技术领域
[0001] 本发明涉及肿瘤空间分布技术领域，尤其涉及一种肿瘤组织内空间分布信息的动态分析方法及其应用。
相关背景技术
[0002] 肿瘤免疫细胞存在空间分布差异。对于肿瘤内免疫细胞空间分布异质性的研究目前广泛应用的主要有两种方法：一是空间转录组技术，对肿瘤切片上的所有细胞进行原位的单细胞水平的转录组分析；二是多重免疫荧光标记技术，在蛋白水平上实现了可视化分析。这些技术通过对肿瘤冷冻切片内免疫细胞在空间的分布位置、数量密度、免疫活性等信息的分析，展示了不同肿瘤内的免疫细胞空间分布存在的异质性规律对临床的预测价值。质谱、荧光、拉曼等成像技术也可以通过对肿瘤切片的空间分析，通过对切片上的细胞进行分区的瞬态研究，实现对肿瘤内免疫细胞空间分布特性的研究。目前的相关方法仍难以在活细胞水平上，对肿瘤内免疫细胞的空间分布进行有效的动态研究。
[0003] 肿瘤及其内部微环境是具有明显时间动态性的，肿瘤在药物治疗前后，其内部微环境发生显著变化，进而导致了肿瘤内的免疫重构，甚至造成对免疫治疗的耐受。这种变化导致的免疫细胞空间分布变化，是肿瘤免疫治疗的关键信息。因此仍需发展能够对肿瘤内部免疫细胞空间分布的动态分析方法。
[0004] 将肿瘤或肿瘤部分组织取出，通过消化、酶解、物理破碎等方法，可以在保留细胞活性的前提下，实现肿瘤或肿瘤组织的离散化。将离散化的肿瘤细胞，放入特定形状的腔体内培养，肿瘤再次聚集成团，形成肿瘤微球。肿瘤微球内的细胞来源自肿瘤内部，很大程度上保留了肿瘤内的生理环境。因此肿瘤微球法已被广泛用于肿瘤内细胞的活性分析、药物功能评价等方面。现有的肿瘤微球方法，没有考虑到肿瘤内细胞的空间分布差异，只把肿瘤内细胞进行均一化研究，这损失了肿瘤内多种细胞，特别是肿瘤内免疫细胞空间分布的信息。而这种信息对于评价肿瘤免疫治疗方案的功效，至关重要。因此仍需开发能保存肿瘤内免疫细胞空间分布信息的肿瘤微球方法。
[0005] 微流控芯片作为目前主要的肿瘤微球制备方案，其借助内部高通量的微孔阵列，为肿瘤微球的高通量形成提供载体支撑。因此，使用微流控阵列式芯片进行肿瘤微球阵列，是有效获得高通量肿瘤微球的重要方式。但是目前仍无使用微流控芯片制备的肿瘤微球阵列进行肿瘤内免疫细胞空间分布异质性的研究。
具体实施方式
实施例1
[0026] 一种肿瘤组织内空间分布信息的动态分析方法，该方法在微阵列器件上完成，如图1所示，图1中A是用SOLIDWORKS设计的微阵列模型设计图以及培养肿瘤细胞的示意图，B是微阵列芯片实物图。具体操作步骤如下：（1）得到荷瘤小鼠肿瘤组织
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将100µL(1×10 )肿瘤细胞CT26皮下注射于6 8周龄Balb/C小鼠，待肿瘤长到~
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1500mm时用于接下来的实验。
[0027] （2）肿瘤组织分层将肿瘤组织完整的解剖下来，并浸泡在加入50nm、100nm荧光微球的5mL的PBS中，两种微球的浓度分别为：0.1wt%。在25℃下静置浸泡渗透30min，荧光微球通过渗透扩散到肿瘤组织内不同深度位置（示意图如图2所示）。将100nm渗透的区域划分为外层，没渗透的区域划分为内层，其余区域为中层。
[0028] （3）获得不同层肿瘤球将肿瘤不同层组织解剖下来（如图2所示），将切碎的肿瘤组织在细胞培养皿中铺‑1
匀开，加入用1640培养基配制的IV型胶原酶（100 U·mL ）和 HEPES（15 mM）3mL ，在37℃下孵育20分钟。制成单细胞并铺于微阵列器件上进行培养，培养温度为37℃，二氧化碳浓度
5%，培养箱中放有无菌水保证一定湿度，培养48h，得到不同区域肿瘤微球及肿瘤微球阵列。
肿瘤组织成球分层操作过程的流程图如图3所示。
实施例2
[0029] 按照实施例1的方法构建B16F10肿瘤组织并进行分层操作，各步骤与实施例1相同。
[0030] 对实施例1培养48h的CT26细胞微球和B16F10细胞微球进行活性分析。具体操作步骤如下：（1）去上清，用PBS清洗细胞3次，每次5分钟，以充分去除生长过程中产生的酯酶的活性；
（2）使用钙黄绿素AM活细胞渗透性试剂（含有1 μM钙黄绿素AM，2μM碘化丙啶PI），
37 ℃染色30分钟，进行可视化表征；
（3）用激光共聚焦显微镜检测染色结果，统计结果如图4所示。
[0031] 从图4可以看出CT26和B16F10肿瘤细胞的外（O）、中（M）、内（I）三层的细胞活性表现一致，即外层和中层的肿瘤细胞活性均高于内层。实施例3
[0032] 对实施例1培养48h的不同区域肿瘤球内的免疫细胞数量、免疫活性进行分析。同时，按照传统肿瘤微球制作方法：肿瘤组织解剖下来，将整块组织剪碎并铺匀于细胞培养‑1皿，加入用1640培养基配制的IV型胶原酶（100 U·mL ）和 HEPES（15 mM）3mL ，在37℃下孵育20分钟，将整个匀浆液用5mL 1640培养基重悬，通过70μm细胞筛，得到单细胞悬浮液。离心重悬后铺于阵列芯片，相同的培养条件，得到肿瘤微球。作为对照。
[0033] （1）肿瘤微球培养48h后去除上清，用PBS清洗2遍；（2）4%多聚甲醛固定20min ，PBS清洗2遍，每次2min；
（3）0.5% TritonX透膜25min，PBS清洗2遍，每次2min；
（4）1% BSA室温封闭60min，PBS洗2遍，每次2min；
（5）两组芯片上分别加入用PBS 1：200稀释的CD11C‑FITC、CD86‑Cy5和CD8‑FITC、CD69‑Cy5的免疫荧光抗体200μl，避光放于室温20min；
（6）滴加抗荧光淬灭DAPI封闭液20μl于步骤（5）的体系上，避光放于室温15min；
用激光共聚焦显微镜、流式分析仪检测树突状细胞与T细胞分子表型。比较不同区域树突状细胞与T细胞在分子表型上的差异性。如图5、6所示。结果表明，DC和T细胞数量和活化程度外层到内层呈现下降趋势。
实施例4
[0034] 本发明中，不同层得到的肿瘤微球还可以用于细胞的其他生物学研究。
[0035] 将不同层制作的肿瘤微球从芯片上吹下来，对细胞进行裂解，获取其中的RNA，使用q‑PCR方法，对不同层细胞基因型进行研究。研究不同层树突状细胞与T细胞的基因型差异（如图7所示）。
[0036] （1）吹打培养至48h的芯片上的肿瘤微球，收集至10 mL离心管，离心（1200 r/min，7 min），去除上清，用PBS洗涤2次。
[0037] （2）细胞计数，加入37℃预热的RPMI‑1640完全培养基，最终细胞浓度为1×106个/mL，标记为外层、中层、内层，备用。
[0038] （3）总RNA提取按照福际公司生产的细胞总RNA分离试剂盒使用手册执行。具体操作步骤为：（4）向收集的确定浓度的细胞沉淀中加入Buffer cRL1，用于裂解细胞。用移液器反复吹打混匀(直到看不到细胞团为止) 。
[0039] （5）将裂解好的细胞混合液转移至DNA‑Cleaning Column中（DNA‑Cleaning Column放入收集管中)，12,000 rpm离心2min。移除DNA‑Cleaning Column，保留收集管内上清液。
[0040] （6）向上述上清液中加入1.6倍体积Buffer cRL2，轻柔混匀。
[0041] （7）将混合液全部转移至RNA‑Only Column中(纯化柱放入收集管中)，12,000 rpm离心1min，弃掉收集管中的废液。
[0042] （8）向纯化柱中加入500 µL Buffer RW1，12,000 rpm离心1min，弃掉收集管中的废液。
[0043] （9）向纯化柱中加入700 µL Buffer RW2，12,000 rpm离心1min，弃掉收集管中的废液。
[0044] （10）将纯化柱放回收集管中，12,000 rpm空管离心2min，去掉离心柱中残余的Buffer RW2。
[0045] （11）重复步骤（10）。
[0046] （12）将纯化柱转移至新的RNA收集管中，向纯化柱的膜中央滴加50 µL已于65℃ 预热的RNase‑Free ddH2O，室温放置2min。12,000 rpm离心1min收集RNA溶液。
[0047] （13）使用 NanoDrop ND‑1000 测定RNA的浓度和纯度。
[0048] （14）反转录：按照FOREGENE RT EasyTM II Intruction Manual 说明书进行操作。
[0049] （15）qRT‑PCR：定量PCR反应体系如下：SYBR Green PCR Master Mix 10 µL；上下游引物（表1）混合物1 µL；cDNA 2 µL；ddH2O 7 µL。qRT‑PCR 扩增可以得到目的基因的Ct‑ΔΔt值，以内参基因Gapdh为标准，采用2 定量法分析所测基因在不同层中表达量的差异。
[0050] 表1 上下游引物
[0051] 实施例5冷热肿瘤不同层免疫细胞分子表型的比较。
[0052] 制作冷肿瘤‑黑色素瘤B16F10与热肿瘤CT26的不同层肿瘤微球，并比较两种肿瘤相同区域的免疫细胞分子表型的比较。方法同实施例1和3。结果如图8、9所示。实施例6
[0053] 药物处理组与未处理组间不同层免疫细胞数量与分子表型的比较（1）待荷瘤小鼠肿瘤（同实施例1）长到黄豆大小时（一般为第三天）给小鼠尾静脉注射100μg/mL乌拉尔甘草多糖免疫增强药物100μl，隔一天注射一次，共注射五次；
其中乌拉尔甘草多糖免疫增强药物的制备方法为：将100g乌拉尔甘草粉碎过80目筛，取筛下物加入500mL石油醚在60℃下回流脱脂2次，每次2h，收集滤液和药渣，滤液备用；
取药渣加800mL蒸馏水室温（25℃）400W超声20min，然后60℃回流2次，每次2h，收集滤液；将两次滤液合并，在60℃旋蒸浓缩至原体积的10%，得到浓缩液，在浓缩液中加入5wt%的活性炭在60℃下脱色30min，脱色后，按照体积比1:4加入无水乙醇进行醇沉，收集沉淀得到粗多糖，用PBS将粗多糖配置成浓度为100μg/mL的药液，即本实施例所用乌拉尔甘草多糖免疫增强药物。
[0054] （2）将药物处理组与对照组（未作处理）肿瘤解剖下来分别制作不同层肿瘤微球，方法同实施例1，检测免疫细胞数量与分子表型特征，方法同实施例3。
[0055] （2）比较对照组与处理组同一层免疫细胞数量与分子表型，得到不同层对免疫增强药物的响应结果。
[0056] 结果如图10所示，对照组和实验组（药物处理组）的免疫细胞数量都表现为由外及内递减，但药物处理组的免疫细胞数量明显高于对照组。
[0057] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
