[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种可控性炎症驱动的中性粒细胞介导的肿瘤药物递送系统。

[0002] 癌症是世界上导致死亡的主要原因，且死亡数量每年都在持续增加。肿瘤以恶性增殖、侵袭转移、免疫逃避等多种机制促进自身发生发展为特点，并为自身营造出肿瘤微环境(TME)以进一步抵御机体免疫并维持其自身发展，使得手术、放疗和化疗三大常规治疗手段对许多癌症仍不能达到有效治疗。靶向药物传递的发展是药物研究最重要的目标之一。近几十年，生物相容性纳米材料的发展极大地提高了肿瘤部位药物的递送效率，增强了药物的肿瘤靶向性，降低了药物的毒副作用，使得肿瘤靶向治疗得到快速发展，一些纳米药物也已经被批准在常规临床应用。然而，仍有许多障碍阻碍纳米医学的广泛应用。例如，EPR效应和主动靶向方法虽然可以在一定程度上调节纳米药物的生物分布，但仍只有小部分纳米药物可以到达肿瘤部位，大部分则被网状内皮系统(RES)清除。此外，大多数纳米材料没有足够长的血液半衰期，很难实现对肿瘤组织的深部穿透等。因此，开发其他更加高效、低毒的肿瘤靶向性药物治疗的新策略对于进一步提高肿瘤治疗效果具有很大的必要。细胞载体结合纳米材料的研究为进一步实现肿瘤主动靶向性治疗提供了新的思路。

[0003] 以细胞为载体的纳米材料用于制备肿瘤特异性靶向的抗肿瘤药物是利用各种细胞的固有属性，如在血液中的长循环时间、对肿瘤微环境及肿瘤细胞的特异性靶向性、跨越机体内天然生物屏障的能力、丰富的表面配体、变形及迁移能力以及独特的细胞信号传导或代谢机制等，将其与具有安全性、生物可降解性及生物相容性好等优势的纳米材料相结合，将纳米材料装载到细胞内，制备出具有肿瘤特异性靶向的新型抗肿瘤药物，通过细胞递送纳米材料完成对肿瘤的靶向性纳米疗法。这是通过最大化两者的优势，同时最大限度地减少其固有的缺点，从而加强整体治疗效果的一种癌症治疗策略。

[0004] 中性粒细胞是人体内最丰富的粒细胞类型，占人类所有白细胞的40％至70％。中性粒细胞作为免疫系统的首批反应者，具备的固有的迁移和吞噬能力，使其可以摄取纳米颗粒和吞噬死亡的红细胞；而且，还能跨血管迁移到临近组织及跨越天然生物屏障；除此之外，活化的中性粒细胞可以通过向细胞外释放由解聚的染色质和细胞内颗粒蛋白组成的细胞捕获网(Neutrophil extracellular traps，NETs)，以捕获和杀死病原体，具有释放其摄取的纳米颗粒的能力，因此，中性粒细胞是作为细胞载体的天然候选者。然而目前采用中性粒细胞作为药物载体治疗肿瘤方面还普遍存在药物靶向性较差，针对肿瘤的治疗效果较差的问题。

[0047] 本发明提供了一种治疗肿瘤的药物，包括：LPS和肿瘤药物递送系统；所述肿瘤药物递送系统包括中性粒细胞和装载到中性粒细胞内的治疗性纳米材料。

[0048] 本发明提供的药物采用LPS(脂多糖)诱导肿瘤内产生急性可控性炎症联合肿瘤药物递送系统用于治疗肿瘤。在本发明中，所述LPS的直接作用部位为肿瘤内。在本发明的实施例中，本发明通过在肿瘤内注射LPS使其直接作用于肿瘤内。本发明以被治疗对象的体重为标准，所述脂多糖的注射量可以为1mg/kg。作为本发明可选的实施方式，以小鼠肿瘤模型为例，小鼠模型的体重为20g，进行相应的效果验证时，所述小鼠肿瘤内LPS的注射量可以为0.02mg。

[0049] 本发明也可以将所述LPS注射到肿瘤内称之为构建肿瘤内急性可控性炎症模型。

[0050] 本发明使用LPS直接作用于肿瘤内部，可以在肿瘤组织内诱导可控性急性炎症，放大肿瘤微环境中的炎性信号，进而促进中性粒细胞为细胞载体的肿瘤药物递送系统在肿瘤微环境中大量浸润，从而实现肿瘤药物递送系统内装载的治疗性纳米材料的特异性靶向，利用中性粒细胞为细胞载体来实现更精准的肿瘤靶向治疗，同时利用中性粒细胞的特性控制全身炎症反应的进展，保证治疗的安全性。

[0051] 本发明优选在LPS作用于肿瘤内部6～12h后，使用肿瘤药物递送系统进行肿瘤的治疗。作为本发明可选的实施方式，本发明选用静脉输注的方式使用肿瘤药物递送系统进行肿瘤的治疗。在本发明中，所述肿瘤药物递送系统的注射量优选以中性粒细胞的细胞数为基准进行计算。在本发明中，所述肿瘤药物递送系统注射时中性粒细胞的细胞数优选≥16 6 6 6
×10个。也可以为1×10～4×10个，还可以为3×10个。

[0052] 在本发明中，所述肿瘤药物递送系统包括中性粒细胞和装载到中性粒细胞内的治疗性纳米材料。在本发明中，所述中性粒细胞包括动物骨髓中性粒细胞和/或外周血中性粒细胞。本发明对所述中性粒细胞的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规制备方法均可。在本发明中，所述治疗性纳米材料包括纳米载体和肿瘤治疗性药物；所述治疗性纳米材料由纳米载体作为工具，治疗性药物装载在纳米载体里组成。作为本发明可选的实施方式，所述药物递送系统由中性粒细胞和纳米药物载体通过内吞作用构建而成。本发明对所述构建方法没有特殊限定，采用本领域常规构建方法均可。

[0053] 作为本发明可选的实施方式，所述纳米载体包括正电性、负电性或近中性的粒径为1～500nm纳米材料。在本发明中，所述纳米载体包括人血清蛋白、脂质体、介孔二氧化硅纳米粒、石墨烯、胶束、纳米囊和金纳米棒中的任一种或两种以上；所述肿瘤治疗性药物包括抑制肿瘤细胞内酶活性的药物、抑制微管蛋白形成的药物、抑制DNA形成的药物、抑制RNA形成的药物和导致组织缺氧的药物中的任一种或两种以上。在本发明中，所述肿瘤治疗性药物包括DOX·HCl。作为本发明可选的实施方式，所述肿瘤包括：乳腺癌、急性白血病、恶性淋巴瘤、支气管肺癌、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌和肝癌中的任一种或两种以上。在本发明中，所述乳腺癌包括三阴性乳腺癌。

[0054] 本发明对上述技术方案所述肿瘤药物递送系统的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规方法制备均可。作为本发明可选的实施方式，所述肿瘤药物递送系统的制备方法可以包括：先将治疗性药物装载于纳米载体中，得到治疗性纳米材料；再将所述治疗性纳米材料装载至中性粒细胞中，得到肿瘤药物递送系统。

[0055] 本发明将治疗性药物先装载于纳米载体中，再将载药纳米载体装载至中性粒细胞中，成功制备了以中性粒细胞为载体的药物递送系统。将所制备的以中性粒细胞为载体的药物递送系统静脉注射到人体内，血液循环过程中，中性粒细胞作为抗肿瘤药物的细胞载体受到肿瘤部位急性炎症区域释放得趋化因子的刺激，穿过血管，沿着趋化因子浓度梯度主动靶向肿瘤部位，中性粒细胞在肿瘤部位大量浸润，肿瘤部位进一步释放炎性细胞因子，进一步招募更多的中性粒细胞及其他免疫细胞，从而显著增强中性粒细胞携带治疗性纳米材料的靶向效率，大大提高肿瘤部位药物积聚浓度，延长药物在人体内的血液半衰期，从而为肿瘤提供精准靶向性治疗。

[0056] 本发明所述治疗肿瘤的药物选用中性粒细胞载治疗性纳米材料作为肿瘤药物递送系统，通过在肿瘤组织内诱导可控性急性炎症，放大肿瘤微环境中的炎性信号，促进中性粒细胞在肿瘤微环境中大量浸润，从而实现其细胞内装载的纳米材料的特异性靶向，利用中性粒细胞为载体来实现更精准的肿瘤靶向治疗，同时利用中性粒细胞控制全身炎症反应的进展，保证治疗的安全性。

[0057] 作为本发明可选的实施方式，所述肿瘤药物递送系统包括中性粒细胞和装载到中性粒细胞内的治疗性纳米材料。所述治疗性纳米材料可以以牛血清白蛋白为纳米载体。所述治疗性纳米材料中的治疗性药物可以为盐酸阿霉素(Doxorubicin，DOX·HCl)。作为本发明可选的实施方式，所述治疗性纳米材料包括纳米载体牛血清白蛋白偶联治疗性药物Doxorubicin形成的球形纳米材料。在本发明中，所述纳米载体牛血清白蛋白偶联治疗性药物Doxorubicin形成的球形纳米材料可以简称为BSA‑DOX。本发明将中性粒细胞载BSA‑DOX的肿瘤药物递送系统可以简称为BSA‑DOX/NEs。

[0058] 本发明提供了上述技术方案所述BSA‑DOX/NEs的制备方法包括：

[0059] 将BSA水溶液与β‑巯基乙醇混合后，可逆性的打开BSA中的二硫键，得到蛋白溶液；

[0060] 将蛋白溶液与DOX·HCl水溶液混合反应后进行超滤，得到BSA‑DOX纳米材料；

[0061] 将中性粒细胞与BSA‑DOX纳米材料混合进行共同孵育，得到BSA‑DOX/NEs。

[0062] 本发明将BSA水溶液与β‑巯基乙醇混合后，可逆性的打开BSA中的二硫键，得到蛋白溶液。本发明将BSA水溶液与β‑巯基乙醇混合主要是利用β‑巯基乙醇松弛BSA的紧凑结构，打开二硫键，暴露出部分疏水结构域，并作为疏水药物结合位点。作为本发明可选的实施方式，所述BSA水溶液中BSA的质量浓度为2mg/mL。本发明将BSA水溶液与β‑巯基乙醇混合时，所述β‑巯基乙醇的体积可以为BSA水溶液体积的0.7％。本发明对所述BSA水溶液与β‑巯基乙醇的混合方式没有特殊限定，采用本领域常规混合方法均可。本发明将所述BSA水溶液与β‑巯基乙醇混合后，搅拌3min，可逆性的打开BSA中的二硫键，得到蛋白溶液。在本发明中，所述搅拌的转速可以为500rpm。

[0063] 得到蛋白溶液后，本发明将蛋白溶液与DOX·HCl水溶液混合反应后进行超滤，得到BSA‑DOX纳米材料。本发明优选调节蛋白溶液为碱性；作为本发明可选的实施方式，所述调节可调节至pH为10。本发明调节蛋白溶液为碱性后，缓慢滴加DOX·HCl水溶液后，反应0.5～1h，超滤，得到BSA‑DOX纳米材料。本发明将蛋白溶液与DOX·HCl水溶液混合后，发生的反应主要为使DOX结合至蛋白的疏水结构域中，进而负载DOX。本发明可以采用摩尔浓度为0.1M的NaOH溶液调节pH。本发明在调节pH时优选缓慢滴加NaOH溶液。本发明优选将pH调节至10。本发明将pH调节至10的主要目的是使蛋白溶液呈碱性，DOX·HCl在碱性条件下变为疏水性药物，进而有利于装载进BSA中。pH调节至10后，本发明在蛋白溶液中缓慢滴加DOX·HCl水溶液。本发明缓慢滴加相应实际的作用主要为防止液体飞溅，保证液体均滴落至反应瓶中。在本发明中，所述DOX·HCl水溶液中DOX·HCl的质量浓度可以为3mg/mL。本发明添加DOX·HCl水溶液时，所述DOX·HCl水溶液的体积与BSA水溶液的体积比可以为1:10。
本发明在缓慢滴加DOX·HCl水溶液的过程中优选伴随搅拌，所述搅拌的转速可以为
500rpm。本发明将所述DOX·HCl水溶液与蛋白溶液混合完全后，在37℃条件下搅拌1h；所述搅拌的转速可以为500～800rpm。反应完成后，本发明优选收集反应产物的上清液，进行超滤，得到BSA‑DOX纳米材料。本发明优选通过离心收集反应产物的上清液；所述离心的转速可以为10000rpm；所述离心的时间可以为10min。得到反应产物的上清液后，本发明对所得上清液进行超滤。在本发明中，所述超滤优选进行3次。在本发明中，每次超滤可以采用30kD的超滤管进行；每次超滤的转速可以为5000rpm；每次超滤的时间可以为10min。超滤完成后，本发明弃掉滤过液，所得截留物为BSA‑DOX纳米材料。本发明通过上述技术方案所述方法制备得到的BSA‑DOX纳米材料的平均粒径为160～180nm；所述BSA‑DOX纳米材料呈球状。

[0064] 得到BSA‑DOX纳米材料后，本发明将中性粒细胞与BSA‑DOX纳米材料混合后，共同孵育1h，得到BSA‑DOX/NEs。本发明优选将中性粒细胞置于培养基中培养后，再将其与BSA‑DOX纳米材料混合。在本发明中，所述中性粒细胞培养用培养基包括无胎牛血清的1640培养基；所述培养的温度可以为37℃；所述培养的时间可以为1h；所述培养可以在5％CO2的细胞培养箱中进行。中性粒细胞培养完成后，本发明将所述BSA‑DOX纳米材料添加至中性粒细胞的培养基中将中性粒细胞与BSA‑DOX纳米材料混合。在本发明中，所述BSA‑DOX纳米材料进行添加时，优选使混合体系中BSA‑DOX纳米材料的质量浓度为5μg/mL。本发明所述共同孵育的温度可以为37℃；所述共同孵育的时间可以为1h；所述共同孵育可以在5％CO2的细胞培养箱中进行。在本发明中，所述共同孵育的过程中，所述中性粒细胞通过内吞作用，将BSA‑DOX纳米材料纳入细胞内，进而得到中性粒细胞载药系统。共同孵育完成后，本发明优选通过离心、清洗和重悬，得到BSA‑DOX/NEs。本发明所述离心的转速可以为1500rpm；所述离心的时间可以为3min。离心完成后，本发明弃上清采用PBS进行清洗；所述清洗的次数可以为3次。本发明通过弃上清和清洗主要是去除游离纳米材料。本发明清洗完成后，最后得到的细胞沉淀优选采用PBS进行重悬。本发明提供的所述BSA‑DOX/NEs的制备方法能够显著提高中性粒细胞对BSA‑DOX纳米材料的摄取量。

[0065] 本发明还提供了上述技术方案所述药物在制备治疗肿瘤药物中的应用。在本发明中，所述肿瘤包括：乳腺癌、急性白血病、恶性淋巴瘤、支气管肺癌、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌和肝癌中的任一种或两种以上。在本发明中，所述乳腺癌包括三阴性乳腺癌。

[0066] 本发明提供了一种肿瘤内急性可控性炎症模型，所述肿瘤内急性可控性炎症模型的构建方法包括：

[0067] 通过在肿瘤内注射LPS构建肿瘤内急性可控性炎症模型。

[0068] 在本发明中，所述肿瘤包括：乳腺癌、急性白血病、恶性淋巴瘤、支气管肺癌、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌和肝癌中的任一种或两种以上。在本发明中，所述乳腺癌包括三阴性乳腺癌。

[0069] 本发明以被治疗对象的体重为标准，所述脂多糖的注射量可以为1mg/kg。作为本发明可选的实施方式，以小鼠肿瘤模型为例，小鼠模型的体重为20g，进行相应的效果验证时，所述小鼠肿瘤内LPS的注射量可以为0.02mg。

[0070] 本发明提供的所述肿瘤内急性可控性炎症模型，首次利用炎性肿瘤微环境，在肿瘤组织内诱导可控性急性炎症，放大肿瘤微环境中的炎性信号。本发明提供的所述肿瘤内急性可控性炎症模型可促进中性粒细胞等肿瘤药物递送系统在肿瘤微环境中大量浸润，从而实现肿瘤药物递送系统内装载的纳米材料的特异性靶向，利用中性粒细胞等为载体来实现更精准的肿瘤靶向治疗，同时利用中性粒细胞控制全身炎症反应的进展，保证治疗的安全性。本发明提供的在肿瘤部位诱导局部的急性炎症以提高肿瘤药物递送系统对肿瘤的靶向性，提高抗肿瘤药物对肿瘤的治疗效果。本发明通过实施例结果表明：通过在三阴性乳腺癌肿瘤内注射LPS，建立肿瘤内急性可控炎症模型。所述肿瘤内急性可控炎症模型可放大肿瘤微环境的炎性信号，在提高肿瘤药物递送系统药物靶向性的同时，可显著提高三阴性乳腺癌的治疗效果。

[0071] 本发明提供了LPS在制备改善肿瘤药物递送系统治疗肿瘤效果的药物中的应用；所述肿瘤药物递送系统包括中性粒细胞和装载到中性粒细胞内的治疗性纳米材料。

[0072] 为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0073] 本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。

[0074] 以下实施例使用的LPS溶液的制备方法：将LPS固体粉末溶于无菌的PBS溶液中，经涡旋充分混匀，制备为0.4mg/mL的LPS溶液。以下实验组小鼠的重量均为20g。

[0075] 实施例1

[0076] 4T1荷瘤小鼠模型肿瘤内可控性急性炎症的建立

[0077] (1)取对数生长的4T1细胞，胰酶消化后1640培养基重悬收集细胞，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)调整细胞密度备用；

[0078] (2)选用BALB/c小鼠建立4T1荷瘤小鼠模型。每只BALB/c小鼠皮下注射(1)所得浓6
度为5×10个/L的4T1细胞悬液0.1mL；

[0079] (3)待(2)建立的荷瘤小鼠模型的皮下肿瘤达到50mm3后，从中取15只小鼠，将小鼠随机分为5组，每组小鼠有3只，其中一组瘤内注射PBS 50μL，其余四组均瘤内注射LPS溶液50μL，LPS溶液中LPS的质量浓度为0.4mg/mL。注射LPS的四组荷瘤小鼠分别于6h、9h、12h、
24h后对其进行安乐死处理，注射PBS的荷瘤小鼠于24h后安乐死处理，取各组小鼠肿瘤组织制备病理切片，进行中性粒细胞表面标志物CD11b的免疫组化染色。

[0080] (4)待(2)建立的荷瘤小鼠模型的皮下肿瘤达到50mm3后，从中取18只小鼠，将小鼠随机分为6组，每组小鼠有3只，其中Control组瘤内注射PBS 50μL，其余组均瘤内注射LPS溶液50μL，LPS溶液中LPS的质量浓度为0.4mg/mL。并且在LPS注射后3h、6h、12h、24h和3d取小鼠肿瘤组织，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)来评估瘤内注射LPS后肿瘤组织中炎性细胞因子的表达水平。

[0081] (5)待(2)建立的荷瘤小鼠模型的皮下肿瘤达到50mm3后，从中取39只小鼠，将小鼠随机分为11组，Control组小鼠有6只，其余每组小鼠有3只，Control组瘤内注射PBS，其余组均瘤内注射LPS溶液50μL，LPS溶液中LPS的质量浓度为0.4mg/mL。并且在LPS注射后分别在试验进行的第30min、3h、6h、9h、12h、24h、3d、6d、9d和14d，取小鼠血液进行血常规检查。Control组血常规检测(3只小鼠)是在瘤内注射PBS后就进行的。Control组(3只小鼠)和LPS组小鼠血生化检查是在14d时进行。

[0082] 中性粒细胞表面标志物CD11b的免疫组化染色结果如图1所示，图1中的标尺为100μm。图1为向小鼠肿瘤内注射LPS后小鼠肿瘤组织中中性粒细胞浸润的免疫组化图。瘤内注射LPS后肿瘤组织中炎性细胞因子的表达水平如图2～3所示。图2为瘤内注射LPS后肿瘤组织中炎性细胞因子CXCL1和CXCL2的表达水平；图3为瘤内注射LPS后肿瘤组织中促炎细胞因子TNF‑α和IL‑6的表达水平。图4为瘤内注射LPS后的血常规图。小鼠血生化检查结果如图5所示。图5为向小鼠肿瘤内注射LPS后血生化图。图中的**表示差异显著，p<0.01，***表示差异极显著，p<0.001，ns表示无显著性差异。

[0083] 如图1所示，注射LPS后荷瘤小鼠肿瘤组织内CD11b的表达显著高于control组，且从6h开始CD11b表达持续增高至12h，24h时肿瘤组织内CD11b表达开始下降。

[0084] 由图2～3可以看出，瘤内注射LPS后，肿瘤组织内中性粒细胞趋化因子CXCL1和CXCL2的表达水平显着增加。促炎细胞因子TNF‑α和IL‑6的表达水平显著增加。因此，LPS的瘤内注射成功诱导了肿瘤内的炎症反应，促进了中性粒细胞的大量积累，有利于静脉给药后中性粒细胞载体在肿瘤部位的精确靶向作用，这些细胞因子的表达水平在瘤内注射LPS后12h达到峰值。

[0085] 由图4可知，瘤内注射LPS后，小鼠的白细胞和粒细胞数量仅有短暂的增加，在注射LPS24h后恢复到正常水平。因此，静脉注射中性粒细胞载体的最佳时间为瘤内注射LPS后12h。

[0086] 图5显示，在瘤内注射LPS14天后评估了荷瘤小鼠的肝肾功能，小鼠的肝肾功能不受损害。虽然LPS可以在肿瘤内诱导所需的急性炎症反应，但防止由LPS引起的全身炎症反应，实现可控的炎症反应却至关重要。

[0087] 实施例2

[0088] (1)BALB/c小鼠脱颈处死后，剥离其股骨及胫骨，在75％酒精中浸泡3min后拿至细胞房操作，使用1mL注射器吸取组织稀释液(北京索莱宝科技有限公司)，轻插入骨髓腔，冲出股骨及胫骨中的骨髓，反复重复此操作，直至骨髓被全部冲出。将冲出的骨髓液小心地平铺到装有中性粒细胞分离液(北京索莱宝科技有限公司)的离心管中，在1100g的条件下离心30min，小心吸取下层环状乳白色细胞层至15mL离心管中，加入细胞洗涤液(北京索莱宝科技有限公司)至10mL，在250g条件下离心10min，弃上清，用细胞洗涤液将细胞沉淀清洗3遍后得到纯净的中性粒细胞。

[0089] (2)按实施例1的方法建立荷瘤小鼠，皮下肿瘤达到50mm3后，将小鼠随机分为6组，每组小鼠有3只，其中一组瘤内注射PBS 50μL，其余五组均瘤内注射LPS溶液50μL，LPS溶液中LPS的质量浓度为0.4mg/mL，注射LPS的5组荷瘤小鼠其中的4组在注射LPS12h后对携带肿5 6 6 6
瘤的荷瘤小鼠通过尾静脉进行5×10 、1×10、2×10、4×10中性粒细胞输注，并测量血清中炎性细胞因子的表达，以确定中性粒细胞输注是否能缓解LPS诱导的全身炎症反应。

[0090] 向小鼠肿瘤内注射LPS后携带肿瘤的荷瘤小鼠进行中性粒细胞输注后血清中炎性细胞因子的表达水平如图6所示。

[0091] 中性粒细胞输血可有效抑制中性粒细胞减少症患者由细菌感染引起的炎症。中性粒细胞可以降低LPS的毒性作用。在瘤内注射LPS12h后对荷瘤小鼠进行中性粒细胞输注，并测量血清中炎症细胞因子的表达，以确定中性粒细胞输注是否能缓解LPS诱导的全身炎症6
反应。由图6可得，每只小鼠输血的中性粒细胞数量达到1×10，血清中促炎细胞因子IL‑6和TNF‑α的表达水平在输血后2h内恢复到正常水平。结果证明LPS可以在肿瘤组织内诱导可控的一过性急性炎症，并且可以被中性粒细胞控制全身炎症的发展。

[0092] 实施例3

[0093] 以中性粒细胞为载体的纳米材料作为治疗肿瘤药物的制备：

[0094] (1)制备BSA‑DOX纳米材料

[0095] 将10mg的牛血清白蛋白BSA溶于5mL去离子水中，得到BSA水溶液，将上述水溶液置于圆底烧瓶中，在37℃，500rpm转速下搅拌数分钟，而后向溶液中加入35μLβ‑巯基乙醇，可逆性的打开BSA中的二硫键，搅拌3min后，向烧瓶中缓慢滴加摩尔浓度为0.1M的NaOH溶液，调整溶液pH至10，然后称取1.5mg的盐酸阿霉素DOX·HCl，溶于500μL的去离子水中，制成3mg/mL的DOX·HCl水溶液，将DOX·HCl水溶液缓慢滴加至搅拌中的溶液中，在37℃水浴继续搅拌1h。随后，10000rpm离心10min，收集上清，用30kD的超滤管，5000rpm的转速超滤三次后弃掉滤过液，上面留下的是最终产物，得到最终产物BSA‑DOX纳米材料。

[0096] 如图7所示，为制备得到的BSA‑DOX纳米材料动态散射水合粒径(DLS)图，该纳米材料的平均粒径为160～180nm；如图8所示，为扫描电镜(SEM)图，可以看出，该BSA‑DOX纳米材料呈球状。

[0097] (2)BSA‑DOX/NEs的制备

[0098] BALB/c小鼠脱颈处死后，剥离其股骨及胫骨，在75％酒精中浸泡3min后拿至细胞房操作，使用1mL注射器吸取组织稀释液(北京索莱宝科技有限公司)，轻插入骨髓腔，冲出股骨及胫骨中的骨髓，反复重复此操作，直至骨髓被全部冲出。将冲出的骨髓液小心地平铺到装有中性粒细胞分离液(北京索莱宝科技有限公司)的离心管中，在1100g的条件下离心30min，小心吸取下层环状乳白色细胞层至15mL离心管中，加入细胞洗涤液(北京索莱宝科技有限公司)至10mL，在250g条件下离心10min，弃上清，用细胞洗涤液将细胞沉淀清洗3遍后得到纯净的中性粒细胞。

[0099] 将上述得到的中性粒细胞置于无胎牛血清(FBS)的1640培养基中，于37℃、5％CO2的细胞培养箱培养1h，然后将制备的纳米材料以5μg/mL的浓度加入到含中性粒细胞的培养6
基中(10mL 1640培养基中含有3×10个中性粒细胞)，充分摇晃后于细胞培养箱中共同孵育1h后取出，离心(1500rpm，3min)后弃上清，去除游离纳米材料，PBS洗三遍，弃上清，最终细胞沉淀用PBS重悬，即得BSA‑DOX/NEs。

[0100] 本实施例获得的BSA‑DOX/NEs经瑞氏‑吉姆萨染色观察其细胞形态，如图9所示，中性粒细胞在摄取纳米材料前后都保持其完整的细胞形态以及分叶核形态。

[0101] 实施例4

[0102] 中性粒细胞在与治疗性纳米材料共同孵育后摄取纳米材料的验证：

[0103] (1)取实施例3制备得到的BSA‑DOX/NEs，计数1×106中性粒细胞，离心弃上清，用1mL 4％组织固定液(北京索莱宝科技有限公司)重悬置于2mL离心管中，将样品放置4℃冰箱内固定20min；

[0104] (2)待固定结束后，将样品于冰箱中取出，离心(1500rpm，3min)弃上清，PBS洗三遍，1mL PBS重悬后向样品中加入2μL4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚Dapi和2μL细胞膜绿色荧光探针Dio染料，将样品避光孵育染色5min；

[0105] (3)待染色结束后，将样品取出，离心弃上清，PBS洗三遍，1mL PBS重悬，将其加到共聚焦皿中，使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)对样品进行观察结果如图10所示。图10为BSA‑DOX/NEs的激光扫描共聚焦显微镜图，标尺为5μm。

[0106] 如图10所示，蓝色荧光为中性粒细胞核，绿色荧光为Dio染色的细胞膜，红色荧光为DOX，通过Merge图可以观察到，DOX已进入到中性粒细胞膜内，并未进入核中，结果表明中性粒细胞已经成功摄取BSA‑DOX纳米材料，也表明BSA‑DOX/NEs的成功制备，离心(1500rpm，3min)后，检测上清液中的BSA‑DOX的量，最终算得中性粒细胞摄取的BSA‑DOX的量为7.921μ
6
g/10细胞。

[0107] 实施例5

[0108] BSA‑DOX/NEs在PMA的刺激下产生中性粒细胞胞外陷阱(NETs)，释放BSA‑DOX对肿瘤细胞产生毒性作用的体外杀伤实验：

[0109] 首先将三阴性乳腺癌细胞4T1(约3000个细胞/孔)接种于96孔板中，于1640细胞培养基中孵育24h。然后按照实施例3制备BSA‑DOX/NEs的方法，将中性粒细胞与不同浓度(0μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL)BSA‑DOX共孵，得到含有不同浓度DOX的BSA‑DOX/NEs。将不同浓度DOX的BSA‑DOX/NEs分别分为两组，分别用和不用PMA(100nM，佛波酯，用来模拟体内炎症部位)预处理4h。然后，将未经PMA处理和PMA处理的BSA‑DOX/NEs以2000rpm离心5min。然后将上清液与4T1细胞一起孵育不同时间(24h、48h)，然后加入MTT溶液，按照标准MTT法检测细胞活力，如图11和图12所示。每个实验组进行3组生物学重复。图11和图12的数据均来自三个独立样本，以平均值±标准差来表示。其中图11为未经PMA处理和PMA处理后不同浓度DOX的BSA‑DOX/NEs对4T1细胞的体外杀伤效果；图12为PMA处理后不同浓度DOX的BSA‑DOX/NEs在24h和48h分别对4T1细胞的体外杀伤效果。

[0110] 图11中的数据来自三个独立样本，以平均值±标准差来表示。图11可以观察到，在孵育48h后，未经PMA处理和经PMA处理过的两组中，随着BSA‑DOX浓度的增加，细胞生存率都在逐渐降低，但经PMA处理得到的上清液对于细胞的杀伤作用更加显著；图12可以观察到，随着孵育时间的延长，细胞生存率逐渐降低。上述实验结果证明BSA‑DOX/NEs在炎症部位会释放更多的BSA‑DOX从而对肿瘤细胞产生杀伤作用，并且时间越长，杀伤作用越强。

[0111] 实施例6

[0112] BSA‑DOX/NEs对于诱导可控性炎症的肿瘤组织的定向趋化性

[0113] (1)取对数生长的4T1细胞，胰酶消化后1640培养基重悬收集细胞，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)调整细胞密度备用；

[0114] (2)选用BALB/c小鼠建立4T1荷瘤小鼠模型。每只BALB/c小鼠皮下注射(1)所得浓6
度为5×10个/L的4T1细胞悬液0.1mL；

[0115] (3)待(2)建立的荷瘤小鼠模型的皮下肿瘤达到50mm3后，将小鼠随机分为2组，1组小鼠瘤内注射LPS(50μL，2mg/mL)，2组小鼠瘤内注射PBS(50μL)；

[0116] (4)取实施例3中的BSA‑DOX/NEs，用细胞膜染料DiD(10μM)孵育10min。用冰冷的PBS洗涤三次。在小鼠瘤内注射LPS或PBS12h后，两组小鼠均通过尾静脉注射DID染色后的6
BSA‑DOX/NEs(给药量为每只小鼠3×10个中性粒细胞)，并在给药12h后收集主要器官进行体外荧光成像。

[0117] 如图13所示，在瘤内注射PBS的乳腺癌小鼠中，BSA‑DOX/NEs主要分布于肝脾。然而，在瘤内注射LPS的炎症可控的乳腺癌小鼠中，与对照组相比，BSA‑DOX/NEs在肝脏内的积累程度显著减少，而在肿瘤组织内的积累程度显著增加。这表明了在肿瘤内诱导可控炎症的重要性，它可以有效地放大炎症信号，显著提高中性粒细胞载体的肿瘤靶向能力。

[0118] 实施例7

[0119] 将BSA‑DOX/NEs应用于4T1荷瘤小鼠模型达到肿瘤抑制效果。

[0120] (1)取对数生长的4T1细胞，胰酶消化后1640培养基重悬收集细胞，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)调整细胞密度备用；

[0121] (2)选用BALB/c小鼠建立4T1荷瘤小鼠模型。每只BALB/c小鼠皮下注射(1)所得浓6
度为5×10个/L的4T1细胞悬液0.1mL；

[0122] (3)待(2)建立的荷瘤小鼠模型的皮下肿瘤达到50mm3后，将小鼠随机分为6组，每组3只小鼠，记为1组、2组、3组、4组、5组和6组。1组，3组和4组瘤内注射PBS(50μL)，2组、5组和6组瘤内注射LPS(50μL，2mg/mL)，在瘤内注射后第12h及第3天后，1组、2组鼠尾静脉注射PBS，3组、5组鼠尾静脉注射BSA‑DOX纳米材料(注射量为：每只20g小鼠注射50μg DOX)，4组、6
6组鼠尾静脉注射BSA‑DOX/NEs细胞载体(注射量为：每只小鼠3×10个细胞)。

[0123] (4)每2天测量一次肿瘤大小，称量一次小鼠体重，肿瘤体积大小由游标卡尺对肿瘤的长宽进行测量而获得，在第14天，将小鼠安乐死。其中，BSA‑DOX纳米材料和BSA‑DOX/NEs细胞载体均按照本发明实施例3制备方法所得。每个试验组进行3组生物学重复。

[0124] 如图14～16所示，其中，图14为荷瘤小鼠分别鼠尾静脉注射PBS，PBS，BSA‑DOX纳米材料，BSA‑DOX/NEs细胞载体，BSA‑DOX纳米材料，BSA‑DOX/NEs细胞载体，其中第1、3、4组瘤内注射PBS，第2、5、6组瘤内注射LPS后，荷瘤小鼠14天内肿瘤体积的变化；图15为荷瘤小鼠分别进行上述处理14天后，各组肿瘤的照片，图16为荷瘤小鼠分别进行上述处理14天后，各组肿瘤的重量。从图14～16可以看出，鼠尾静脉注射PBS的1组的荷瘤小鼠的肿瘤在14内生长迅速；瘤内注射LPS，鼠尾静脉注射PBS的2组荷瘤小鼠，在引起机体自身免疫的条件下，对肿瘤生长仅有较小的抑制作用；瘤内注射PBS，鼠尾静脉注射BSA‑DOX纳米材料的3组荷瘤小鼠，依靠BSA‑DOX的被动靶向作用，肿瘤的生长抑制较2组得到了增加；瘤内注射PBS，鼠尾静脉注射BSA‑DOX/NEs细胞载体的4组荷瘤小鼠，即使加入具有主动靶向作用的中性粒细胞，但肿瘤区域没有足够的炎性因子使大量中性粒细胞迁移至肿瘤部位，因此肿瘤的的生长只获得了进一步的轻微抑制；瘤内注射LPS，鼠尾静脉注射BSA‑DOX纳米材料的5组荷瘤小鼠，在既刺激自身免疫作用，又拥有纳米材料的被动靶向作用之后，肿瘤的生长得到了进一步抑制；瘤内注射LPS，鼠尾静脉注射BSA‑DOX/NEs细胞载体的6组荷瘤小鼠，急性炎症使大量的中性粒细胞载体迁移至肿瘤部位，肿瘤的生长得到了明显的抑制作用。以上实验结果说明了本发明提供的以中性粒细胞为载体的纳米材料所制备的抗肿瘤药物可以达到肿瘤抑制作用。

[0125] 实施例8

[0126] BSA‑DOX/NEs在PMA的刺激下产生中性粒细胞胞外陷阱(NETs)，释放BSA‑DOX对肿瘤细胞产生毒性作用的体外杀伤实验：

[0127] 首先将前列腺癌细胞PC3(约3000个细胞/孔)接种于96孔板中，于1640细胞培养基中孵育24h。然后按照实施例3制备BSA‑DOX/NEs的方法，将中性粒细胞与不同浓度(0μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL)BSA‑DOX共孵，得到含有不同浓度DOX的BSA‑DOX/NEs。将不同浓度DOX的BSA‑DOX/NEs分别分为两组，分别用和不用PMA(100nM，佛波酯，用来模拟体内炎症部位)预处理4h。然后，将未经PMA处理和PMA处理的BSA‑DOX/NEs以2000rpm离心
5min。然后将上清液与PC3细胞一起孵育不同时间(24h、48h)，然后加入MTT溶液，按照标准MTT法检测细胞活力，如图17和图18所示。每个实验组进行3组生物学重复。图17和图18的数据均来自三个独立样本，以平均值±标准差来表示。其中图11为未经PMA处理和PMA处理后不同浓度DOX的BSA‑DOX/NEs对PC3细胞的体外杀伤效果；图12为PMA处理后不同浓度DOX的BSA‑DOX/NEs在24h和48h分别对PC3细胞的体外杀伤效果。

[0128] 图17可以观察到，在孵育48h后，未经PMA处理和经PMA处理过的两组中，随着BSA‑DOX浓度的增加，细胞生存率都在逐渐降低，但经PMA处理得到的上清液对于细胞的杀伤作用更加显著；图18可以观察到，随着孵育时间的延长，细胞生存率逐渐降低。上述实验结果证明BSA‑DOX/NEs在炎症部位会释放更多的BSA‑DOX从而对肿瘤细胞产生杀伤作用，并且时间越长，杀伤作用越强。

[0129] 尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。