[0001] 本发明涉及一种使用湿式纺丝法连续制造包含无机填料粒子的生物降解性纤维材料的方法、以及用该方法制造的棉絮状的骨再生材料。本发明还涉及用湿式纺丝法制造由包含无机填料的生物降解性纤维构成的无纺布的方法。

[0002] 在骨再生医疗领域中，用聚乳酸作为基质与钙盐粒子(β型‑磷酸三钙、硅溶出型碳酸钙、羟基磷灰石等)复合、并通过静电纺丝法(ES)纤维化而成的材料被用作骨再生材料。骨再生材料一般多以块状或颗粒形状使用，用该方法纺丝而成的由生物降解性纤维构成的骨再生材料具有手术时的成形性好、能够解决从目的部位移动·脱落的担忧的优异特点。
本发明的发明人们通过将采用ES从喷嘴射出的生物降解性纤维用填满乙醇的收集容器接受、并将漂浮于乙醇液中的纤维回收·干燥，成功地实现了棉絮状化(US8853298)。棉絮状的骨再生材料在手术时能够容易地应对任何患部形状，因此在临床上是优良的材料。

[0003] 作为生物降解性纤维的基质树脂，除了聚乳酸以外，还采用PLGA。PLGA是生物吸收性比聚乳酸高、且在FDA被承认安全性的优异的生物降解性树脂。因此，近来采用PLGA作为基质与钙盐粒子复合并通过ES来纤维化。PLGA通过乳酸与乙醇酸共聚而合成，且可以通过调整乳酸与乙醇酸的比率来控制生物降解性。在乳酸85％:乙醇酸15％的PLGA(85:15)与乳酸75％:乙醇酸25％的PLGA(75:25)中，PLGA(75:25)的分解性更高。另一方面，聚乳酸的乳酸中存在结晶性的L体和光学异构体即非晶性的D体，含D体的PDLLA比不含D体而仅为L体的PLLA难结晶化、容易分解。因此，通过使含D体的PDLLA与PGA共聚，可以合成分解性比不含D体的PLGA(PLLGA)高得多的PDLLGA。

[0004] ES可以在纺丝原液中含有成为骨形成因子的无机填料粒子来进行纤维化，因此作为制造由生物降解性纤维构成的骨再生材料的方法是优异的方法。但是，ES需要用于此的特别设备，制造成本高。而且，为了通过ES来纺丝，需要无机粒子在纺丝原液中均匀分散，因此，为了将包含大量无机填料粒子的纤维纺丝，在纺丝原液的制造中需要进行混炼等工序，这进一步提高了制造成本。另外，ES是使施加了高电压的纺丝原液从喷嘴射出、使其电场飞行来进行纤维化的方法，因此，如果采用分子量低的PDLLGA，则难以维持纤维形状，其结果是难以进行采用PDLLGA的生物降解性纤维纺丝。

[0005] 本发明的发明人们除了棉絮状的骨再生材料以外，还开发出使用了采用ES制造的无纺布的细胞培养基材(美国专利号6602999、6639035)，并且判明了采用ES制造的无纺布中，纤维所含的无机粒子在纤维表面露出而发挥出良好的细胞粘接性，可以用作为优异的三维细胞培养基材。但是，其也存在采用ES而随之产生的同样问题。现有技术文献
专利文献

[0006] 专利文献1:美国专利号8853298号专利公报专利文献2:美国专利号6602999号专利公报

[0044] 以下，参照附图详细说明本发明的实施方式。定义

[0045] ＜PLLGA树脂＞本发明中，PLLGA树脂是指通过仅含L体的乳酸与乙醇酸的共聚而合成的PLGA树脂。PLLA与PGA的聚合比率为85:15的称为PLLGA(85:15)，PLLA与PGA的聚合比率为75:25的称为PLLGA(75:25)。PLLGA可以通过提高PGA的比率来提高分解性。用溶剂溶解PLLGA必需使用氯仿等氯系溶剂。

[0046] ＜PDLLGA树脂＞本发明中，PDLLGA树脂是指通过含D体和L体的乳酸与乙醇酸的共聚而合成的PLGA树脂。用于合成PLGA的乳酸中存在结晶性的L体和光学异构体即非晶性的D体，PLA中存在仅由L体构成的聚(L‑乳酸)(PLLA)以及含L体和D体的聚(D‑乳酸)(PDLLA)。PDLLA与PGA的聚合比率为75:25的称为PDLLGA(75:25)。该PDLLA与PGA的共聚物PDLLGA在PLGA中具有特别高的柔软性。PDLLGA可以通过改变PDLLA与PGA的聚合比率来控制降解性。虽然难以从数值上确定PDLLGA中所含的D体的量，但在本发明中，PDLLGA树脂中所含的D体的量为具有通过含D体而使树脂能够在丙酮中溶解的分解性的量就足够了。

[0047] ＜湿式纺丝法＞本发明中，湿式纺丝法是指通过被称为良溶剂的有机溶剂的脱离和不良溶剂的侵入的相互扩散以固化为纤维形态的方法。良溶剂和不良溶剂的选择影响聚合物的固化速度和溶剂的相互扩散，决定了可获得该相互扩散的速度的平衡的纤维形态。本发明的湿式纺丝法的优选实施方式中，进行了包含磷酸钙粒子的PDLLGA树脂经纤维化而形成棉絮状的条件设定和改良。

[0048] ＜良溶剂＞本发明中的良溶剂是指用于溶解生物降解性树脂与磷酸钙粒子的混合物来制备纺丝原液的溶剂。氯仿等氯系有机溶剂的树脂溶解力优异，但具有毒性。而丙酮在溶解性方面劣于氯仿，但不含氯因而对生物体的安全性优异。本发明中所用的PDLLGA树脂可以不需要使用有毒性的氯仿等氯系有机溶剂而使用安全性高的非氯系溶剂丙酮。

[0049] 本发明中，在制备纺丝原液时，在无机填料粒子的粒径为4μm左右的情况下，良溶剂的量优选是相对于无机填料粒子与生物降解性树脂的混合物的重量1的比率为1:0.7～1.3的量。更优选两者为大致1∶1的比率。在本发明的发明人们实施的实验中，如果良溶剂(丙酮)相对于试样(无机填料粒子与生物降解性树脂的混合物)1的重量比大于1.3，粒子容易在纺管中沉淀，在射出初期和后期分散的无机粒子(β‑TCP)的量会发生变化而作为产品变得不均质。反之，如果良溶剂(丙酮)的量少于0.7，则会难以从喷嘴的喷出口压出。良溶剂(丙酮)相对于试样(β‑TCP与PDLLGA树脂的混合物)的量在重量比1:0.7～1.3的范围内时，能够从喷出口压出纺丝原液而在不良溶剂中纤维化。

[0050] 在无机填料粒子的粒径为0.3～0.5μm左右的情况下，良溶剂的量优选是相对于无机填料粒子与生物降解性树脂的混合物的重量1的比率为1:1.15～1.40的量。根据本发明人们用粒径0.4μm的β‑TCP粒子进行的实验，如果丙酮的量相对于试样1以重量比计为1.1，则难以用泵将纺丝原液从纺管中压出。反之，如果丙酮的量相对于试样1以重量比计为1.45，则β‑TCP粒子会随着时间经过而在溶液中沉降·分离。

[0051] <不良溶剂>本发明中，不良溶剂是指作为不溶解生物降解性树脂的溶剂而用于凝固浴液的溶剂。不良溶剂在化学上是指，在特定物质‑溶剂体系中溶质‑溶剂间的相互作用(自由能)小于溶质‑溶质间、溶剂‑溶剂间的相互作用的算术平均值时，该溶剂对于该溶质而言即为不良溶剂，但本发明的方法中所用的不良溶剂以溶解度参数为指标而考虑与有机溶剂的相互扩散的平衡来选择。本发明中，在用PDLLGA作为生物降解性树脂的情况下，可以优选使用不溶PDLLGA的乙醇或水。

[0052] ＜汉森溶解度参数值的偏离度＞本发明的方法中所用的生物降解性树脂、良溶剂、不良溶剂可以以汉森溶解度参数值的偏离度为指标来选择。在良溶剂为丙酮而不良溶剂为乙醇的情况下，用良溶剂溶解生物降解性树脂而制备的纺丝原液从喷嘴的喷出口以纤维状压出而在不良溶剂中固化的速度由汉森溶解度参数值(矢量值)的偏离度决定，而汉森溶解度参数值(矢量值)由丙酮与乙醇的(i)极化性、(ii)氢键合性、iii)分散性的相互作用决定。溶质即聚合物的汉森溶解度参数值应接近良溶剂(例如丙酮)的溶解度参数值。25℃下乙醇的汉森溶解度参数为26.5
1/2 1/2 1/2
δ[(MPa) ])，丙酮的汉森溶解度参数为20.0[(MPa) ])，两者的偏离度为9.8[(MPa) ](参见图4)。在该偏离度下，纺丝原液不会在喷嘴前端急剧固化，因此从喷出口压出的纺丝原液不会产生堵塞。但是，由于乙醇的汉森溶解度参数值接近丙酮的汉森溶解度参数值，因此会有一定程度的聚合物溶解，在以纤维状压出的纺丝原液在乙醇中沉降的过程中无法维持纤维的形状而在中途容易撕碎。而且，由于乙醇的比重与丙酮大致相同，因而在乙醇中从纺丝纤维脱离的丙酮会就此在纤维附近发挥出溶解纺丝纤维的作用，因此存在妨碍纺丝原液的纤维化的问题。

[0053] 在使用丙酮作为良溶剂制备纺丝原液而使用水作为不良溶剂将纺丝原液从喷嘴1/2
以纤维状压出到不良溶剂中时，水的汉森溶解度参数为47.8δ[(MPa) ]，丙酮的汉森溶解
1/2 1/2
度参数为20.0δ[(MPa) ])，两者的偏离度为35.7δ[(MPa) ](参见图4)。水和丙酮相对于PDLLGA的汉森溶解度参数的偏离度明显大于乙醇和丙酮相对于PDLLGA的偏离度。其结果是，从喷嘴压出的纺丝原液在水中急剧固化，因此，如果射出速度与固化达不到平衡，则还没纤维化就在喷嘴前端固化而不能射出从而无法纤维化的情况会经常发生，难以使其稳定地纤维化。另一方面，水的比重比丙酮大得多，所以从纺丝原液溶出的丙酮不会贮留于容器底部，而是上浮到上表面附近。在选择好的条件进行纺丝时，则不会发生纤维彼此再次被丙酮粘在一起等情况，可以形成长的连续纤维。本发明的发明人们对以上现象进行了深思熟虑并继续进行深入研究，完成了一种能够稳定地纺长丝、且所得纤维彼此独立而成为柔软的棉絮状的新型湿式纺丝法，该方法中，将纺丝原液向与良溶剂的汉森溶解度参数的偏离度小的不良溶剂射出、然后使其在尚未完全固化的状态下进入偏离度大于前者的不良溶剂中而使其固化。

[0054] 实施例1(使用乙醇/水作为不良溶剂)使用以下所示的材料和装置。
·β型磷酸三钙(Ca3(PO4)2)：太平化学产业株式会社β‑TPP‑100。
采用粒径1.7mm以下者粉碎至4μm左右而得的材料(β‑TCP粉碎品)。
·用PDLLA:PGA(75:25):PURASORB PDLG 7507、Corbion Purac作为PDLLGA。
·乙醇：岸田化学(キシダ化学)一级纯度99.5％
·丙酮：和光纯药试剂特级纯度99.5+％
·水：纯化水
·纺丝原液压出用入射喷嘴：Termo注射针27G(内径0.2mm、外径0.4mm)
将圆筒状的收集容器(参见图1)用蒸馏水填满到一定高度后，缓慢倒入乙醇。乙醇
3
的比重为789kg/m(20℃)，比水小，因此如果静置，则水和乙醇不会混合。

[0055] 1.纺丝原液的制备将β‑TCP与PDLLGA以7:3的重量比混合并溶解于丙酮中，混合过夜，制备聚合物浓度为20％的纺丝原液。
2.纺丝条件
将湿式纺丝装置的入射针(Termo注射针27G)在收集容器中沿垂直向下的方向设置，以3ml/h的压出速度压出到收集容器的乙醇中。
3.纺丝原液的纤维化
i)从纺管压出的纺丝原液以纤维状入射到收集容器的乙醇中，而不会在喷嘴的喷出口处产生堵塞。
ii)入射到乙醇中的纤维状纺丝原液其表面固化、并在丙酮完全脱离到内部之前入射到填满收集容器的乙醇之下的水中，通过水中而贮留于收集容器底部(参见图2)。
4.棉絮状物的回收
用水对漂浮沉积于收集容器底部的纤维进行清洗，并保持过夜以除去溶剂。然后用吸水片除去水，常温干燥而得到棉絮状的样品。
5.所得样品的纤维性状
i)纤维的直径约为130μm，纤维的截面为大致椭圆形状。
ii)在纤维的表面露出β‑TCP粒子而形成凹凸形状(参见图3)。
发明人们通过将样品浸渍于盐酸中来确认纤维表面露出的β‑TCP粒子是否被树脂层覆盖(如果纤维表面的β‑TCP粒子被树脂层覆盖则β‑TCP粒子不会被盐酸溶解)，结果判明样品的纤维表面露出的β‑TCP粒子未被树脂层覆盖。

[0056] 实施例2(使用丙酮和水的混合液/水作为不良溶剂)使用以下所示的材料和装置。
·β型磷酸三钙(Ca3(PO4)2)：太平化学产业株式会社β‑TPP‑100。
采用粒径1.7mm以下者粉碎成4μm左右而得的材料(β‑TCP粉碎品)。
·用PDLLA:PLGA(75:25)(PURASORB PDLG 7507，Corbion Purac)作为PDLLGA。
·蒸馏水
·丙酮：和光纯药试剂特级纯度99.5+％
·将丙酮和水以重量比8∶2混合并充分搅拌而得者作为第一不良溶剂。
·纺丝原液压出用入射喷嘴：Termo注射针27G(内径0.2mm、外径0.4mm)
·第一不良溶剂(丙酮:水＝8:2的混合溶剂)容器：采用直径15mm、高度50mm的圆筒。
·第二不良溶剂(水)容器：采用直径90mm、高度300mm的圆筒状容器。
将第一不良溶剂容器(筒状)和第二不良溶剂容器(圆筒状)用夹具固定。
将第二不良溶剂容器填满蒸馏水后，将丙酮和水的混合溶剂液缓慢倒入第一不良溶剂容器中。由于比重差，如果静置，则水和混合溶剂不会混合。

[0057] 1.纺丝原液的制备将β‑TCP和PDLLGA以7:3重量比混合并溶解于丙酮中，混合过夜，制备聚合物浓度为20％的纺丝原液。
2.纺丝条件
将注射针(口径27G)垂直向下设置，以3ml/h的压出速率压出到第一不良溶剂(丙酮和水)中。
3.纺丝原液的纤维化
i)从纺管压出的纺丝原液以纤维状入射到收集容器的第一不良溶剂(丙酮和水)中，而不会在喷嘴的喷出口处固化而产生堵塞。
ii)入射到第一不良溶剂(丙酮和水)中的纤维状纺丝原液其表面固化、并在丙酮完全脱离到内部之前入射到填满收集容器之下的第二不良溶剂(水)中，通过水中而贮留于收集容器底部(参见图2)。
4.棉絮状物的回收
纺丝原液中的溶剂丙酮与第一不良溶剂(丙酮与水的混合溶液)中的低浓度的水交换，纺丝原液其表面固化，但不在喷嘴前端固化地顺利流出，在完全交换到内部之前与第二不良溶剂的水接触，就此进行到容器底部而贮留。丙酮由于比重小于水，因此不会贮留于容器底部，而是上浮到上表面附近。其结果是，即使长时间拉丝，纤维彼此也不会再次被丙酮粘在一起，从而得到长纤维。
湿式纺丝后，取出纤维，在吸水片上常温干燥，从而可以得到棉絮状的试样。
5.所得样品的纤维性状
i)纤维的直径约为110μm，纤维的截面为大致圆形。
ii)纤维的表面露出β‑TCP粒子而形成凹凸形状。
发明人们通过将样品浸渍于盐酸中来确认纤维表面露出的β‑TCP粒子是否被树脂层覆盖(如果纤维表面的β‑TCP粒子被树脂层覆盖则β‑TCP粒子不会被盐酸溶解)，结果判明样品的纤维表面露出的β‑TCP粒子未被树脂层覆盖。

[0058] 比较实验1(乙醇100％)实验内容：在与实施例1相同的条件下，仅将乙醇作为不良溶剂填满收集容器，实施纺丝实验。
结果：填充在纺管中的纺丝原液能够从喷嘴的喷出口(27G)以纤维状顺利压出，但在乙醇中无法维持纤维形状而频繁发生撕断。

[0059] 比较实验2(水100％)实验内容：在与实施例1相同的条件下，仅将水作为不良溶剂填满收集容器，实施纺丝实验。
结果：填充在纺管中的纺丝原液在喷嘴的喷出口(27G)堵塞，无法入射到水中的现象频繁发生。

[0060] 以上，以纺丝原液中包含无机填料粒子的实施例对本发明进行了说明，但使用本发明的两种不良溶剂的湿式纺丝法并不限于制作棉絮状物的情况，也可以用作为制作无纺布的方法。