-marker质粒线性化处理，通过体外转录试剂盒(Ambion公司)转录成RNA。
[0028] (1)线性化DNA：用限制性内切酶处理pAC-CS-Marker质粒使其线性化[0029]
[0030] 37℃酶切3～5小时。
[0031] (2)去RNase：加入蛋白酶K消化酶切产物，以达到去除RNase的效果
[0032]
[0033]
[0034] (3)苯酚氯仿抽提：在100μL去RNase的线性化质粒中加入100μL苯酚氯仿异戊醇(25∶24∶1)，漩涡混合，4℃，12000r/min离心15min；
[0035] (4)酒精沉淀：取上清约80～90μL，加入2.5倍体积的无水乙醇，1/10倍体积的3mol/L醋酸钠，混匀，放置-20℃沉淀30分钟，4℃，12000r/min离心15min；
[0036] (5)DNA溶解：弃上清，在37℃干燥15min，加入15μL无核酶水。
[0037] (6)RNA转录：按照体外转录试剂盒说明书操作，加入以下成分。
[0038]
[0039] 39℃作用2小时，电泳检测。
[0040] 4.病毒拯救：通过电转染或脂质体转染将含标记的pAC-CS-Marker质粒或RNA转染到猪瘟病毒易感细胞SK6(或ST、PK15等)，成功拯救出病毒，该病毒毒株已于2011年06月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.4975。将带CGMCC No.4975病毒的细胞在37℃培养并传代，分别用猪瘟病毒单克隆抗体WH303(中国兽医药品监察所保存)和标记蛋白抗体(兔源，sigma公司)作免疫过氧化酶单层细胞试验(Immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)和免疫荧光试验，结果均为阳性，具体步骤如下：
[0041] (1)电转染：取处于对数期生长的SK6或ST或PK15细胞，弃去培养基，加入0.25％胰酶消化液，待作用充分后，加入含10％胎牛血清的培养基中和，1000r/min，4℃离心5min；弃上清，加入PBS充分吹打细胞团块，1000r/min，4℃离心5min，重复3遍，加入
7
PBS重悬细胞，使每毫升细胞浓度达到1×10 ；取400μL细胞加入0.2cm电转杯中，再加入
20μL RNA或3μg DNA混匀，以200V，500μF电击，室温放置5min左右；加入10mL含10％
2
胎牛血清的培养基，混匀，取9.0mL加入75cm 细胞培养瓶，剩余1mL加入24孔细胞培养板中，每孔0.5mL，置37℃，5％CO2条件下培养。
[0042] (2)免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)：取电转染后长成致密单层的24孔细胞培养板，移去上清，用1％的PBS清洗细胞一次，加入固定液(甲醇∶丙酮＝1∶1)0.5mL，-20℃固定30min；弃去固定液，干燥，加入5％马血清37℃封闭30～60min；
用1％PBS洗涤2遍，分别加入适宜浓度的(1∶1000)猪瘟单克隆抗体WH303或标记蛋白抗体，37℃作用1小时；用1％PBS洗涤3遍，加入适宜浓度的酶标二抗，37℃作用30min；用
1％PBS洗涤3遍，加入显色底物和过氧化氢，8～15min终止，显微镜下观察。结果表明，用猪瘟病毒单克隆抗体和标记蛋白抗体染色均为阳性，说明构建的猪瘟兔化弱毒标记疫苗株拯救成功。
[0043] (3)免疫荧光检测：取电转染后长成致密单层的24孔细胞培养板，移去上清，用1％的PBS清洗细胞一次，加入固定液(95％乙醇)0.5mL，-20℃固定30min；弃去固定液，干燥，加入5％马血清37℃封闭30～60min；用1％PBS洗涤2遍，分别加入适宜浓度荧光标记的猪瘟单克隆抗体WH303(绿色荧光)或标记蛋白抗体，37℃作用1h，用1％PBS洗涤3遍；用标记蛋白抗体作用后加入羊抗兔荧光二抗(红色荧光，sigma公司)，37℃作用1h，用
1％PBS洗涤3遍，置荧光显微镜下观察，用猪瘟单克隆抗体染色的阳性细胞呈绿色荧光，用羊抗兔荧光二抗染色的阳性细胞呈红色荧光。
[0044] (4)除了用免疫学方法检测标记蛋白，也可采用分子生物学方法检测疫苗或免疫动物中猪瘟兔化弱毒株病毒的特异性序列。该病毒可用RT-nPCR(套式PCR)方法检测，步骤如下：
[0045] 1)RNA提取，按照Trizol提取法操作程序进行。
[0046] 2)反转录，按照下列体系加入各成分：
[0047]
[0048] 放置50℃作用1小时。
[0049] 3)PCR分为外围PCR和内围PCR
[0050] 外围PCR反应体系如下：
[0051]
[0052]
[0053] 混匀后按照以下程序进行PCR扩增：
[0054]
[0055] 内围PCR反应体系如下：
[0056]
[0057] 混匀后按照以下程序进行PCR扩增：
[0058]
[0059] 4)电泳检测用1×TAE缓冲液配制1％琼脂糖凝胶，每孔加入5μLDNA样品，120V，电泳30min，能检测出581bp特异性目的条带，而猪瘟兔化弱毒株对应的条带为521bp。
[0060] 5.转染细胞传代：待转染pAC-CS-marker质粒或其RNA的细胞长成致密单层后，取上清，用0.25％EDTA-胰酶消化细胞，加入适量含10％小牛血清的MEM培养基，吹散细胞，加入到细胞瓶中置37℃、5％CO2条件下培养。传代细胞用猪瘟病毒单克隆抗体WH303检测病毒感染率，当传至第6代时阳性细胞率可达85％以上。
[0061] 6.病毒遗传稳定性测定：通过对15代的病毒液进行RT-PCR扩增，产物送测序，发现标记基因未发生突变。转染细胞每隔3代用免疫过氧化酶单层细胞试验检测标记蛋白，结果显示该标记蛋白一直稳定表达。
[0062] 7.动物试验：选取经中和试验方法检测的无猪瘟中和抗体的健康易感断奶猪5头，每头肌肉注射病毒液1mL(含1×105最小兔体感染量)，接种后，每天上下午观察并测温，每2天采血一次，每次采血2mL，分离血清，用于检测猪瘟特异性抗体及标记蛋白抗体，采集至第40天，同时设空白对照猪2头。免疫猪只体温升高不超过1℃，稽留时间不超过24h，符合现行《中华人民共和国兽药典》的安全检验规定。
[0063] 8.标记蛋白抗体的检测
[0064] 用人工合成的标记蛋白包被ELISA反应板，浓度1μg/mL，每孔50μL，4℃过夜；用PBS-Tween缓冲液洗涤ELISA反应板3次，加入5％脱脂牛奶37℃封闭1h；用PBS-Tween缓冲液洗涤3次，每孔加入倍比稀释的猪血清50μL，37℃作用1h；用PBS-Tween缓冲液洗涤5次，加入适宜浓度的抗猪酶标二抗50μL，37℃作用30min；用PBS-Tween缓冲液洗涤5次，加入底物和催化剂，室温作用10～15min，加入终止液，用酶标读数仪测定OD值。结果显示接种猪瘟兔化弱毒标记疫苗的猪在第26天标记蛋白抗体检测值为阳性(OD值为1.5～2.0)，空白对照猪标记蛋白抗体检测值为阴性(OD值＜0.1)，表明可通过检测标记蛋白抗体来区分猪瘟免疫和自然感染。
[0065] 二、疫苗制备
[0066] 9.制苗毒液的繁殖：
[0067] ①制造细胞苗的病毒繁殖：将传至8～13代的CGMCC No.4975病毒转染细胞作为种子细胞，冻存于液氮中，繁殖病毒时复苏细胞，可直接培养或加入50％阴性细胞(SK6、ST和PK15等细胞中的任一种)共同培养，培养48～72h左右，待细胞长成致密单层后，收获上清液(病毒液)，同时传代细胞。收获的病毒液冻存于-20℃以下。
[0068] ②制造脾淋苗的病毒繁殖：将5～10代的CGMCC No.4975病毒培养上清接种日本大耳白兔，选取24小时以后出现定型热或轻热反应的家兔，待其体温下降后的24小时内剖杀，以无菌手术采取脾脏和淋巴结。称重、剪碎，可立即配苗或冻存于-20℃以下。保存期不得超过15日。
[0069] 10.制苗毒液的检验：
[0070] ①无菌检验：按照《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二五年版三部中国农业出版社，2006，本发明称《中国兽药典》)附录15页进行，无细菌、霉菌生长；
[0071] ②支原体检验：按照《中国兽药典》附录19页进行，无支原体生长；
[0072] ③病毒含量测定：将收获的病毒耳静脉注射家兔，引起了典型的定型热，每毫升病5
毒含量为1～5×10 家兔最小感染量(MID)。
[0073] ④安全检验：选用经中和试验方法检测的无猪瘟中和抗体的健康易感断奶猪2头，各耳根后肌肉注射病毒液10mL。每日上下午各测体温观察一次，观察21日，体温、精神、食欲注射病毒液前后没有明显变化，体温升高不超过0.5℃，减食没有超过1日，猪只全部健活，表明猪瘟病毒兔化弱毒标记疫苗株是安全的。
[0074] 11.配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒液混合，按一定比例加入5％蔗糖脱脂牛奶稳定剂，充分混匀，定量分装，每头份含细胞毒液不少于0.015mL。脾淋苗每头份不少于0.01g。然后迅速进行冷冻真空干燥。
[0075] 三、疫苗检验
[0076] 12.成品疫苗的检验：按照《中国兽药典》中“猪瘟活疫苗(细胞源或兔源)”进行检验。
[0077] ①性状：淡红色海绵状疏松团块，易与瓶壁分离，加稀释液后迅速溶解；
[0078] ②无菌检验：按照《中国兽药典》附录15页进行，无细菌、霉菌生长；
[0079] ③支原体检验：按照《中国兽药典》附录19页进行，无支原体生长；
[0080] ④鉴别检验：将疫苗用生理盐水稀释成每毫升含100个兔MID的病毒悬液，与等量抗猪瘟病毒特异性血清充分混合，置10～15℃中和1小时，其间振摇2～3次。同时设病毒对照和生理盐水对照。中和结束后，分别耳静脉注射兔2只，每只0.1mL，按照《中国兽药典》“猪瘟活疫苗(兔源)”中效力检验项(1)进行观察和判定。除病毒对照组出现热反应外，其余2组在接种后120小时内应不出现热反应。
[0081] ⑤安全检验：
[0082] 小鼠和豚鼠检验：将疫苗用生理盐水稀释成5头份/mL，皮下注射体重18～22g小鼠5只，每只0.2mL，肌肉注射体重350～400g豚鼠2只，各1.0mL，观察10日，所有小鼠全部健活。
[0083] 用猪检验：选用经中和试验方法检测的无猪瘟中和抗体的健康易感断奶猪。将疫苗用生理盐水稀释成每毫升含6头份，肌肉注射猪4头，每头5.0mL，接种后，每日上、下午观察并测体温，观察21日，注苗后猪只体温、精神、食欲与接种前没有明显变化，体温升高不超过1℃，稽留不超过2个温次，疫苗合格。
[0084] ⑥效力检验：
[0085] 用猪检验：选取无猪瘟中和抗体的猪4头接种标记疫苗，每头肌肉注射1.0mL(1/150头份/mL)，接种10～14天后，连同对照猪3头，均注射猪瘟病毒石门系血毒
5
1.0mL(含10 最小致死量)，观察16日，免疫猪均出现保护，对照猪全部死亡。结果表明疫苗保护效果很好。
法律保护范围
涉及权利要求数量4：其中独权3项，从权-3项
1.一种猪瘟兔化弱毒标记疫苗，其特征在于：
(1)该疫苗主要含有猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株，该病毒株含有序列15所述的核苷酸和序列16所述的氨基酸序列的多肽；该病毒毒株已于2011年06月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.4975；
(2)该疫苗免疫猪体后，引起高效免疫应答，产生体液免疫可产生序列16所述的氨基酸序列的多肽的特异抗体，通过检测特异性抗体可区分免疫和自然感染。
2.一种猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株的构建，其特征在于该病毒株的构建主要包括如下步骤：
(1)标记蛋白基因的引入：是以猪瘟病毒兔化弱毒株全长感染性克隆为载体pAC-CS，插入一段外源DNA序列(序列No.15)构建成猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株。
(2)猪瘟兔化弱毒标记疫苗病毒的拯救；
(3)病毒的繁殖
3.一种猪瘟兔化弱毒标记疫苗的制备方法，其特征在于以猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株作为疫苗生产毒种，接入生长良好的SK6、ST和PK15细胞中的任一种传代细胞，按细胞活疫苗的制造方法制备。
4.如权利要求3所述的一种猪瘟兔化弱毒标记疫苗的制备方法，其特征在于以猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株作为疫苗生产毒种，接种日本大耳白家兔，按照猪瘟脾淋苗的制造方法生产猪瘟兔化弱毒标记疫苗。
