[0001] 本发明涉及检测试剂盒、密封液、密封液的保存方法及试样检测方法。

[0002] 本申请基于2022年5月2日在日本提出申请的日本特愿2022‑076057号主张优先权，将其内容援引至此。

[0003] 已知在流体设备内对生物分子进行检测的技术。例如在DNA微阵列技术中，有时通过向微小孔中导入生物分子，进行伴有加热的反应，由此对生物分子进行检测。

[0004] 另外，已知有能够对生物分子进行单分子检测的技术。作为这样的技术，例如可举出：非专利文献1中记载的数字酶联免疫吸附法(ELISA)、数字聚合酶链反应(PCR)、数字侵入性裂解测定(ICA)等数字测量技术。

[0005] 发明人等以前开发了使用具有多个孔(well)的反应容器(流体设备)的数字测量技术(参照专利文献1)。在以前开发的方法中，首先，对流体设备的流路送液包含靶物质的水性介质，将水性介质填充至设置于流路壁面的多个孔中。接下来，对流路送液油性密封液，通过油性密封液对多个孔内的水性介质进行密封。由此，将各孔形成多个独立的反应空间。此外，通过对流体设备进行加热，从而对反应溶液进行加热，进行检测反应，由此进行靶物质的检测。

[0006] 现有技术文献

[0007] 专利文献

[0008] 专利文献1：国际公开第2015/115635号

[0009] 非专利文献

[0010] 非专利文献1：Large‑scale femtoliter droplet array for digital counting of single biomolecules Soo Hyeon Kim,Lab Chip,2012,12,4986‑4991

[0063] 在本说明书中，在将数值范围记载为“1～10μm”的情况下，是指1μm～10μm的范围，是指包含作为下限值的1μm和作为上限值的10μm的数值范围。

[0064] 以下，参照图1～图6对本实施方式的检测试剂盒、密封液、密封液的保存方法及试样检测方法进行说明。此外，在以下的全部附图中，为了使附图容易观察，适当地使各构成要素的尺寸、比率等不同。

[0065] ＜检测试剂盒、密封液、密封液的保存方法＞

[0066] 图1是示出本实施方式的检测试剂盒的立体示意图。图2是检测试剂盒中所含的流体设备的剖视图，是图1的线段II‑II的向视剖视图。

[0067] 检测试剂盒1具备流体设备10、检测试剂L1、以及油性的密封液L2。检测试剂L1及密封液L2分别保存于例如保存容器91、92中。检测试剂盒1用于液态的试样中所含的靶物质的检测。

[0068] 试样是包含靶物质的水溶液，例如包含生物试样、环境试样。作为生物试样，没有特别限制，可举出血清、血浆、尿及细胞培养液等。另外，可以是以生物试样作为模板、且包含染色用试剂作为检测试剂的PCR反应溶液等。此外，作为环境试样，例如可举出：河川的水及工厂排水等。

[0069] 作为靶物质，例如可举出：DNA、RNA、蛋白质、病毒、细胞及外来体等。这里，作为RNA，可举出miRNA及mRNA等。另外，作为细胞，可举出细菌、酵母、动物细胞、植物细胞及昆虫细胞等。

[0070] 检测试剂盒1在流体设备10中使如上所述的试样中所含的靶物质与检测试剂L1进行反应，对靶物质进行检测。此时，在检测试剂盒1中，使用密封液L2形成适于上述靶物质与检测试剂L1的反应的反应场，容易地进行靶物质的检测。

[0071] 以下，依次进行说明。

[0072] [流体设备]

[0073] 如图1及图2所示，流体设备10具有孔板11、盖构件12及壁构件13。流体设备10在内部空间S中收纳试样，作为进行试样中所含的靶物质的检测反应的反应容器使用。

[0074] (孔板)

[0075] 孔板11是呈现俯视矩形或长条状的板状构件。“俯视”是指从孔板的上表面11a的铅直方向观察的视野。在孔板11的上表面11a，在孔板11的长度方向的中央设置有多个孔(也称为微孔)110。

[0076] 微孔110是设置于孔板11的上表面11a的凹部，在上表面11a开口。微孔110是指被上述凹部与假想平面围绕的空间，该假想平面与上表面11a平行且与上表面11a相接。

[0077] 微孔110将收纳于内部空间S的试样收纳于内部，作为试样中所含的靶物质与检测试剂L1的反应场发挥功能。

[0078] 孔板11的材料优选为疏水性。详细而言，构成孔板11的上表面11a的材料与密封液L2的接触角优选为5°～80°。如果通过这样的材料形成孔板11，则上表面11a与密封液L2的接触角成为5°～80°。如果上表面11a的接触角为上述的范围，则在通过后述的方法将密封液导入内部空间S的情况下，存在容易将试样隔离在微孔110中的倾向。

[0079] 此外，上述接触角按照JIS R3257‑1999中规定的静滴法，使用密封液L2来代替水进行测定而求出。

[0080] 具体而言，进行以下的操作。将4μL以下的密封液L2滴加至通过与水平放置的孔板11相同的材料制作的平板的试验片上，制作液滴。对本液滴测定以下的2个值。

[0081] r＝与液滴的试验片相接的面的半径(mm)

[0082] h＝从试验片表面至液滴的顶点的高度(mm)

[0083] 使用所得到的r及h，由下述式(1)计算出接触角θ。θ＝2tan‑1(h/r)

[0084] 孔板11的材料可以具有电磁波透过性，也可以不具有。这里，作为成为透过性判断对象的电磁波，可举出X射线、紫外线、可见光及红外线等。在孔板11具有电磁波透过性的情况下，为了对在具有孔板11的流体设备10中进行的实验结果进行解析，可以利用电磁波。例如，可以从孔板11侧对照射电磁波的结果产生的荧光、磷光等进行测量。此外，“电磁波透过性”是指电波、光、X射线及伽玛射线等能够透过各种波长的电磁波的性质。

[0085] 详细情况在后面叙述，例如，在微孔110中，产生在作为可见光区域的400～700nm的波长范围具有峰的荧光并进行试样检测的情况下，使用至少对于可见光区域的光具有良好的透过性的材料即可。

[0086] 作为具有电磁波透过性的材料，例如可举出玻璃及树脂等。作为树脂，例如可举出：ABS树脂、聚碳酸酯、COC(环烯烃共聚物)、COP(环烯烃聚合物)、丙烯酸树脂、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙酸乙烯酯、PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)及PEN(聚萘二甲酸乙二醇酯)等。这些树脂可以包含各种添加剂，也可以是多个树脂混合而成的聚合物合金。

[0087] 具有电磁波透过性的材料优选实质上不具有自身荧光。实质上不具有自身荧光是指，材料完全不具有试样检测所使用的波长的自身荧光，或者即使具有也微弱至不会影响试样检测的程度。例如，如果是与检测对象的荧光相比为1/2以下、更优选为1/10以下程度的自身荧光，则可以认为是微弱至不会影响试样检测。如果使用这样的材料形成孔板11，则能够在利用了电磁波的试样检测中，提高检测的灵敏度。

[0088] 作为具有电磁波透过性、且不发出自身荧光的材料，例如可举出石英玻璃。作为自身荧光微弱、不会对使用了电磁波的试样检测造成障碍的原材料，可举出低荧光玻璃、丙烯酸树脂、COC(环烯烃共聚物)、COP(环烯烃聚合物)及CPP(Cast Polypropylene、未拉伸聚丙烯)等。

[0089] 孔板11的厚度可以适当决定。在使用荧光显微镜从孔板11侧观察荧光的情况下，孔板11的厚度例如可以为5mm以下，也可以为2mm以下，还可以为1.6mm以下。

[0090] 此外，孔板11的材料优选为气体不透过性的树脂。在本实施方式中，“气体不透过性”使用由下述的定义表示的气体透过系数进行评价。气体透过系数可以基于JIS K 7126‑1：2006“塑料‑膜及片‑气体透过度试验方法‑第一部：差压法”中记载的方法或ISO 15105‑
1：2002，Plastics‑Film and sheeting‑Determination of gas‑transmission rate‑Part 
1：Differential‑pressiure method求出。

[0091] 关于氧透过系数，如果是以下的基准以下的材料，则可以适宜地用作“气体不透过性的树脂”。

[0092] 氧透过系数≤0.1(cm3(stp)·100μm/m2·24hr·MPa)

[0093] 如果孔板11由这样的树脂形成，则在使用了流体设备10的操作及测定中，能够抑制空气(更具体为氧)相对于密封液L2的溶解，容易维持测定精度，因而优选。

[0094] 孔板11可以为仅使用上述材料的单层的构成，也可以为多个材料的层叠体。在对层叠体进行加工而形成孔板11的情况下，具有微孔110的层与支撑该层的层可以为不同的材料。在该情况下，具有微孔110的层的材料优选为容易被水润湿的亲水性(与水的接触角为70°～180°)。

[0095] (微孔)

[0096] 微孔110的形状可以采用各种形状。作为微孔110的形状，例如可例示出圆筒形、椭圆筒形、多边筒形等筒形、圆锥形、棱锥形等锥形、圆锥台及棱锥台等锥台形。在微孔110为锥形或锥台形的情况下，开口直径可以为在孔的深度方向上逐渐减小的形状。

[0097] 微孔110的底部可以为平坦，也可以为曲面(具体而言为凸面、凹面)。

[0098] 在微孔110为圆筒形的情况下，如果俯视下的微孔110的最大直径例如为10nm～100μm，则是优选的，更优选为100nm～50μm，进一步优选为1μm～20μm。另外，如果微孔110的深度例如为10nm～100μm，则是优选的，更优选为100nm～50μm，进一步优选为1μm～20μm。

[0099] 如果微孔110的容量例如为1fL～6nL，则是优选的，更优选为1fL～5pL，进一步优选为1fL～2pL，特别优选为1fL～300fL。如果平均每1个微孔110的容量为这样的范围，则能够适宜地进行在数字PCR、侵入反应等微小空间内进行的酶反应。通过数字PCR，能够进行例如基因的变异检测等。

[0100] 微孔110的容积可以通过使用扫描型电子显微镜、相位差显微镜对微孔110的尺寸进行测定而算出。

[0101] 孔板11具有相同形状相同大小的多个微孔110。相同形状相同大小只要是对于进行数字测量而言要求的程度的相同形状且相同容量即可，如果是制造上的误差程度的偏差，则是允许的。

[0102] 微孔110的密度例如为10万～1000万个/cm2，优选为10万～500万个/cm2，进一步优2
选为10万～100万个/cm。如果微孔110的密度为这样的范围，则将试样封入规定数的微孔
110中的操作容易。另外，用于对实验结果进行解析的孔的观察也容易。

[0103] 例如，使用检测试剂盒1对无细胞的DNA的变异进行测定时，检测对象的变异相对于野生型的存在比例为0.01％左右的情况下，优选使用例如100万～200万个微孔110。

[0104] 图3是示出多个微孔110的一部分的俯视图。如图3所示，在孔板11中，多个微孔110在俯视下为相同形状。此外，为了作为拍摄、设备制造中的对准标记使用，多个微孔中的少数(例如1～4个)可以为不同的形状。

[0105] 另外，多个微孔110规则地配置成矩阵状。这里，微孔110“规则地配置”是指，多个微孔110的开口部的重心彼此以一定的图案配置。

[0106] 例如，微孔110的开口部的重心彼此可以配置成四边格子状。在该情况下，连结相互相邻的4个微孔110的开口部的重心彼此的线形成矩形，优选形成正方形。

[0107] 或者微孔110的开口部的重心彼此可以配置成三角格子状(也称为六边格子状)。在该情况下，连结相互相邻的3个微孔110的开口部的重心彼此的线形成正三角形。

[0108] 多个微孔110中的任意的孔(也称为第一孔)A与最接近孔A的孔(也称为第二孔)B优选满足下述式(1)。

[0109] 0.8≤Da/Dab＜1 (1)

[0110] (Da为孔A的开口部的当量圆直径，Dab为孔A的开口部的重心与孔B的开口部的重心的距离。)

[0111] 孔板11中，Da/Dab的值的下限为0.8，可以为0.83。另外，Da/Dab的值的上限小于1，可以为0.92，也可以为约0.9。这些下限值及上限值可以任意组合。例如，Da/Dab可以为0.8以上且小于1，也可以为0.83～0.92，还可以为0.83～0.9。

[0112] 在满足上述式(1)的情况下，如果多个微孔110配置成三角格子状，则任意的微孔110的开口部的重心与最接近该微孔110的微孔110的开口部的重心之间的距离为恒定。

[0113] 图3所示的微孔110配置成三角格子状。如图3所示，任意的孔A、最接近孔A的孔B、以及最接近孔A及孔B的双方的孔C各自的开口部的重心Ca、Cb、Cc形成为以它们为顶点的正三角形。

[0114] 图3中，连结孔A、孔B及孔C各自的开口部的重心Ca、Cb、Cc的线为正三角形。

[0115] 孔板11中，微孔110的开口部的当量圆直径优选为1μm～50μm。即，微孔110的开口部的当量圆直径的下限优选为1μm。

[0116] 另外，微孔110的开口部的当量圆直径的上限可以小于20μm，也可以为19μm以下，也可以为18μm以下，也可以为17μm以下，也可以为16μm以下，也可以为15μm以下，也可以为14μm以下，也可以为13μm以下，也可以为12μm以下，也可以为11μm以下，还可以为10μm以下。

[0117] 关于微孔110的开口部的当量圆直径，可以将上限值与下限值任意地组合。

[0118] (盖构件)

[0119] 盖构件12在俯视下呈现出与孔板11相同的轮廓形状(也就是长条状)。盖构件12相对于孔板11的上表面11a隔开间隙而相对地配置。

[0120] 盖构件12上具有在厚度方向上贯通的2个贯通孔。2个贯通孔分别设置于盖构件12的长度方向的一端侧和另一端侧。一个贯通孔是在将液态物注入流体设备10的内部空间S时使用的注入口121，另一个贯通孔是在将液态物从内部空间S排出时使用的排出口122。

[0121] 这里，对于“液态物”，除了液态的试样以外，检测试剂、密封液也符合。

[0122] 注入口121、内部空间S及排出口122依次连通，作为整体而形成流路FC。在流体设备10中，使液态物在流路FC中适当流动，进行靶物质的检测反应。在俯视下，在注入口121与排出口122之间配置有多个微孔110。

[0123] 在盖构件12的上表面12a设置有围绕注入口121的周围的筒状的注入港125。注入港125与注入口121连通。注入港125例如在使用填充有液态物的注射器将液态物填充于内部空间时用于注射器的连接。

[0124] 同样，在盖构件12的上表面12a设置有围绕排出口122的周围的筒状的排出港126。排出港126与排出口122连通。排出港126例如在将液态物从内部空间S抽出时用于液态物流动的管的连接。

[0125] 盖构件12的材料可以采用作为上述的孔板11的材料而例示出的材料。盖构件12的材料可以与孔板11的材料相同，也可以不同。

[0126] 另外，盖构件12的材料可以具有电磁波透过性，也可以不具有电磁波透过性。

[0127] 在明视野中观察微孔110的情况下，孔板11与盖构件12中的至少一者具有透光性。

[0128] 盖构件12的材料优选为疏水。详细而言，优选构成面对盖构件12的内部空间S的一面(也就是下表面12b)的材料与密封液L2的接触角为5°～80°。如果通过这样的材料形成盖构件12，则下表面12b与密封液L2的接触角成为5°～80°。如果下表面12b的接触角为上述的范围，则在通过后述的方法将密封液导入内部空间S的情况下，存在容易将试样隔离在微孔110中的倾向。

[0129] (壁构件)

[0130] 壁构件13形成为俯视下闭环状，且沿着孔板11的上表面11a的外缘配置。在图1中，面对壁构件13的内部空间S的壁面在俯视下为大致矩形，宽度在注入口121侧逐渐减小。

[0131] 壁构件13被孔板11和盖构件12夹持而成为一体，由此形成流体设备10。被孔板11、盖构件12以及壁构件13围绕的空间是收纳液态的试样的内部空间S。内部空间S沿着长条状的孔板11在孔板11的长度方向上延伸。

[0132] 壁构件13在作为内部空间S的壁面发挥功能的基础上，还作为孔板11与盖构件12之间的间隔件发挥功能。壁构件13的高度、即内部空间S的高度例如可以为100μm以下。

[0133] 壁构件13的材料没有特别限制，例如可以适宜地使用在芯材膜的两面层叠有丙烯酸系粘合剂的双面粘合带。芯材膜的材料可例示出有机硅橡胶、丙烯酸发泡体。通过使用这样的材料形成壁构件13，能够以液密方式形成内部空间S。

[0134] 另外，壁构件13的材料可以采用与上述的孔板11相同的材料。通过这样的材料形成的壁构件13可以通过利用粘接剂的粘接、或者利用热焊接、超声波焊接、激光焊接等的焊接与孔板11及盖构件12一体化。

[0135] 此外，壁构件13可以与孔板11一体地形成而构成孔板11的一部分。同样，壁构件13可以与盖构件12一体地形成而构成盖构件12的一部分。

[0136] 上述的孔板11可以利用公知的注射成型、微压印技术、纳米压印技术来制造。另外，孔板11也可以利用公知的光刻技术并通过蚀刻形成微孔110来制造。

[0137] 上述的盖构件12可以通过公知的注射成型来制造。

[0138] 在壁构件13与盖构件12一体地形成的情况下，壁构件13可以通过公知的注射成型与盖构件12同时制造。在壁构件13与盖构件12分体的情况下，壁构件13可以通过对在上述的芯材膜的两面层叠有丙烯酸系粘合剂而成的双面粘合带进行剪切来制造。

[0139] [检测试剂]

[0140] 检测试剂L1与靶物质进行反应，用于靶物质的检测。作为检测试剂L1，可举出缓冲物质、酶、底物、抗体、抗体片段等。

[0141] 对于酶而言，例如在靶物质为核酸的情况下，为了进行对于与靶物质相关的模板核酸的酶反应等生物化学反应，根据生物化学反应的内容进行选择。对于模板核酸的生物化学反应例如是在存在模板核酸的条件下发生信号扩增这样的反应。

[0142] 检测试剂L1根据所采用的检测反应而选择。作为具体的检测反应，可举出ICA法、环介导等温扩增(LAMP)法(商标注册)、5’→3’核酸酶法(TaqMan(注册商标)法)、荧光探针法等。

[0143] [密封液、密封液的保存方法]

[0144] 密封液L2优选为油性、且与水性的试样不相互混和、或者不易混和。密封液L2覆盖在内部收纳有试样与检测试剂L1的混合水溶液的微孔110的开口部，具有以使收纳于微孔110的内部的混合水溶液彼此不会相互混合的方式分别地进行密封的功能。

[0145] 密封液L2优选为油。作为油，可以使用氟系油、有机硅系油、烃系油或它们的混合物等。作为具体的密封液，可举出FC‑40、FC‑43、FC‑770、FC‑72及FC‑3283(均为3M公司制)等氟系液体以及KF96(信越化学公司制)。

[0146] 另外，密封液L2也可以使用用于PCR反应等的矿物油等。

[0147] 根据发明人等的研究得知，在为了靶物质的检测而进行加热的情况下，如果在进行加热前的流体设备内注入以一定量以上包含可变成气泡的微小气泡(也称为气泡前体)的密封液，则容易产生会变得妨碍检测反应及观察的气泡。详细而言，认为其原因是在对密封液进行加热时，在密封液中溶解的气体向气泡前体挥发，气泡膨胀，从而生长成能够视觉辨认到的尺寸的气泡。

[0148] 密封液L2的溶解氧量为100mg/L以下，并且溶解氮量为260mg/mL以下。

[0149] 溶解氧量更优选为80mg/L以下，进一步优选为60mg/L以下。溶解氧量越少越优选，理论上可以少至检测极限以下，但出于容易调整，为20mg/L以上即可。溶解氧量的上限值与下限值可以任意地组合。也就是说，溶解氧量可以为20mg/L～80mg/L，也可以为20mg/L～60mg/L。

[0150] 溶解氮量更优选为200mg/L以下，进一步优选为150mg/L以下。溶解氮量越少越优选，理论上可以少至检测极限以下，但出于调整容易，为50mg/L以上即可。

[0151] 溶解氮量的上限值与下限值可以任意地组合。也就是说，溶解氮量可以为50mg/L～200mg/L，也可以为50mg/L～150mg/L。

[0152] 密封液L2的溶解氧量及溶解氮量可以使用气相色谱仪(例如GC‑2014AT、岛津制作所制)在实施例中记载的条件下进行测定。

[0153] 检测试剂盒1中附带的密封液L2优选以在下述条件下进行加热时通过目视未能确认到气泡的方式进行调整。

[0154] (条件)

[0155] (1)在1.5mL微管中加入上述密封液1.5mL并密闭，

[0156] (2)在66℃下加热25分钟，

[0157] (3)目视确认上述密封液中的气泡的有无。

[0158] 如此地进行了调整后的密封液L2密封收纳于保存容器92中。收纳有密封液L2的保2 2
存容器92的内部压力为2.0×10Pa以下。即，密封液被密闭收纳于内部压力为2.0×10Pa以下的保存容器中。内部压力可以使用公知的内压测定器(例如，KDM30(株式会社KRONE制))进行测定。内部压力的下限依赖于保存容器92的耐压性，可以采用各种值。内部压力的下限
4 3
例如可以为1×10Pa以上，也可以为1×10Pa以上。内部压力的上限值与下限值可以任意组
4 2 3 2
合，例如可以为1×10Pa～2.0×10Pa，也可以为1×10Pa～2.0×10Pa。

[0159] 保存密封液L2时，在上述内部压力的状态下密封于保存容器92中，在15℃以上的温度下进行保存。密封液L2的保存温度可以为20℃以上，也可以为30℃以上。另外，密封液L2的保存温度可以为70℃以下，也可以为40℃以下。保存温度的上限值与下限值可以任意地组合。例如，密封液L2的保存温度可以为20℃～70℃，也可以为30℃～40℃。通过在这样的条件下进行保存，能够抑制空气中的氧、氮向密封液L2的再溶解，适宜地进行靶物质的检测。

[0160] 在保存容器92中保管时，为了防止容器内的空气溶入密封液中，优选密封液体积比容器内的空气体积大。密封液体积可以为容器内的空气体积的1.01倍～10倍，优选为1.01倍～5倍，更优选为1.01倍～2倍，更优选为2倍以下。另外，在保存容器92中保管时，相对于容器内的空气与密封液接触的面积，保存容器内的表面积可以为1倍以上。

[0161] 保存容器92的材料选自PE(聚乙烯)、PVC(聚氯乙烯)、PP或PET之类的树脂、金属、及玻璃。在保存容器92的材料为树脂的情况下，更优选为气体不透过性的树脂。

[0162] ＜试样检测方法＞

[0163] 图4～6是本实施方式的试样检测方法的说明图。本实施方式的试样检测方法是对液态的试样中所含的靶物质进行检测的试样检测方法，包括以下的工序。

[0164] (1)对与靶物质进行反应的检测试剂L1和试样的混合水溶液进行调整的工序[0165] (2)使用流体设备10，将混合水溶液导入内部空间S，将混合水溶液填充于微孔110的工序，所述流体设备10具有收纳混合水溶液的内部空间S、与内部空间S连通的注入口121及排出口、以及在内部空间S开口且收纳混合水溶液的多个微孔110

[0166] (3)将密封液L2导入流体设备10，通过密封液L2将混合水溶液密封于微孔110的工序

[0167] (4)对流体设备10进行加热，发生靶物质与检测试剂L1的反应，对靶物质进行检测的工序

[0168] 试样检测方法使用上述的检测试剂盒1进行。

[0169] (1)对混合水溶液进行调整的工序

[0170] 首先，将液态的试样与检测试剂L1混合，对混合水溶液进行调整。混合水溶液中的检测试剂L1的浓度根据所使用的检测试剂L1的种类及检测反应的种类而适当调整。

[0171] 所使用的检测试剂L1可以包含防吸附剂。防吸附剂具有抑制混合水溶液中中所含的靶物质、酶等吸附于构件的功能。作为防吸附剂，可举出表面活性剂、蛋白质。

[0172] 为了容易进行靶物质的检测，可以在混合水溶液的调整之前对试样进行前处理。作为前处理，可举出浓度调整(稀释或浓缩)、利用担载体的担载、2种以上靶物质的结合反应、利用过滤的过滤灭菌、pH调整及利用热处理的靶物质的改性(退火)等。

[0173] (2)将混合水溶液填充于微孔的工序

[0174] 接下来，如图4所示，从注入口121向内部空间S注入包含检测试剂L1的混合水溶液L。如果混合水溶液L在内部空间S(也就是流路FC)流动，则在内部空间S开口的微孔110中也填充混合水溶液L。

[0175] 内部空间S及全部微孔110被混合水溶液L填充后，通过流路FC后的混合水溶液L从排出口122被排出。

[0176] 此时，优选以在1个微孔110的内部填充有1个靶物质的方式预先调整混合水溶液L的浓度。例如，在实施了后述的试样检测方法后，混合水溶液L为高浓度，由此，在成为靶物质的定量困难的结果的情况下，将该结果用作预实验结果，对混合水溶液L进行稀释。

[0177] 通过上述操作，在1个微孔110中填充有1个以下、即0个或1个靶物质。由此，确认了后述的检测反应后的微孔110的数量与靶物质的数量对应，能够以1个为单位进行靶物质的检测，即能够进行数字测量。此外，不需要在全部微孔110中导入靶物质。

[0178] 将靶物质导入微孔110的方法没有特别限制，可以选择与作为检测对象的靶物质相应的适当方法。例如可举出通过自重使靶物质在流体设备10内(具体为流路FC内)沉降、并向微孔分配的方法。

[0179] 另外，可以利用捕捉靶物质的物质(也称为捕捉物)，使捕捉物与不易因自重而沉降的靶物质结合而进行送液。此外，通过预先将捕捉物固定化于微孔，使捕捉物捕捉与混合水溶液L一起送液的靶物质，由此也能够提高靶物质向微孔110的导入效率。

[0180] 捕捉物与靶物质结合的反应可以在任意的时刻进行。例如，可以通过在对混合水溶液进行调整之前，在样品管内使靶物质与捕捉物接触而进行。

[0181] 或者可以在将捕捉物导入微孔110后，将靶物质导入微孔110，在微孔110中使捕捉物与靶物质接触。

[0182] 捕捉物是能够捕捉靶物质的物质。捕捉物例如可以是固相与对于靶物质的特异性结合物质的结合体。

[0183] 作为构成捕捉物的固相，可举出粒子、膜及基板等。另外，对于靶物质的特异性结合物质可以为1种，也可以为2种以上。例如可以为3种，也可以为4种，还可以为5种以上。

[0184] 作为粒子，没有特别限制，可举出聚合物粒子、磁粒子及玻璃粒子等。粒子优选为实施了用于避免非特异性吸附的表面处理后的粒子。另外，为了将特异性结合物质固定化，优选在表面具有羧基等官能团的粒子。更具体而言，可以使用JSR公司制的商品名“Magnosphere LC300”等。

[0185] 另外，例如在使用病毒作为靶物质的情况下，可以使用病毒能够附着的细胞(即，具有病毒受容体的细胞)作为捕捉物。

[0186] (3)将混合水溶液密封于微孔110的工序

[0187] 接下来，如图5所示，从注入口121向流路FC送液密封液L2。送液至流路FC的密封液L2在内部空间S中沿着上表面11a的面方向流动，对送液至流路FC的混合水溶液L中未被收纳于微孔110的混合水溶液L进行冲洗并置换。

[0188] 由此，密封液L2将收纳有包含靶物质的混合水溶液L的多个微孔110分别独立地密封，微孔110成为独立的反应空间。如果流路FC被密封液L2充满，则多余的密封液L2从排出口122被排出。图6示出多个微孔110全部被密封液L2密封、并且流路FC全部被密封液L2置换的状态。

[0189] 注入密封液L2时，在内部空间S中，可以以在密封液L2中不包含气泡的方式缓慢地注入密封液L2。注入密封液L2后，通过目视确认不因注入操作而在密封液L2中包含气泡。

[0190] 此时，所使用的密封液L2优选为上述的检测试剂盒1所附带的密封液L2、特别是氟系油。密封液L2优选以在下述条件下进行加热时通过目视未能确认到气泡的方式进行调整。

[0191] (条件)

[0192] (1)在1.5mL微管中加入上述密封液1.5mL并密闭，

[0193] (2)在66℃下加热25分钟，

[0194] (3)目视确认上述密封液中的气泡的有无。

[0195] 如上所述，密封液L2的溶解氧量为100mg/L以下，并且溶解氮量为260mg/mL以下。

[0196] (4)对靶物质进行检测的工序

[0197] 接下来，对流体设备10进行加热，发生靶物质与检测试剂L1的反应。此时，将微孔110密封的密封液L2如上所述抑制由加热导致的气泡产生。因此，在对靶物质进行检测的工序中，能够抑制密封液L2中的气泡产生，以高精度进行靶物质的检测。

[0198] 对靶物质进行检测的方法可以根据想要检测的靶物质的特性，使用公知的任意检测方法。例如，可以如下所述地进行：首先，根据需要进行将来自靶物质的信号扩增至能够检测的水平的反应(也称为信号扩增反应)，接着利用适当的方法对扩增后的信号进行检测。

[0199] 作为能够在本实施方式的检测方法中使用的信号的例子，可举出荧光、化学发光、显色、电位变化及pH变化等。

[0200] 信号扩增反应例如可以为生物化学反应、更具体为酶反应。作为一例，信号扩增反应是在将包含用于信号扩增的酶的试剂液收纳于孔内的状态下，以可得到期望的酶活性的一定温度条件下、例如60℃以上、优选约66℃将流体设备保持规定时间、例如至少10分钟、优选约15分钟的等温反应。

[0201] 作为信号扩增反应的例子，具体而言，在使用对核酸进行检测的反应的情况下，可举出侵入(注册商标)法等ICA反应、LAMP法(商标注册)、TaqMan(注册商标)法及荧光探针法等。

[0202] 作为信号扩增反应，特别优选使用ICA反应。ICA反应中，通过(1)核酸彼此的互补结合、和(2)通过利用酶的三重链结构的识别及切断这2个反应的循环进行信号扩增。在这样的信号扩增反应中，由除靶物质以外的夹杂物导致的反应循环阻碍的影响小。因此，在微孔110内存在除靶物质以外的各种成分(也就是夹杂物)的情况下，也可以通过使用ICA反应而以良好的精度对靶物质进行检测。

[0203] 例如，在信号扩增反应中使用ICA反应的情况下，混合水溶液L包含ICA反应所需的反应试剂及模板核酸。在反应工序中的生物化学反应为ICA反应的情况下，通过利用等温反应的酶反应，在孔中存在靶物质的情况下，荧光物质从消光物质中游离，由此与激发光对应地发出规定的荧光信号。

[0204] 在信号扩增反应中使用ICA反应的情况下，靶物质与检测试剂的反应温度优选为50℃～99℃。

[0205] 以下，对于ICA反应，更详细地进行说明。

[0206] 图7是对ICA法的一例进行说明的示意图。在图7中示出通过ICA法对作为靶物质的DNA进行检测的状况。

[0207] 作为ICA反应所需的反应试剂，可举出FLAP探针810、FLAP内切核酸酶FEN、荧光底物820、侵入探针(侵入寡核苷酸)830等ICA反应试剂。

[0208] FLAP探针810和侵入探针830是以与作为靶物质的DNA(靶DNA)杂交而与双链核酸140形成FLAP结构的方式设计的核酸片段(寡核苷酸)。

[0209] 荧光底物820是具有发卡结构的荧光物质F与消光物质Q结合而成的核酸片段。在图7所示的荧光底物820中，在核酸片段的5’末端结合有荧光物质F，在从5’末端起几碱基3’侧结合有消光物质Q。消光物质Q抑制荧光物质F的发光。

[0210] 首先，使FLAP探针810和侵入探针830与靶DNA杂交。FLAP探针810和侵入探针830分别在靶DNA的SNP部位重叠1个碱基，形成不稳定的3碱基样结构。其结果是，形成第一FLAP部位811。第一FLAP部位811是FLAP探针810中不与靶DNA杂交的部分。

[0211] 接下来，FEN识别上述3碱基样结构并进行反应。由此，第一FLAP部位811被切断，生成核酸片段811，在混合水溶液L中游离。

[0212] 生成的核酸片段811与荧光底物820杂交。核酸片段811侵入荧光底物820的发卡结构，在SNP部位重叠1个碱基，形成不稳定的3碱基样结构。其结果是，形成第二FLAP部位821。第二FLAP部位821是荧光底物820中不会通过核酸片段811的侵入而杂交的部分。

[0213] 接下来，FEN识别上述3碱基样结构并进行反应。由此，第二FLAP部位821被切断，生成核酸片段821。在图7中，用符号820’示出核酸片段821从荧光底物820被切断后的剩余部分。

[0214] 其结果是，荧光物质F从消光物质Q分离，产生荧光FL。通过对该荧光FL进行检测，能够对靶DNA进行检测。

[0215] 另外，靶物质的检测也可以通过使与靶物质特异性结合的物质(也称为特异性结合物质)与靶物质结合、并对结合后的特异性结合物质进行检测而进行。例如，在靶物质为蛋白质的情况下，可以使用ELISA进行检测。更具体而言，检测例如可以通过利用了FRET的原理的夹心ELISA进行。

[0216] 在进行利用了FRET的原理的夹心法的情况下，首先，准备用第一荧光物质(也称为供体)标记了的第一特异性结合物质(例如抗体)、和通过具有与第一荧光物质的荧光波长重复的吸光波长的第二荧光物质(也称为受体)标记了的第二特异性结合物质。

[0217] 接下来，使靶物质(例如抗原)接触第一特异性结合物质和第二特异性结合物质这两者，形成复合体。如果形成复合体，则供体与受体的距离变近，能够通过供体的激发波长的照射对受体的荧光波长进行检测。或者也可以用核酸片段对特异性结合物质进行标记，通过ICA反应对核酸片段进行检测。

[0218] 作为特异性结合物质，可以使用与后述的对于结构体的特异性结合分子同样的物质、例如抗体、抗体片段、核酸适配体等。为了对与靶物质结合的特异性结合物质进行检测，可以通过例如辣根过氧化物酶(HRP)等酶对特异性结合物质直接或间接地进行标记。在使用2个以上特异性结合物质的情况下，以可相互识别的方式对各个特异性结合分子进行识别。

[0219] 信号的观察方法可以根据观察的信号的种类而选择公知的适当的方法。例如，在进行明视野观察的情况下，在垂直方向上对设置有孔阵列的基材照射白色光。在对荧光信号进行观察的情况下，从孔的底侧向孔内照射与荧光物质对应的激发光，对荧光物质发出的荧光进行观察。对观察到的孔阵列的全部或一部分图像进行拍摄并保存，进行利用计算机系统的图像处理。

[0220] 此外，在密封液L2未能抑制由如上所述地预先加热导致的气泡产生的情况下，可以在使用密封液L2进行密封的工序之前，具有对密封液L2进行脱气的工序。密封液L2的脱气可以采用减压、加热、超声波照射、及它们的组合。

[0221] 根据如上所述的构成的检测试剂盒1，能够抑制气泡的产生，以高精度实施生物分子测量。

[0222] 另外，对于如上所述的构成的密封液而言，为了抑制由加热导致的气泡的产生，可以在检测试剂盒1中使用，以高精度实施生物分子测量。

[0223] 另外，根据如上所述的构成的密封液的保存方法，能够适宜地保存抑制了气泡的产生的密封液。

[0224] 另外，根据如上所述的构成的试样检测方法，能够以高精度实施生物分子测量。

[0225] 以上，参照附图对本发明的优选实施方式的实例进行了说明，但本发明不限定于上述实例。在上述的实例中示出的各构成构件的多种形状、组合等是一个实例，能够在不脱离本发明的主旨的范围内基于设计、方法等进行各种变更。

[0226] 实施例

[0227] 以下，通过实施例对本发明进行说明，但本发明不限定于这些实施例。

[0228] [流体设备的制造]

[0229] 通过注射成型分别制作了环状聚烯烃(产品编号“ZEONOR1020R”、日本瑞翁株式会社制)制的孔板和环状聚烯烃(产品编号“ZEONOR1020R”、日本瑞翁株式会社制)制的盖构件。孔板的厚度为0.6mm。

[0230] 通过注射成型在孔板的一面形成多个微孔。微孔的开口形状设为圆。微孔的尺寸为直径10μm、深度15μm。在基板上的6.0mm×30.0mm的区域中，以使微孔的中心与最接近该微孔的微孔的中心之间的距离成为12μm的方式，以三角格子状配置多个微孔，形成了孔阵列。

[0231] 盖构件与壁构件一体地形成。通过将壁构件的高度调整为30μm，从而将流路的高度设为30μm。

[0232] 接下来，通过激光焊接将孔板与盖构件(壁构件)接合，制作了实施例1及实施例2的流体设备。

[0233] [缓冲液的调整]

[0234] 按照表1的组成对向流体设备送液的水性介质(也就是缓冲液)进行了调整。

[0235] [表1]

[0236] 缓冲液组成

[0237]成分 最终浓度
MgCl2 20mM
Tris pH8.5 50mM
Tween20 0.05％
蒸馏水 剩余

[0238] [溶解气体浓度的测定]

[0239] 通过气相色谱仪对密封液进行测定，通过校准曲线法求出脱气后的密封液的溶解氧浓度及溶解氮浓度。测定时，为了防止由大气导致的污染，用He对GC注入口进行置换。

[0240] 另外，测定试样使用注射器来采集。采集位置设为从液面起深度10mm左右的位置，通过目视且手动地调整为采集位置大致相同。

[0241] (测定条件)

[0242] 使用装置：GC‑2014AT(岛津制作所)

[0243] 预柱：Porapak Q

[0244] 柱：Molecular Sieve 5A

[0245] 载气：He

[0246] 注入口温度：170℃

[0247] 柱温：50℃

[0248] 检测器：热传导检测器(100mA)

[0249] 检测器温度：150℃

[0250] 测定试样量：20μL

[0251] 作为成分的标品，采用真空瓶并使用He气体对以下的标准气体(母气体)进行稀释(2/201)，与试样同样地进行测定，制作了校准曲线。

[0252] (标准气体)

[0253] 氮、氧的混合气体：O2 21％、

[0254] N2 79％、(Kansai Gas First Co.,Ltd.制)

[0255] 各标准气体的注入量如下所述。

[0256] 母气体：20、100、200μL

[0257] 稀释气体：20、100、200μL

[0258] 标准气体的成分质量使用了以下的计算式。

[0259] 成分质量(g)＝成分分子量(g/mol)×标准气体浓度(％)/100×注入量(L)/24.47(L)

[0260] 此外，上述式中的“24.47”是1mol的理想气体在25℃下的体积(单位：L)。

[0261] 在室温状态下保管后的未处理的密封液的溶解气体浓度为氧：120mg/L、氮：260mg/L。

[0262] [实施例1]

[0263] 作为密封液，使用了氟油(Fluorinert FC‑40、SIGMA‑ALDRICH公司制)。

[0264] 通过下述方法对密封液进行了脱气。

[0265] (脱气方法)

[0266] 将密封液50ml放入螺口瓶(SV‑50A、日电理化硝子株式会社制)，使用热板在70℃下加热了2小时。

[0267] 将加热后的密封液冷却至室温，通过上述的方法对溶解气体浓度进行测定，结果为氧：100.0mg/L、氮：260.0mg/L。

[0268] (确认方法)

[0269] 在流体设备的流路中注入表1所示的组成的缓冲液20μL。接下来，在注入了缓冲液的流体设备中注入脱气后的密封液200μL，用密封液对流路内的缓冲液进行了置换。

[0270] 然后，将注入密封液后的流体设备配置于加热至66℃的透明热板(型号：MP‑10DMFH‑PG、株式会社Kitazato Corporation制)上，静置25分钟。

[0271] 使用以下示出的观察器具，在加热状态下对加热后的流体设备的流路内的状况进行观察，通过目视确认气泡的产生有无。

[0272] (观察器具)

[0273] USB相机：CMOS相机(模板：DFK22AUC03、Imaging Source公司制)透镜：Ai Nikkor 105mm f2.5mm(Nikon公司制)

[0274] 照明：金属卤化物灯(型号：LSM210、住田光学公司制)

[0275] [比较例1]

[0276] 使用在室温状态下保管后的未处理的密封液，除此以外，与实施例1同样地确认了气泡的产生有无。图8是示出评价结果的照片。

[0277] 评价的结果是，在使用了比较例1的密封液的流体设备中产生气泡，在使用了实施例1的密封液的流体设备中未产生气泡。

[0278] [实施例2]

[0279] 通过下述方法对密封液进行了脱气。

[0280] (脱气方法)

[0281] 在保持开放状态下将加入有密封液的螺口管瓶50ml放入真空干燥器中。使用旋转2
泵(型号：DW‑120、佐藤真空公司制)对干燥器内进行减压，在初始压力1.6×10 Pa下保管6天。

[0282] 将干燥器内恢复至常压，通过上述的方法对减压后的密封液测定了溶解气体浓度，结果为氧：5.0mg/L、氮：8.6mg/L。

[0283] 使用了脱气后的密封液，除此以外，与实施例1同样地确认了气泡的产生有无。图9是示出评价结果的照片。评价的结果是，在使用了实施例2的密封液的流体设备中未产生气泡。

[0284] 根据以上的结果可知，本发明是有用的。

[0285] 产业上的可利用性

[0286] 根据本发明，可以提供能够抑制气泡的产生、以高精度实施生物分子测量的检测试剂盒。另外，可以提供用于这样的检测试剂盒的密封液、密封液的保存方法、以及使用了这样的检测试剂盒的试样检测方法。

[0287] 符号说明

[0288] 1…检测试剂盒、10…流体设备、91、92…保存容器、110…孔(微孔)、120…孔阵列、121…注入口、122…排出口、A…孔(第一孔)、B…孔(第二孔)、Ca…重心、L…混合水溶液、L1…检测试剂、L2…密封液、S…内部空间