技术领域
[0002] 本发明涉及用于诊断CNS疾病的荧光标记。
相关背景技术
[0003] 视网膜评估可以提供关于许多系统性疾病的存在和严重性的信息。例如，凋亡的视网膜细胞的检测(DARC)描述了一种监测视网膜细胞死亡速率的技术，最近完成了诊断青光眼的I期临床试验(科尔迪罗等，2017年)，目前正在一系列神经退行性疾病进行中的II期临床试验，包括青光眼、与年龄有关的黄斑变性、视神经炎和唐氏病(作为阿尔茨海默氏病的模型)。该技术目前包括静脉内施用一种称为Anx776的新型荧光剂，新型荧光剂包含内源蛋白Annexin A5的改良版，其与近红外荧光团Dy‑776荧光结合(科尔迪罗等，2017)。
[0004] DARC利用眼睛的独特光学特性，可以使用荧光标记的人膜联蛋白V衍生物直接观察患者的单神经细胞凋亡。膜联蛋白V是一种人蛋白，其具有在存在钙的条件下与磷脂酰丝氨酸(PS)结合的能力。PS存在于每个细胞的质膜中，但是，凋亡细胞在质膜的外部小叶中表达PS。膜联蛋白V与暴露的PS结合，从而识别细胞凋亡。
[0005] 对于DARC的I期和II期临床试验，Anx776均通过静脉给药。通过共聚焦扫描激光检眼镜(cSLO)成像用于检测视网膜疾病的其他荧光分子也主要通过静脉注射给药。例如，荧光素钠和吲哚菁绿(ICG)通常静脉给药以标记视网膜脉管系统，以识别与年龄相关性黄斑变性(AMD)有关的异常血管生长(血管生成)和渗漏(约齐克等，2005)。
[0006] 静脉给药的使用需要直接的医学监督，意味着除非怀疑可疑病理，否则不会对患者进行常规评估。因此，需要可用于评估视网膜的替代技术，以使患者能够更广泛地进行此类评估，并可能更早地诊断视网膜和神经退行性疾病。
具体实施方式
[0038] 实例a)Anx776鼻内给药后迅速到达循环和视网膜
[0039] 膜联蛋白128以其马来酰亚胺形式与Dy‑776结合，提供了视网膜细胞完整性的标记，记为Anx776。将目前用于临床的Anx776制剂(0.2mg/mL)在装有20mM柠檬酸钠、280mM葡萄糖，pH 6.2的注射用水的缓冲液中，用5kDa MWCO过滤器浓缩25倍至5mg/mL。
[0040] 在体内对浓缩的Anx776(hiAnx776)进行测试。使用已成熟的模型[6]，向玻璃体腔内注射4％DMSO(1μL注射液，PBS缓冲液)以诱导视网膜细胞凋亡，同时向C57BL/6J小鼠鼻内给药hiAnx776(25μL)。图1的[A]‑[B]示出了在治疗前，在基线时视网膜的纯代表性cSLO图像(图1的[A])和DMSO‑侵染(图1的[B])视网膜的代表性cSLO图像。用4％DMSO注射(图1的[D])和鼻内Anx776(图1的[C]和图1的[D])治疗3小时后，对相同的眼睛成像。在经DMSO处理的眼睛中清晰可见DARC斑点(图1的[D])，提供了第一个证据表明：鼻内给药Anx776可以以与静脉内或玻璃体内给药DARC相似的方式，以足以标记凋亡性视网膜细胞的浓度到达视网膜。手动定量DARC点表明：玻璃体内DMSO损伤后眼睛凋亡增加，与先前在模型中玻璃体内注射DARC的观察结果一致(约齐克等，2005)。
[0041] 我们假设Anx776吸入循环后会被系统吸收，进入视网膜。我们用Anx776进行的实验和临床数据证实，静脉内给药后全身性Anx776可以到达视网膜(科尔迪罗等，2017)。
[0042] Anx776可以很容易地配制成冻干粉(用海藻糖作为防冻剂)，其在25℃下避光储存后最多可保留PS结合活性50天(图1的[F])。已经制备了含有至多10mg/mL的Anx776的Anx776粉末，其可以在IN递送之前被再水化，或者作为粉末制剂直接施用。
[0043] b)目前用于诊断视网膜疾病的小荧光分子迅速进入循环系统，足以在鼻内应用后用于诊断
[0044] 已经观察到鼻腔给药后，荧光蛋白Anx776(36kDa)进入循环，我们接下来试图确定目前静脉内给药以诊断视网膜疾病的小荧光分子(荧光素钠和ICG分别为376Da和775Da)是否也可以以这种方式递送。鼻内给药荧光素钠(图2)或ICG(图3)都导致视网膜血管和脉络膜中荧光的快速积累。通过cSLO获得的图像与先前静脉注射相同荧光剂后获得的图像相同(库玛等，2014)。由于局部给药，与系统给药试剂的制剂相比，可能需要更少剂量并起效更快。
[0045] 参考文献
[0046] M.F.Cordeiro,E.M.Normando,M.J.Cardoso,S.Miodragovic,S.Jeylani,B.M.Davis,L.Guo,S.Ours elin,R.A'Hern,P.A.Bloom,Brain 2017,274,61.
[0047] J.J.Jorzik,A.Bindewald,S.Dithmar,F.G.Holz,Retina 2005,25,405.[0048] S.Kumar,Z.Berriochoa,A.D.Jones,Y.Fu,J.Vis.Exp.2014,e51061.
[0049] De Saint‑Hubert M,Prinsen K,Mortelmans L,Verbruggen A,MottaghyFM.Methods.2009Jun；48(2):178‑87
[0050] JF.Tait,C.Smith,FG.Blankenberg.J Nucl Med May 1,2005vol.46no.5 807‑815
