[0001] 本发明涉及猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株的构建及疫苗的制备方法，属于兽用生物制品领域。

[0002] 猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的猪的急性、高度致死性、接触性传染病。根据OIE制定的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》2008版本规定，该病被列为法定上报的动物疫病之一，在我国被列为“一类动物疫病”，是威胁我国养猪业的重要传染病之一。

[0003] 在20世纪早期和中期，大量研究人员通过不同方法研制出了猪瘟疫苗中国株(猪瘟兔化弱毒株或猪瘟病毒Chinese株或猪瘟病毒C株)、法国Thiverval株、日本CPE-株三大品系。其中以中国兽医药品监察所研制的C株最好，具有免疫原性强、安全性好、稳定性高的特点，为猪瘟疫苗“金标准”(Gold Standard)，被欧美等许多国家广泛使用，并最终消灭了大多数国家的猪瘟，目前有些国家仍在使用。随着猪瘟在西欧的消灭，这些国家不再进行猪瘟免疫，然而，1997/1998年荷兰猪瘟的爆发以及近年来欧洲野猪猪瘟的散发，导致巨大的经济损失，使得相关国家重新考虑使用疫苗免疫，其中最理想的是能区分免疫和自然感染(DIVA，Discrimination of Infected from Vaccinated Animals)的疫苗。目前仍在使用疫苗预防猪瘟的国家或地区，想通过净化手段来达到控制消灭猪瘟的目的，但是没有相应的方法能够区分免疫和自然感染，使得猪瘟预防的效果一直不理想，现亟待开发一种DIVA疫苗。

[0004] 猪瘟DIVA疫苗现在已成为研究热点，早在1993年Hulst等(Hulst MM，Westra DF，Wensvoort G，Moormann RJ.Glycoprotein，E 1of hog cholera virus expressed in insect cellsprotects swine from hog cholera.J Virol 1993；67(9)：5435-42)研究了猪瘟病毒E2亚单位疫苗 2000年Ahrens U等(Ahrens U，Kaden V，DrexlerC，Visser N.Efficacy of theclassical swine fever(CSF)marker vaccine Porcilis Pesti in pregnant sows.Vet Microbiol2000；77(1-2)：83-97)研究了猪瘟E2亚单位疫苗 Pesti，但这两种疫苗免疫效果不如弱毒疫苗株，因此没有广泛使用。随着生物技术的发展，研究人员开发了不同病毒为载体(如腺病毒，伪狂犬病毒，牛病毒性腹泻/粘膜病病毒)的活载体疫苗(Hammond JM，Jansen ES，Morrissy CJ，et al.Oral and sub-cutaneous vaccination of commercial pigs with a recombinantporcine adenovirus expressing the classical swine fever virus gp55gene.Arch Virol
2001；146(9)：1787-93；Reimann I，Depner K，Trapp S，et al.An avirulent chimeric Pestivirus with alteredcell tropism protects pigs against lethal infection with classical swine fever virus.Virology2004；322(1)：143-57；Rziha H，Henkel M，Cottone R，et al.Generation ofrecombinantparapoxviruses：non-essential genes suitable for insertion and expression of foreign genes.JBiotechnol.2000；
83(1-2)：137-45；Patricia Koenig，Elke Lange，Ilona Reimann，et al.CP7E2alf：Asafe and efficient marker vaccine strain for oral immunisation of wild boar against Classical swinefever virus(CSFV).Vaccine 2007：25(17)：3391-3399)，免疫效果可能受到载体的干扰，相比猪瘟兔化弱毒疫苗而言其免疫效果也不理想，生产应用受到限制。另外，研究人员还致力于开发猪瘟病毒基因缺失疫苗(van Gennip HG，Bouma A，van Rijn PA，et al.Experimentalnon-transmissible marker vaccines for classical swine fever(CSF)by trans-complementation ofErns or E2ofCSFV.Vaccine 2002；20(11-12)：
1544-56；Frey CF，Bauhofer O，Ruggli N，et al.Classical swine fever virus replicon particles lacking the Erns gene：a potential marker vaccine forintradermal application.Vet Res 2006；37(5)：655-70；Maurer R，Stettler P，Ruggli N，et al.Oronasalvaccination with classical swine fever virus(CSFV)replicon particles with either partial orcomplete deletion of the E2gene induces partial protection against lethal challenge with highlyvirulentCSFV.Vaccine
2005；23(25)：3318-28；de Smit AJ，Bouma A，van Gennip HG，et al.Chimeric(marker)C-strain viruses induce clinical protection against virulent classical swine fevervirus(CSFV)and reduce transmission of CSFV between vaccinated pigs.Vaccine2001；19(11-12)：1467-76；Kortekaas J，Vloet RP，Weerdmeester K，et al.Rational design of aclassical swine fever C-strain vaccine virus that enables the differentiation between infected andvaccinated animals.J Virol rns
Methods.2010；163(2)：175-85)，如替换、突变或删除E 、E1或E2基因中某些序列，以达到缺失某一种表位或功能区的目的，通过检测相应抗体可区分免疫和自然感染动物，但缺失保护性抗原中的相应部位后，往往导致免疫原性降低，影响免疫效果。2009年L.G.Holinka等(Holinka LG，Fernandez-Sainz I，O′Donnell V，Prarat MV， Gladue DP，Lu Z，Risatti GR，Borca MV Development of a live attenuated antigenic marker classical swine fevervaccine.Virology.2009：384(1)：106-13)以猪瘟病毒Brescia株为基础，构建了缺失中和表位WH303，加入Flag标签的双标记疫苗，试验结果表明该毒株对Brescia株攻毒具有较好的保护性，但Brescia株为强毒，具有生物安全隐患，此外该标记疫苗对其它毒株的免疫效果还没确证。

[0005] 本发明以猪瘟兔化弱毒株(C株)全长感染性克隆(邹兴启，赵启祖，范运峰，等.猪瘟病毒C株全长cDNA感染性克隆的构建及病毒拯救.中国农业科学，2011：44(2)：409-416)为基础，在E1基因中插入一段外源DNA序列，经拯救获得猪瘟兔化弱毒标记疫苗病毒，该毒株不仅同时保持了猪瘟兔化弱毒株安全性好，免疫原性优良等特点，而且外源DNA序列的表达产物可诱导动物机体产生特异性抗体，能通过检测外源基因特异性抗体来区分免疫与自然感染，因此可以作为DIVA疫苗用于猪瘟的预防。