[0001] 本发明涉及分析检测技术领域，尤其是涉及一种二维柱切换高效液相色谱法测定血清中的25‑羟基维生素D的方法。

[0002] 多维液相色谱是液相色谱发展的一个重要方向，它将多个分离机制不同的色谱体系连接起来，提高了色谱系统的分离能力，以满足复杂样品的分离要求。在多维色谱分离手段中，二维色谱分离应用最为常见。二维液相色谱联用技术通常是将分离机理不同而又互相独立的两根色谱柱以串联方式结合组成的液相色谱技术。通过切换阀实现不同色谱柱之间的连接，多根色谱柱与检测器之间的共用，流动相的流向的改变等。依靠切换阀，可以灵活实现流动相的改变和色谱模式的切换，又称柱切换技术。它可以将第一维色谱柱分离出的几个或者全部组分转移到第二维继续进行分析，对两次数据分析结果进行处理和整合。和普通一维液相色谱相比，二维液相色谱可以提供成倍的峰容量，并且通过在线联用的自动化操作，大大简化了样品的前处理过程，特别适合于痕量样品和复杂样品的分析。

[0003] 按转移组分是否直接进入二维中,可分为离线和在线两种方式。离线操作是将前一色谱柱分离的组分人工收集起来，再注入第二根色谱柱进行分析。在线操作是将第一维洗脱馏分中的目标组分直接切换转入第二维系统或者是利用收集切换装置收集第一维组分再进行二次分析。按照切换模式，又可以分为部分和整体切换两种模式，包括简单的中心切割、多组分中心切割和全二维分析。

[0004] 维生素D的主要功能是促进钙、磷在肠道内的吸收，从而维持血钙和血磷的平衡。这对于骨骼的生长发育和牙齿的健康至关重要。此外，维生素D还能够促进肾小管对钙、磷的重吸收，进一步确保钙磷在体内的平衡。因此，维生素D对于预防佝偻病、骨质疏松等骨骼疾病具有显著效果。除了对骨骼的影响外，维生素D还在免疫系统中发挥着重要作用。它能够调节免疫细胞的增殖和分化，增强免疫细胞的活性，从而提高人体的免疫力。研究表明，维生素D的充足摄入有助于降低感染性疾病的风险。此外，维生素D还与多种疾病的发生和发展密切相关。研究发现，维生素D的缺乏与心血管疾病、糖尿病、自身免疫性疾病等多种疾病的发生风险增加有关。然而维生素D在人体内的主要存储形式是25‑羟基维生素D，且占总量的95％以上。因此，25‑羟基维生素D是公认的衡量维生素D营养状态的最佳指标。

[0005] 目前25‑羟基维生素D的检测方法主要有免疫法和色谱法。其中免疫法又分为放射免疫法，酶联免疫吸附法，化学发光免疫测定法，这些免疫法有共同的缺点：测定易受基质、抗体等因素的影响，易导致测定结果准确度较低，且一般不能区分25‑羟基维生素D2与25‑羟基维生素D3，检测范围较窄，批内、批间重复性与精密度存在较大的偏差，并且特异性结合25‑羟基维生素D的抗体与其他维生素的羟化物存在不同程度的反应，影响测定结果。色谱法又分为高效液相色谱法和高效液相‑串联质谱法。高效液相色谱法可以分离25‑羟基维生素D2与25‑羟基维生素D3，同时完成对两者的测定。但是由于25‑羟基维生素D2在血液中的含量远远低于25‑羟基维生素D3，高效液相色谱法的灵敏度不能满足临床对25‑羟基维生素D2的检测需求。高效液相‑串联质谱法的设备成本比较高，经济价值不高。

[0006] 在高效液相色谱法的灵敏度不能满足临床对25‑羟基维生素D2的检测需求的前提下，亟需一种低成本、灵敏度高的、有效的检测血清中25‑羟基维生素D的方法。

[0041] 以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本发明要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本发明的发明作出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。

[0042] 本发明通过二维高效液相色谱系统实现二维柱切换高效液相色谱法测定血清中的25‑羟基维生素D的方法；如图1和图2中所示，二维高效液相色谱系统中包含一维色谱柱13、一维输液泵11、二维色谱柱14、二维输液泵12、自动进样器31、紫外检测器41和六通阀
32；一维色谱柱13和二维输液泵12位于柱温箱51中，该系统还包括放置试验溶剂的溶剂托盘61和放置试验废液的废液桶62。

[0043] 如图2所示，六通阀32包括1‑6六个位，在第一状态下，六通阀1号位与6号位连通，二维输液泵12连接六通阀32的1号位，6号位依次连接二维色谱柱14和紫外检测器41；一维输液泵11连接自动进样器31后继续连接到六通阀32的3号位，六通阀32的3号位连通2号位，2号位连接一维色谱柱13的入口端，一维色谱柱13的出口端与六通阀32的5号位连接，六通阀32的5号位连通4号位，4号位连接到废液桶62中；此时的状态如图2所示；当六通阀32从第一状态转变为第二状态后，六通阀32的1号位与2号位连通；二维输液泵12连接六通阀32的1号位，2号位连接一维色谱柱13的入口端，一维色谱柱13的出口端与六通阀32的5号位连接，
5号位连通6号位，6号位依次连接二维色谱柱14和紫外检测器41。在本发明中，样品经过一维色谱柱13进行浓缩后，使用六通阀32进行柱切换，从第一状态切换至第二状态，被浓缩的样品从一维色谱柱13上转入二维色谱柱14上，进行更进一步的分离，最后完成检测。

[0044] 在本发明中，25‑羟基维生素D2储备液和25‑羟基维生素D3储备液可以通过以下步骤得到：

[0045] 精确称取10mg的25‑羟基维生素D3转移至10mL的容量瓶内，加入甲醇，至25‑羟基维生素D3完全溶解后，再加甲醇定容至10mL，得1.0mg/mL的25‑羟基维生素D3储备液，将其在‑20℃下保存。

[0046] 精确称取10mg的25‑羟基维生素D2转移至10mL的容量瓶内，加入甲醇，至25‑羟基维生素D2完全溶解后，加甲醇定容至10mL，得1.0mg/mL的25‑羟基维生素D2储备液，将其在‑20℃下保存。

[0047] 在本发明中，校准曲线可以通过以下步骤得到：

[0048] 取上述20μL1.0mg/mL的25‑羟基维生素D2储备液，20μL1.0mg/mL的25‑羟基维生素D3储备液，再加入960μL新生牛血清，制得混合工作液1。

[0049] 取100μL混合工作液1，加入900μL新生牛血清，制得混合工作液2。

[0050] 取160μL混合工作液2，加入840μL新生牛血清，制得校准品6号点。

[0051] 取500μL校准品6号点，加入500μL新生牛血清，制得校准品5号点。

[0052] 取500μL校准品5号点，加入500μL新生牛血清，制得校准品4号点。

[0053] 取500μL校准品4号点，加入500μL新生牛血清，制得校准品3号点。

[0054] 取500μL校准品3号点，加入500μL新生牛血清，制得校准品2号点。

[0055] 取500μL校准品2号点，加入500μL新生牛血清，制得校准品1号点。

[0056] 对以上校准品1号点至校准品6号点，构建浓度和峰面积的关系，得到校准曲线。

[0057] 在本发明中，通过二维高效液相色谱系统实现二维柱切换高效液相色谱法测定血清中的25‑羟基维生素D的方法包括以下：

[0058] 步骤1：制备蛋白沉淀剂；蛋白沉淀剂中包含甲醇和乙腈，甲醇和乙腈的体积比为1:9；

[0059] 步骤2：向400μL待检测血清中加入1000μL蛋白沉淀剂，得到混合样品液；

[0060] 步骤3：将混合样品液在10000rpm下离心10min后，得到上清液；

[0061] 步骤4：制备25‑羟基维生素D2储备液、25‑羟基维生素D3储备液；并使用所述25‑羟基维生素D2储备液和25‑羟基维生素D3储备液依次制备混合工作液1和混合工作液2；

[0062] 步骤5：采用二维柱切换高效液相色谱法对步骤4制备的混合工作液2稀释得到的校准品1‑6号点进行检测，得到校准曲线；

[0063] 步骤6：采用所述二维柱切换高效液相色谱法对400μL的上清液进行检测，根据检测结果和步骤5所得的校准曲线，得到待检测血清中的25‑羟基维生素D的含量。根据采集色谱图分析检测结果，25‑羟基维生素D2和25‑羟基维生素D3完全分离，不存在干扰，峰型对称。

[0064] 前述二维柱切换高效液相色谱法的检测条件为：检测定量波长262nm，检测定性波长265nm，柱温40℃；第一维色谱柱采用反相C8硅胶色谱柱，其规格为5μm，ID4.6×50mm；第二维色谱柱采用反相C18硅胶色谱柱，其规格为5μm，ID4.6×150mm。

[0065] 前述二维柱切换高效液相色谱法的实验条件还包括：第一维流动相为20mmol/L磷酸二氢钾水溶液与甲醇形成的混合溶液，其中20mmol/L磷酸二氢钾水溶液占比≥10％；第二维流动相为20mmol/L磷酸二氢钾水溶液与甲醇形成的混合溶液，其中20mmol/L磷酸二氢钾水溶液占比≥5％。

[0066] 下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。若无特殊说明，下文中所述含量均为质量含量。若无特殊说明，理解为在室温下进行。

[0067] 实施例：

[0068] 实施例1：

[0069] 实施例1包括以下步骤：

[0070] 1)取400μL血清加入离心管，加入蛋白沉淀剂1000μL混匀3min，获得混合样本液，所述蛋白沉淀剂为甲醇:乙腈＝1:9(v/v)的混合有机相溶液。

[0071] 2)将离心管置于小型离心机中以10000rpm的转速离心10min，取上清液1000μL置于进样瓶中，获得待测样本。

[0072] 3)精确称取10mg的25‑羟基维生素D3转移至10mL的容量瓶内，加入甲醇，至25‑羟基维生素D3完全溶解后，再加甲醇定容至10mL，得1.0mg/mL的25‑羟基维生素D3储备液，将其在‑20℃下保存。精确称取10mg的25‑羟基维生素D2转移至10mL的容量瓶内，加入甲醇，至25‑羟基维生素D2完全溶解后，加甲醇定容至10mL，得1.0mg/mL的25‑羟基维生素D2储备液，将其在‑20℃下保存。

[0073] 4)取上述20μL的1.0mg/mL的25‑羟基维生素D2储备液，20μL的1.0mg/mL的25‑羟基维生素D3储备液，再加入960μL新生牛血清，制得混合工作液1。取100μL混合工作液1，加入900μL新生牛血清，制得混合工作液2。取160μL混合工作液2，加入840μL新生牛血清，制得校准品6号点。取500μL校准品6号点，加入500μL新生牛血清，制得校准品5号点。取500μL校准品5号点，加入500μL新生牛血清，制得校准品4号点。取500μL校准品4号点，加入500μL新生牛血清，制得校准品3号点。取500μL校准品3号点，加入500μL新生牛血清，制得校准品2号点。取500μL校准品2号点，加入500μL新生牛血清，制得校准品1号点。对以上校准品1号点至校准品6号点，构建浓度和峰面积的关系，如图4所示，并通过测试数据得到校准曲线。从图4中可以看到，25‑羟基维生素D2、25‑羟基维生素D3完全分离，不存在干扰，峰型对称。

[0074] 校准曲线通过下表1和表2所得到的数据得到：

[0075] 表1

[0076]

[0077] 表2

[0078]

[0079] 5)采用二维液相中心切割的模式，将400μL待测样本注入二维液相色谱系统中进行检测；其中第一维流动相为20mmol/L磷酸二氢钾水溶液与甲醇形成的混合溶液，其中20mmol/L磷酸二氢钾水溶液占比为10％；第二维流动相为20mmol/L磷酸二氢钾水溶液与甲醇形成的混合溶液，其中20mmol/L磷酸二氢钾水溶液占比为5％。检测条件为：检测定量波长262nm，检测定性波长265nm，柱温40℃；第一维色谱柱采用反相C8硅胶色谱柱(Supersil C8)，其规格为5μm，ID4.6×50mm；第二维色谱柱采用反相C18硅胶色谱柱(Superesil ODS‑B)，其规格为5μm，ID4.6×150mm。

[0080] 重复测试样品7次，测试本发明所提供的方法的重复性；其结果如图3以及下表3和表4所示：

[0081] 表3

[0082]

[0083] 表4

[0084]

[0085] 从表3和表4，以及图3中可以看到，本公开所提供的方法的重复性很好。

[0086] 对比例1：

[0087] 对比例1的步骤与实施例1相同，不同之处在于，对比例1使用甲醇:乙腈＝9:1(v/v)的混合有机相溶液。对比例1和实施例1对相同血清样品中的25‑羟基维生素D的测试如图5所示。

[0088] 对比例2：

[0089] 对比例2的步骤与实施例1相同，不同之处在于，对比例2使用的一维色谱柱为Supersil C8 5μm，ID4.6×150mm，二维色谱柱为Superesil ODS‑B 5μm，ID4.6×250mm；用于替换实施例1中所使用的一维色谱柱Supersil C8 5μm，ID4.6×50mm，二维色谱柱Superesil ODS‑B 5μm，ID4.6×150mm。对比例2和实施例1对相同血清样品中的25‑羟基维生素D的测试如图6所示。

[0090] 对比例3：

[0091] 对比例3的步骤与实施例1相同，不同之处在于，对比例3使用的第一维流动相为10mmol/L磷酸二氢钾水溶液与甲醇形成的混合溶液，其中10mmol/L磷酸二氢钾水溶液占比为10％；第二维流动相为10mmol/L磷酸二氢钾水溶液与甲醇形成的混合溶液，其中10mmol/L磷酸二氢钾水溶液占比为5％。对比例3和实施例1对相同血清样品中的25‑羟基维生素D的测试如图7所示。

[0092] 从图5至图7，可以看到，对比例1‑3均不能将25‑羟基维生素D2和25‑羟基维生素D3完全分离，峰之间存在干扰。

[0093] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。