[0001] 本发明涉及抗体医疗领域。具体而言，本发明涉及特异性结合Nectin‑4的抗体或其抗原结合片段以及含有所述抗体或抗原结合片段的试剂盒。此外，本发明涉及编码所述抗体的核酸及包含所述核酸的宿主细胞，以及制备所述抗体的方法。本发明还涉及所述结合Nectin‑4的抗体的诊断和预后用途。

[0002] Nectin‑4(也称为“脊髓灰质炎病毒受体样分子4(PVRL4))是一个分子量约为66KD的I型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族中Nectin家族的成员，其细胞外结构域由三个Ig样结构域(VCC型)组成，与钙粘蛋白一起参与粘附连接的形成和维持。

[0003] Nectin‑4特异性表达于胚胎、胎盘以及肿瘤细胞中，在正常组织器官中不表达或者表达水平极低，是临床上一类经典的肿瘤标志物，也是抗体偶联药物(ADC)的理想靶点。靶向Nectin‑4的抗体偶联药物与肿瘤细胞表面过度表达的Nectin‑4结合，形成ADC‑受体结合物；然后，ADC经靶点介导的内吞作用进入细胞内，之后在溶酶体中被组织蛋白酶切断连TM
接子，释放出毒性小分子，实现肿瘤细胞的特异性杀灭。靶向Nectin‑4的PADCEV (别名：
enfortumab vedotin‑ejfv；中文名：维汀‑恩弗妥单抗)是一种ADC药物，该ADC药物由靶向Nectin‑4蛋白的人IgG1单克隆抗体恩弗妥单抗(enfortumab)与细胞毒制剂MMAE
(monomethyl auristatin E，单甲基奥瑞他汀E，一种微管破坏剂)偶联而成(Pia 
M.Challita‑Eid等(2016)Cancer Res.76(10)：3003‑13)。已获FDA批准用于治疗局部晚期TM
或转移性尿路上皮癌。但是，靶向Nectin‑4的PADCEV 仅用于治疗应用，且不能用于免疫组化(IHC)染色，因此不具有诊断价值。

[0004] 本领域需要特异性识别Nectin‑4的抗Nectin‑4抗体，其能够高灵敏地检测(例如，通过IHC检测)样品中Nectin‑4的存在和/或表达水平，由此来诊断疾病或评估预后，这对于提高癌症患者的生存率、延长生存期、避免过度化疗和提高生存质量有着重大意义。因此，在诊断和预后中使用特异性好、灵敏度高的抗Nectin‑4抗体具有极高的应用价值。

[0045] 在详细描述本发明之前，应了解，本发明不受限于本说明书中的特定方法及实验条件，因为所述方法以及条件是可以改变的。

[0046] I.定义

[0047] 除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0048] 术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。

[0049] 如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。

[0050] 在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。

[0051] 如本文所用，术语“抗体”指结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体的实施方案包括单克隆抗体、多克隆抗体或嵌合抗体。抗体可以属于任何类(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA)。

[0052] 本公开的示例性抗体是包含由链间二硫键交联的以下四条多肽链组成的免疫球蛋白G(IgG)型抗体：两条重链(HC)和两条轻链(LC)。四条多肽链中每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100‑125个或更多个氨基酸的可变区。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区组成。

[0053] VH区和VL区可以进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布较保守的区域，称为构架区(FR)。CDR暴露于蛋白质的表面上并且是抗体的抗原结合特异性的重要区域。每个VH和VL由从氨基端至羧基端按以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4排列的三个CDR和四个FR组成。重链的三个CDR称为“HCDR1、HCDR2和HCDR3”并且轻链的三个CDR称为"LCDR1、LCDR2和LCDR3”。CDR含有大部分与抗原形成特异性相互作用的残基。可以根据熟知的编号方案将氨基酸残基归属至CDR，所述方案包括在Kabat(Kabat等人，“Sequences of Proteins of Immunological Interest(具有免疫学意义蛋白质的序列)，”National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))、Chothia(Chothia等人，“Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins(免疫球蛋白高变区的规范结构)”，Journal of Molecular Biology，196，901‑917(1987)；Al‑Lazikani等人，“Standard Conformations for the canonical structures of 
immunoglobulins(免疫球蛋白规范结构的标准构象)”，Journal of Molecular Biology，
273，927‑948(1997))、North(North等人，“A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations(抗体CDR环构象的新聚类)”，Journal of Molecular Biology,406，228‑
256(2011))或IMGT(自www.imgt.org可获得的ImMunoGeneTic国际数据库；参见Lefranc等人，Nucleic Acids Res.1999；27：209‑212)中描述的那些。

[0054] 然而，应该注意，基于不同的编号方案获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同编号方案下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的编号方案(例如不同的编号方案规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。

[0055] 本发明抗体的CDR可以根据本领域的任何编号方案或其组合人工地评估确定边界。除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。

[0056] “抗原结合片段”是比完整或完全抗体的氨基酸残基数要少的完整或完全抗体的一部分或一段，其能结合抗原或与完整抗体(即与抗原结合片段所来源的完整抗体)竞争结合抗原。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、单链Fab、双体抗体(diabody)、单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)、骆驼Ig、Ig NAR、F(ab)′3片段、双‑scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv")。所述术语还包括经遗传工程改造的形式，例如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)、杂结合抗体(例如双特异性抗体)和其抗原结合片段。更详细的描述也请参见：皮尔斯目录与手册(Pierce Catalog and Handbook)，1994‑1995(皮尔斯化学公司(PierceChemical Co.)，罗克福德(Rockford)，伊利诺伊州(IL))；Kuby，免疫学杂志，第3版，W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.)，纽约，1997。

[0057] 术语“Nectin家族蛋白”与“Nectin家族”可互换地使用，是细胞粘附分子，将相邻细胞之间形成物理连接以实现细胞间的通信、迁移和其他重要的细胞过程。Nectin家族蛋白至少包括Nectin‑1、Nectin‑2、Nectin‑3、Nectin‑4、Nectin‑like‑1、Nectin‑like‑2、Nectin‑like‑3、Nectin‑like‑4、Nectin‑like‑5，其中，Nectin‑4蛋白在健康人体中的表达主要局限于胎盘和胚胎组织。与健康的成人组织相比，许多类型的肿瘤细胞都有Nectin‑4蛋白高表达。Nectin‑4蛋白是一种肿瘤相关抗原。

[0058] 当谈及抗原和抗体时使用的术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗体与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、SPR或生物膜层干涉技术或本领域已知的其他常规结合测定法测定。

[0059] 为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。

[0060] 可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444‑453)算法(在http：//www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http：//www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。

[0061] 还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法，((1989)CABIOS，4：11‑17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。

[0062] 额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。

[0063] 对于多肽序列，“保守性修饰”或“保守的氨基酸修饰”包括对多肽序列的置换、缺失或添加，它们导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。这类保守性修饰的变体相对于本发明的多态性变体、物种问同源物和等位基因而言是附加的并且不排斥它们。以下8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参阅例如，Creighton，Proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守的氨基酸修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。

[0064] 如本文所用，“载体(vector)”表示构建体，其能够将一种或多种所关注的基因或序列递送入宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相关的DNA或RNA表达载体、包囊化于脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。

[0065] 在本发明中术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已经引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的子代。宿主细胞包括“转化子”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞以及由此来源的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸含量上与亲代细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本文包括与在初始转化的细胞中筛选或选择的细胞具有相同功能或生物学活性的突变子代。

[0066] 在本文中，“受试者”、“个体”或“对象”指需要缓解、预防、治疗和/或诊断疾病或病症的动物，优选哺乳动物，更优选是人。哺乳动物还包括但不限于农场动物、竞赛动物、宠物、灵长类、马、犬、猫、小鼠和大鼠。该术语包括具有疾病或处于具有疾病风险的人受试者。

[0067] 来自受试者的“生物样品”指从个体或受试者得到的细胞、组织或体液的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、细针吸出物、支气管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手术标本、循环中的肿瘤细胞、血清、血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤组织切片样品或冷冻的肿瘤样品。

[0068] 术语“参考样品”、“参考细胞”、“参考组织”、“对照样品”、“对照细胞”或“对照组织”是指用于比较目的的样品、细胞、组织或标准品水平。在一个实施方案中，参考样品、参考细胞、参考组织、对照样品、对照细胞或对照组织获自同一受试者或个体的机体的健康和/或非患病部分，为健康和/或非患病组织或细胞。在又一个实施方案中，参考样品、参考细胞、参考组织、对照样品、对照细胞或对照组织获自不是受试者的个体的健康组织或细胞。来自“参考样品”、“参考细胞”、“参考组织”、“对照样品”、“对照细胞”或“对照组织”的Nectin‑4的存在或表达水平称为“参考存在或表达水平”。

[0069] 术语“第一抗体”是指特异性结合生物样品中的Nectin‑4的抗体。术语“第二抗体”是指特异性结合第一抗体，从而在第一抗体和后续试剂(如果需要后续试剂的话)之间形成桥连的抗体。

[0070] 免疫荧光(Immunofluorescence，IF)技术是标记免疫技术中发展最早的一种技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光(黄绿色或橘红色)，可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

[0071] 免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)法是利用抗原抗体特异性反应，对某个特定蛋白纯化富集的方法，主要过程包括捕获和固定。

[0072] 免疫共沉淀(Co‑Immunoprecipitation，Co‑IP)是在免疫沉淀的基础上进行的扩展。Co‑IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的"Protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的Fc片段的现象开发出来的方法。通常将ProteinA/G预先结合在Argarose珠上，使之与含有抗原蛋白的溶液(如细胞裂解液)及针对诱饵蛋白X的抗体反应后，Argarose珠上的Prorein A/G通过抗体吸附诱饵蛋白X，诱饵蛋白X通过与靶蛋白Y相互作用将靶蛋白Y从细胞裂解液中分离出来，从而达到免疫共沉淀的目的。

[0073] II.本发明的特异性结合Nectin‑4的抗体

[0074] 本发明提供了特异性结合Nectin‑4的抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体，例如，其可以来自任何真核克隆、原核克隆或噬菌体克隆。可以通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、B细胞克隆筛选技术、合成技术(例如CDR移植)或本领域已知的其他技术组合产生单克隆抗体。

[0075] 用于产生和纯化抗体的方法是本领域熟知的并且可以在例如Harlow和Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring harbor，N.Y，第5‑8章和第15章，ISBN 0‑87969‑314‑2中找到。例如，可以用人Nectin‑4免疫接种小鼠或兔或其他动物并且可以回收、纯化所产生的抗体，以及使用本领域熟知的常规方法测定氨基酸序列。同样，可以筛选噬菌体文库，从而对数千个Fab片段筛选与人Nectin‑4的相互作用并且可以回收、纯化所产生的相互作用物，以及使用本领域熟知的常规方法测定氨基酸序列。

[0076] 术语“结合Nectin‑4蛋白的抗体”、“结合Nectin‑4的抗体”、“抗Nectin‑4蛋白抗体”、“抗Nectin‑4抗体”、“结合Nectin‑4蛋白的分离的抗体”、“Nectin‑4抗体”和“Nectin‑4蛋白抗体”在本文中可互换地使用，是指这样的本发明的抗体，所述抗体能够以特异地结合Nectin‑4蛋白，由此所述抗体可以用作靶向Nectin‑4蛋白的诊断剂和/或检测剂。

[0077] 本发明的分离的抗Nectin‑4抗体和抗原结合片段特异性结合Nectin‑4蛋白，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：

[0078] (a)所述重链可变区包含SEQ ID NO：5所示的HCDR1或SEQ ID NO：5所示的HCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO：6所示的HCDR2或SEQ ID NO：6所示的HCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO：7所示的HCDR3或SEQ ID NO：7所示的HCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO：8所示的LCDR1或SEQ ID NO：8所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO：9所示的LCDR2或SEQ ID NO：9所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO：10所示的LCDR3或SEQ ID NO：10所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

[0079] (b)所述重链可变区包含SEQ ID NO：15所示的HCDR1或SEQ ID NO：15所示的HCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO：16所示的HCDR2或SEQ ID NO：16所示的HCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO：17所示的HCDR3或SEQ ID NO：17所示的HCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO：18所示的LCDR1或SEQ ID NO：18所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO：19所示的LCDR2或SEQ ID NO：19所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO：20所示的LCDR3或SEQ ID NO：20所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；或

[0080] (c)所述重链可变区包含SEQ ID NO：25所示的HCDR1或SEQ ID NO：25所示的HCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO：26所示的HCDR2或SEQ ID NO：26所示的HCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO：27所示的HCDR3或SEQ ID NO：27所示的HCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO：28所示的LCDR1或SEQ ID NO：28所示的LCDR1的不超过2个氨基酸变化的变体、SEQ ID NO：29所示的LCDR2或SEQ ID NO：29所示的LCDR2的不超过2个氨基酸变化的变体、和SEQ ID NO：30所示的LCDR3或SEQ ID NO：30所示的LCDR3的不超过2个氨基酸变化的变体；

[0081] 其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代，例如，所述氨基酸变化是保守氨基酸取代。所述CDR是根据Kabat编号方案的CDR。

[0082] 在一些实施方案中，本发明的分离的抗Nectin‑4蛋白抗体或抗原结合片段包含：

[0083] (a)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO：3的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：4的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；

[0084] (b)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO：13的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：14的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；或

[0085] (c)重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO：23的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且轻链可变区包含SEQ ID NO：24的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

[0086] 在一些实施方案中，本发明的抗体结合哺乳动物Nectin‑4，例如人Nectin‑4。在一些实施方案中，本发明的Nectin‑4抗体与Nectin‑4的一个或多个胞外结构域结合。

[0087] 在一些实施方案中，本发明的抗体具有以下一个或多个特性：

[0088] (a)在ELISA测定法中测量，具有仅与Nectin‑4特异性结合的能力，与Nectin家族成员Nectin‑1、Nectin‑2、Nectin‑3、Nectin‑like‑1、Nectin‑like‑2、Nectin‑like‑3、Nectin‑like‑4、Nectin‑like‑5均无特异性结合；

[0089] (b)在流式细胞术测定法中测量，具有结合细胞上表达的Nectin‑4分子的能力；

[0090] (c)在Western印迹法中测量，能够特异性检测Nectin‑4蛋白；并且在添加过量的Nectin‑4蛋白时，与膜上Nectin‑4蛋白的结合被抑制；和/或

[0091] (d)在免疫组织化学染色中，特异性染色表达Nectin‑4分子的组织，例如，所述组织选自扁桃体、唾液腺、大脑、小脑、胎盘、膀胱、肺、乳腺、食道、喉、胸腺、心脏、胃、小肠、结肠、直肠、输尿管、卵巢、输卵管、子宫颈、子宫内膜、皮肤、肾脏、前列腺、胰腺、甲状腺、脾脏和肝脏。

[0092] III.本发明的核酸以及包含其的宿主细胞

[0093] 在一方面，本发明提供了编码以上任何Nectin‑4抗体或其抗原结合片段或其任一条链的核酸。在一个实施方案中，提供了包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。

[0094] 本发明还涵盖与以上所述核酸在严格性条件下杂交的核酸或与以上所述核酸相比编码具有一个或多个氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的多肽序列的核酸。

[0095] 在一个实施方案中，提供包含以上所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。

[0096] 一旦已经制备了用于表达的表达载体或DNA序列，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情况下，将细胞在培养基中培育并且筛选适宜的活性。用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法，根据使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞变动或优化。

[0097] IV.本发明的抗体的生产和纯化

[0098] 在一个实施方案中，本发明提供了制备Nectin‑4抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达编码所述Nectin‑4抗体的核酸的条件下培养包含编码所述Nectin‑4抗体的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，以及任选地分离所述Nectin‑4抗体。在某个实施方案中，所述方法还包括从所述宿主细胞或宿主细胞培养物回收Nectin‑4抗体。

[0099] 为了重组产生本发明的抗体，首先分离编码本发明Nectin‑4抗体的核酸，并将所述核酸插入载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序，例如通过使用能够与编码本发明Nectin‑4抗体的核酸特异性结合的寡核苷酸探针进行。

[0100] 如本文所述制备的本发明的抗体可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗体的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。

[0101] V.本发明抗体的活性测定法

[0102] 可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的Nectin‑4抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。

[0103] 在一些实施方案中，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA、Western印迹、FACS等来进行。

[0104] 供任何上述体外测定法使用的细胞包括天然表达Nectin‑4的细胞或经改造而表达Nectin‑4细胞系。所述经改造而表达Nectin‑4细胞系是正常情况下不表达Nectin‑4的、将编码Nectin‑4的DNA转染入细胞之后表达Nectin‑4的细胞系。

[0105] VI.用于诊断和检测的方法和试剂盒

[0106] 在一些实施方案中，本文中提供的任何Nectin‑4抗体可以用于检测Nectin‑4在生物样品中的存在和/或水平。

[0107] 术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测，示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法。在一些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。在一些实施方案中，生物样品来自过度增生性或癌性病灶。

[0108] 在一个实施方案中，提供了用于诊断或检测方法中的Nectin‑4抗体，出于诊断或评估预后的目的，检测和/或评价Nectin‑4的存在和/或水平，例如，旨在确定给定治疗方案的功效。

[0109] 在一个方面，提供检测Nectin‑4在生物样品中的存在和/或水平的方法。在一些实施方案中，所述方法包括检测Nectin‑4蛋白在生物样品中的存在和/或水平。

[0110] 在一些实施方案中，Nectin‑4是人Nectin‑4。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的Nectin‑4抗体在允许Nectin‑4抗体与Nectin‑4结合的条件下接触，并检测在Nectin‑4抗体和Nectin‑4之间是否形成复合物。复合物的形成表示存在Nectin‑4。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，Nectin‑4抗体被用于选择适合利用治疗用Nectin‑4抗体治疗的受试者，例如其中Nectin‑4是用于选择所述受试者的生物标志物。

[0111] 在一个实施方案中，可以使用本发明的抗体诊断表达Nectin‑4蛋白的癌症或肿瘤，例如评价对象中表达Nectin‑4蛋白的实体瘤(例如，多个器官系统的肉瘤和癌，如侵袭食管、肺、乳房、卵巢、淋巴样、胃肠道的(例如，结肠)、肛门、生殖器和生殖泌尿道(例如，肾、膀胱上皮、膀胱细胞、前列腺)、咽、中枢神经系统(例如，脑、神经的或神经胶质细胞)、头和颈、皮肤(例如，黑素瘤)、鼻咽(例如，分化或未分化的转移性或局部复发性鼻咽癌)和胰的那些癌、以及腺癌，包括恶性肿瘤)、血液学癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，例如，多发性骨髓瘤)的治疗或进展、其诊断和/或分期。在一些实施方案中，用抗Nectin‑4抗体诊断的癌可以处于早期、中期或晚期或是转移性癌，例如，包括但不限于表达Nectin‑4蛋白的原位癌、转移性癌。在一些实施方案中，癌选自结肠癌、直肠癌、结直肠癌、食管癌、皮肤癌、尿路上皮癌、卵巢癌、胰腺癌、膀胱癌，非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、乳腺癌、胃癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、黑素瘤、胶质母细胞瘤、肾细胞癌、前列腺癌。

[0112] 在一些实施方案中，提供标记的Nectin‑4抗体。标记包括但不限于被直接检测的标记(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的标记，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。标记的示例性标记包括但32 14 125 3 131
不限于，放射性同位素 P、C、 1、H和 I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，萤光素酶(luceriferase)，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素，2，3‑二‑氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HR)，碱性磷酸酶，β‑半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶解酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，以及利用过氧化氢氧化染料前体的酶如HR，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。

[0113] 在本文中提供的任何发明的一些实施方案中，样品是在用Nectin‑4抗体治疗之前获得的。在一些实施方案中，样品是在癌症已经转移之后获得的。在一些实施方案中，样品是福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的样品。在一些实施方案中，样品是活检(例如芯活检)，手术标本(例如来自手术切除的标本)，或细针吸出物。

[0114] 在一些实施方案中，在治疗之前，例如，在起始治疗之前；或在治疗间隔后的某次治疗之前检测Nectin‑4。

[0115] 在一些实施方案中，本发明提供了诊断受试者的Nectin 4相关疾病，例如，癌症的方法，所述方法包括：

[0116] 1)将来自所述受试者的生物样品与作为捕获剂的本发明的抗Nectin‑4抗体或其抗原结合片段接触，其中所述生物样品是受试者的组织样品、细胞样品或体液样品，例如，肿瘤或健康组织的组织样品、血液、血清、尿液、唾液、组织液样品，例如，肿瘤或健康组织的组织切片(如，石蜡切片或冰冻切片)样品；

[0117] 2)检测本发明的抗Nectin‑4抗体或其抗原结合片段与来自所述受试者的生物样品的结合；和任选地

[0118] 3)测定来自所述受试者的生物样品中Nectin‑4的存在或表达水平，任选地，将来自所述受试者的生物样品中Nectin‑4的存在或表达水平与Nectin‑4的参考存在或表达水平进行比较；

[0119] 检测到Nectin‑4和/或检测到所述样品中Nectin‑4的表达水平显著高于参考水平指示受试者的Nectin‑4相关疾病，例如，癌症；

[0120] 任选地，其中Nectin‑4的存在或表达水平使用免疫组织化学(IHC)方法、Western印迹测定、荧光激活的细胞分选(FACS)测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光(IF)测定和/或免疫共沉淀(Co‑IP)检测。

[0121] 在一些实施方案中，本发明提供了确定受试者使用抗Nectin‑4抗体或者抗Nectin‑4抗体偶联药物(例如，所述抗Nectin‑4抗体是治疗用抗Nectin‑4抗体或其抗原结合片段)治疗的资格的方法，所述方法包括：

[0122] 1)将来自所述受试者的生物样品与作为捕获剂的本发明的抗Nectin‑4抗体或其抗原结合片段接触，其中所述生物样品是受试者的组织样品、细胞样品或体液样品，例如，肿瘤或健康组织的组织样品、血液、血清、尿液、唾液、组织液样品，例如，肿瘤或健康组织的组织切片(如，石蜡切片或冰冻切片)样品；

[0123] 2)检测本发明的抗体或其抗原结合片段与来自所述受试者的生物样品的结合；和任选地

[0124] 3)测定来自所述受试者的生物样品中Nectin‑4的存在或表达水平，任选地，将来自所述受试者的生物样品中Nectin‑4的存在或表达水平与Nectin‑4的参考存在或表达水平进行比较；

[0125] 检测到Nectin‑4和/或检测到所述样品中Nectin‑4的表达水平高于参考水平指示受试者可以使用抗Nectin‑4抗体或者抗Nectin‑4抗体偶联药物(例如，所述抗Nectin‑4抗体是治疗用抗Nectin‑4抗体或其抗原结合片段)治疗；

[0126] 任选地，其中Nectin‑4的存在或表达水平使用免疫组织化学(IHC)方法、Western印迹测定、荧光激活的细胞分选(FACS)测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光(IF)测定和/或免疫共沉淀(Co‑IP)检测。

[0127] 在一些实施方案中，本发明提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括诊断癌症或确定患者用抗Nectin‑4抗体治疗的资格的在先步骤，所述在先步骤包括使用如本文公开的抗Nectin‑4抗体对来自受试者的生物样品进行免疫组织化学(IHC)测定、ELISA测定、流式细胞术(FACS)测定、Western印迹、免疫荧光(IF)测定和/或免疫共沉淀(Co‑IP)，例如，所述在先步骤包括：

[0128] 1)将所述生物样品与作为捕获剂的本发明的抗Nectin‑4抗体或其抗原结合片段接触，其中所述生物样品是受试者的组织样品、细胞样品或体液样品，例如，肿瘤或健康组织的组织样品、血液、血清、尿液、唾液、组织液样品，例如，肿瘤或健康组织的组织切片(如，石蜡切片或冰冻切片)样品；

[0129] 2)检测所述抗体或其抗原结合片段与所述生物样品的结合；和任选地

[0130] 3)测定所述生物样品中Nectin‑4的表达，其中将所述生物样品中Nectin‑4的表达水平与Nectin‑4的参考表达水平进行比较；

[0131] 任选地，其中Nectin‑4的表达水平使用免疫组织化学(IHC)方法、Western印迹测定、荧光激活的细胞分选(FACS)测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光(IF)测定和/或免疫共沉淀(Co‑IP)检测。

[0132] 在一些实施方案中，本发明提供了预后患有癌症的受试者的方法。其中所述患有癌症的受试者已使用抗肿瘤剂治疗，所述抗肿瘤剂包括但不限于代谢抑制剂、抗生素抗癌剂、植物生物碱系抗癌剂、拓扑异构酶抑制剂、抗肿瘤烷化剂、单克隆抗体、ADC等，所述方法包括：

[0133] 1)将来自使用抗肿瘤剂(例如，抗Nectin‑4抗体或者抗Nectin‑4抗体偶联药物(例如，所述抗Nectin‑4抗体是治疗用抗Nectin‑4抗体或其抗原结合片段))治疗后的受试者的生物样品与作为捕获剂的本发明的抗Nectin‑4抗体或其抗原结合片段接触，其中所述生物样品是受试者的组织样品、细胞样品或体液样品，例如，肿瘤或健康组织的组织样品、血液、血清、尿液、唾液、组织液样品，例如，肿瘤或健康组织的组织切片(如，石蜡切片或冰冻切片)样品；

[0134] 2)检测本发明的抗体或其抗原结合片段与来自所述受试者的生物样品的结合；

[0135] 3)测定来自所述受试者的生物样品中Nectin‑4的存在或表达水平，

[0136] 检测到Nectin‑4和/或检测到所述样品中Nectin‑4的表达水平高于参考水平指示不良预后；或者，样品中不存在Nectin‑4或检测到Nectin‑4水平低于参考存在或表达水平表明预后良好，

[0137] 任选地，其中Nectin‑4的存在或表达水平使用免疫组织化学(IHC)方法、Western印迹测定、荧光激活的细胞分选(FACS)测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光(IF)测定和/或免疫共沉淀(Co‑IP)检测。

[0138] 在一些实施方案中，本发明还提供了包含本发明的抗Nectin‑4抗体的试剂盒，以及任选地指导使用该试剂盒的包装插页。

[0139] 在一些实施方案中，提供了一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括：对受试者(例如，样品)(例如，包含癌细胞的受试者样品)检验Nectin‑4的存在，因而确定Nectin‑4值，将Nectin‑4值与对照值(例如健康个体的样品中的Nectin‑4的值)比较，并且如果Nectin‑4值大于对照值，则向受试者施用治疗有效量的任选地与一种或多种其他疗法组合的Nectin‑4抗体(例如，治疗用抗Nectin‑4抗体)，由此治疗肿瘤。

[0140] 描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成限制本发明的保护范围。

[0141] 实施例

[0142] 实施例1.Nectin‑4抗体的制备与测序

[0143] 本发明的Nectin‑4抗体可以通过以下记载的方法来制备。但是，本发明的Nectin‑4抗体的制备方法并不受本实施例记载的方法限定，也可以通过本领域已知的其他方法制备。

[0144] 使用人Nectin‑4片段，例如，含有人Nectin‑4(SEQ ID NO：31)胞外结构域的片段作为免疫用抗原。抗原首次免疫是与弗氏完全佐剂(CFA)一起应用。加强免疫是使用弗氏不完全佐剂(IFA)。皮下施用含抗原的乳剂。

[0145] 1.1.通过杂交瘤方法制备：

[0146] 使用重组Nectin‑4胞外蛋白(参见UniProt数据库登记号Q96NY8，第32‑349位(SEQ ID NO：32)，使用哺乳动物细胞表达系统制备)免疫Balb/c小鼠，当经免疫小鼠血清具有较高的抗Nectin‑4抗体滴度后，无菌取小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，并与SP2/0骨髓瘤细胞融合，融合后的细胞用HAT培养基重悬后，分装至96孔细胞培养板。置37℃，5％CO2培养箱内培养，以形成杂交瘤细胞系。筛选获得免疫组织化学测试最优的Nectin‑4鼠单克隆抗体，命名为MM11。

[0147] 抗体MM11的序列信息如下，重链恒定区为小鼠IgG1型抗体序列，重链可变区和轻链可变区以斜体和下划线示出，根据KABAT命名系统定义的互补决定区(CDR)序列进一步以粗体示出。

[0148] 重链氨基酸序列

[0149]

[0150] 轻链氨基酸序列

[0151]

[0152] 1.2.通过噬菌体展示技术制备：

[0153] 使用重组Nectin‑4胞外蛋白(参见UniProt数据库登记号Q96NY8，第32‑349位)免疫日本大耳白兔。自经免疫兔的血液获得单核的细胞，随后，从单核的细胞提取总RNA，产生Nectin‑4兔抗体的cDNA基因文库。从Nectin‑4兔抗体的cDNA基因文库形成噬菌体文库，实施生物淘洗，筛选到免疫组织化学测试良好的Nectin‑4兔单克隆抗体，分别命名为R012和R036。

[0154] 抗体R012和抗体R036的序列信息如下，重链恒定区为兔IgG抗体序列，重链可变区和轻链可变区以斜体和下划线示出，根据KABAT命名系统定义的互补决定区(CDR)序列进一步以粗体示出：

[0155] 抗体R012

[0156] 重链氨基酸序列

[0157]

[0158]

[0159] 轻链氨基酸序列

[0160]

[0161] 抗体R036

[0162] 重链氨基酸序列

[0163]

[0164] 轻链氨基酸序列

[0165]

[0166] 实施例2.ELISA法检测抗体与Nectin.4及其同家族蛋白的结合力

[0167] 为了验证实施例1获得的Nectin‑4抗体的抗原结合特异性，采用酶联免疫吸附测试法(ELISA)检测了所述抗体与其他Nectin家族蛋白之间是否存在交叉反应。

[0168] Nectin家族蛋白包括如下9种蛋白：Nectin‑1、Nectin‑2、Nectin‑3、Nectin‑4、Nectin‑like‑1、Nectin‑like‑2、Nectin‑like‑3、Nectin‑like‑4、Nectin‑like‑5。具体信息如下：

[0169]

[0170]

[0171] 如下所述实施ELISA测试法：

[0172] 包被：将Nectin‑1、Nectin‑2、Nectin‑3、Nectin‑4、Nectin‑1ike‑1、Nectin‑1ike‑2、Nectin‑like‑3、Nectin‑like‑4、Nectin‑like‑5用包被缓冲液(pH 9.6的碳酸盐缓冲液)分别稀释至5μg/ml，100μl/孔包被96孔板，2‑8℃过夜；

[0173] 封闭：取出板拍干，用PBST以200μl/孔洗板2次，拍干。加入3％BSA/PBST，200μl/孔，室温孵育1.5h实施封闭；

[0174] 加样：取出板拍干，用PBST以200μ1/孔洗板2次，拍干。将实施例1制备的Nectin‑4抗体(抗体MM11、抗体R012、抗体R036)用1％BSA/PBST分别稀释至10μg/m1、1μg/ml、100ng/ml和10ng/ml，以1％BSA/PBST稀释液作为空白对照，以100μl/孔加入96孔板，室温孵育2h；

[0175] 加入第二抗体：取出板拍干，用PBST以200μ1/孔洗板6次，拍干。按照1：20000比例稀释山羊抗小鼠IgG‑HRP(Jackson，目录号：115‑035‑003)或按照1：10000比例稀释山羊抗兔IgG(H+L)抗体‑HRP(ThermoFisher，目录号：31460)，100μ1/孔，室温孵育1h；

[0176] 显色：取出板拍干，用PBST以200μl/孔洗板6次，拍干。以100μl/孔加入TMB底物，室温孵育约5min；

[0177] 终止反应和读板：以100μl/孔加入1mol/LH3PO4终止反应并读板。以650nm为参比波长，读取并记录波长450nm处孔板的吸光度OD450 nm‑OD650 nm。

[0178] ELISA测试结果：

[0179] ELISA测试结果如表1和图1所示，鼠抗体MM11、兔抗体R012和兔抗体R036与重组人Nectin‑4蛋白能够特异性结合，与其他同家族蛋白没有交叉反应。

[0180] 表1.抗体与Nectin‑4蛋白、Nectin同家族蛋白的交叉反应结果

[0181]

[0182]

[0183]

[0184] 实施例3.流式细胞术检测抗体与Nectin‑4表达细胞结合的分析

[0185] 为了验证实施例1获得的Nectin‑4抗体与Nectin‑4表达细胞的结合特异性，采用流式细胞术(FACS)检测了所述抗体与Nectin‑4表达细胞的结合。

[0186] 如下所述实施流式细胞术测试法：

[0187] 细胞处理：

[0188] 人前列腺癌细胞(PC‑3)购自ATCC，其不表达Nectin‑4。使用人前列腺癌细胞(PC‑3)作为阴性对照。

[0189] PC‑3‑Nectin‑4细胞为迈威康公司构建的基因工程改造细胞株，为表达Nectin‑4的PC‑3细胞株。具体而言，将人Nectin‑4全长基因(NCBI基因ID：81607，1533bp)敲入PC‑3细胞并经单克隆细胞筛选得到稳定转染的高表达Nectin‑4的细胞株，经流式细胞术检测确认细胞表面高表达Nectin‑4，并将该细胞株命名为PC‑3‑Nectin‑4细胞。

[0190] 取生长至对数期的PC‑3‑Nectin 4细胞和作为阴性对照的PC‑3细胞，分别经胰酶5
消化后，200g离心5min收集细胞，配制成约5×10 个/ml的细胞密度，分别吸取1ml细胞悬液
5
至流式管中，即5×10个细胞/流式管，然后4℃，350g离心5min，弃上清，并用预冷的PBS清洗两遍，待用。

[0191] 抗体样品稀释与孵育：

[0192] 将抗体MM11、抗体R012和抗体R036用PBS稀释至5μg/ml，分别取200gl抗体稀释液重悬上述各细胞，轻轻混匀，冰上避光孵育，孵育时问为1h。

[0193] 加入荧光第二抗体：

[0194] 将流式管于4℃，350g离心5min，弃上清，每管加入1m1预冷PBS洗涤细胞2遍，然后加入500μl第二抗体，对于抗体MM11，第二抗体为山羊抗小鼠IgG Fc‑FITC(1：200)( Abcam，货号ab150113)；对于抗体R012和抗体R036，第二抗体为山羊抗兔IgG H&L‑Alexa 488(1：2000)(Abcam，货号ab150077)，重悬细胞，冰上孵育60min。于4℃，350g离心5min，弃上清，然后每管加入1ml预冷PBS洗涤细胞2遍，重悬于500μl PBS中。

[0195] 检测：

[0196] 使用流式细胞仪检测各流式管，根据仪器相关操作进行，结果导入相应保存路径中。

[0197] FACS检测结果：

[0198] FACS检测结果如图2所示，使用抗体MM11、抗体R012和抗体R036检测PC‑3‑Nectin4细胞均产生较高的荧光信号，而检测PC‑3细胞无明显的荧光信号。结果表明Nectin‑4抗体MM11、R012和R036均能够特异性识别并结合PC‑3‑Nectin 4细胞上表达的Nectin‑4，且不识别细胞上的其他蛋白。

[0199] 实施例4.Western印迹法检测抗体与Nectin‑4表达细胞裂解物的反应性

[0200] 使用Western印迹法检测实施例1获得的Nectin‑4抗体是否特异性识别Nectin‑4蛋白。此外，在Western印迹法检测时，通过添加过量的Nectin‑4蛋白进行抑制实验，进一步确认实施例1获得的Nectin‑4抗体的特异性。

[0201] 如下所述实施Western印迹法测试法：

[0202] 人前列腺癌细胞(PC‑3)购自ATCC，经流式细胞术检测确认PC‑3细胞不表达Nectin‑4。

[0203] PC‑3‑Nectin‑4细胞为迈威康公司构建的基因工程改造细胞株，为表达Nectin‑4的PC‑3细胞株。具体而言，将人Nectin‑4全长基因(NCBI基因ID：81607，1533bp)敲入PC‑3细胞并经单克隆细胞筛选得到稳定转染的高表达Nectin‑4的细胞株，经流式细胞术检测确认细胞表面高表达Nectin‑4，并将该细胞株命名为PC‑3‑Nectin‑4细胞。

[0204] 蛋白提取：复苏PC‑3‑Nectin 4细胞和PC‑3细胞，在细胞培养箱中分别于细胞培养瓶中生长至合适的细胞密度，弃去培养基，加入提前预冷的PBS清洗两遍。随后加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(Radioimmunoprecipitation assay buffer，放射免疫沉淀法缓冲液)(Thermo，货号89901)裂解细胞，用细胞刮刮下细胞，冰上裂解30min后，12000rpm，4℃，离心10min。取离心后的上清至新的离心管中，BCA法测定蛋白含量并调整至合适的浓度。加入5×上样缓冲液混合均匀后，97℃金属浴加热10min使蛋白完全变性；使用甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶(GAPDH(glyceraldehyde‑3‑phosphate dehydrogenase))作为Westem印迹法的内部参照；

[0205] 电泳：两株细胞裂解物上样量为4.6μg，电泳条件：120V，80min；

[0206] 转膜：采用湿法转膜，湿法转膜条件：0.35A，90min；

[0207] 封闭：使用5％BSA/TBST室温振荡孵育膜1h；

[0208] 加入第一抗体：

[0209] (1)将实施例1制备的Nectin‑4抗体(分别为抗体MM11、抗体R012、抗体R036)用5％BSA/TBST稀释至20ng/ml，作为第一抗体添加，2～8℃振荡孵育膜过夜；或者

[0210] (2)将实施例1制备的Nectin‑4抗体(分别为抗体MM11、抗体R012)用5％BSA/TBST稀释至20ng/ml，作为第一抗体添加；并加入200μg/ml重组人源Nectin‑4(迈威康公司，Lot：20210101)预孵育1h，然后2～8℃振荡孵育膜过夜；

[0211] 加入第二抗体：复温30min后，TBST洗膜3次，每次5min，将作为第二抗体的山羊抗小鼠IgG‑HRP(Jackson，目录号：115‑035‑003)用5％BSA/TBST按1：50000比例稀释，室温振荡孵育1h；或者将作为第二抗体的山羊抗兔IgG(H+L)抗体‑HRP(ThermoFisher，目录号：31460)用5％BSA/TBST按1：25000比例稀释，室温振荡孵育1h；

[0212] 显色：第二抗体孵育完成后，TBST洗膜3次，每次5min，加入1：1配好的ECL发光液显色，采集发光信号。

[0213] Western印迹法测试结果：

[0214] Western印迹法结果如图3所示，其中作为内部参照的GAPDH的检测条带大约在36kDa处，保证了实验结果的准确性和可靠性。在Nectin‑4阳性表达的细胞中可以发现与抗体MM11、抗体R012、抗体R036结合的特异性条带，而在Nectin‑4阴性表达的细胞中没有特异性条带。

[0215] Nectin‑4阳性表达的细胞中与抗体MM11、抗体R012结合的特异性条带在加入过量的重组Nectin‑4蛋白后消失，说明抗Nectin‑4抗体能够特异性与人Nectin‑4蛋白结合。

[0216] 实施例5.Nectin‑4兔单克隆抗体的免疫组织化学染色

[0217] 选择多个肿瘤组织和正常人体组织样本，经中性福尔马林固定后，制备成石蜡组织切片。其中正常人体组织包括多个来源的组织器官；肿瘤组织包括：3例膀胱癌，2例肺癌和3例乳腺癌组织。

[0218] 使用抗Nectin‑4单克隆抗体检测组织样本中Nectin‑4的表达情况，以商品化Nectin‑4兔单抗(购自abcam，克隆号：EPR15613‑68)为阳性对照。所有抗体使用抗体稀释液稀释到工作浓度后使用，抗体稀释液购自迈杰转化医学研究(苏州)有限公司，货号P010A01。在全自动免疫组织化学染色系统(Leica BOND III)检测免疫组织化学染色情况，具体程序如下表所示。

[0219] 表2.Nectin‑4兔单克隆抗体的免疫组织化学染色程序

[0220]

[0221] 注：过氧化物酶灭活试剂、山羊抗兔IgG‑polymer HRP、DAB显色试剂、苏木素染色液均包含在Leica的BOND Polymer Refine Detection试剂盒中，货号DS9800，所有试剂均已稀释至工作浓度，直接使用即可。

[0222] 免疫组织化学染色结果如表3、图4、图5、图6和图7所示，在不同Nectin‑4表达水平的正常组织和肿瘤组织上，EPR15613‑68、R012和R036这三个抗体表现基本一致，靶蛋白Nectin‑4定位于细胞膜和/或细胞浆上，符合文献报告的蛋白定位，而且不产生非特异性染色。正常组织中胎盘的滋养层细胞、皮肤的上皮和扁桃体的隐窝上皮呈明显的Nectin‑4染色阳性，其余正常组织器官基本呈阴性。大部分肿瘤组织中肿瘤细胞呈Nectin‑4阳性，小部分呈Nectin‑4阴性，而肿瘤组织中的正常细胞呈Nectin‑4阴性。

[0223] 表3.Nectin‑4兔单克隆抗体在正常人体组织上的免疫组织化学染色结果

[0224]

[0225]

[0226] 实施例6.Nectin‑4鼠单克隆抗体的免疫组织化学染色

[0227] 选择多个肿瘤组织和正常人体组织样本，经中性福尔马林固定后，制备成石蜡组织切片。其中正常人体组织包括多个来源的组织器官；肿瘤组织包括：3例前列腺癌，3例肺癌和3例三阴性乳腺癌组织。使用抗Nectin‑4单克隆抗体检测组织样本中Nectin‑4的表达情况，以鼠单抗M22‑321b41.1为阳性对照，M22‑321b41.1是已申请专利的Nectin‑4鼠单克隆抗体，专利公开号为CN111051345A，所有抗体使用抗体稀释液稀释到工作浓度后使用，抗体稀释液购自迈杰转化医学研究(苏州)有限公司，货号P010A01。在全自动免疫组织化学染色系统(Leica BOND III)检测免疫组织化学染色情况，具体程序如下表所示。

[0228] 表4.Nectin‑4鼠单克隆抗体的免疫组织化学染色程序

[0229]

[0230] 注：过氧化物酶灭活试剂、兔抗鼠Post‑primary、山羊抗兔IgG‑polymer HRP、DAB显色试剂、苏木素染色液均包含在Leica的BOND Polymer Refine Detection试剂盒中，货号DS9800，所有试剂均已稀释至工作浓度，直接使用即可。

[0231] 免疫组织化学染色结果如表5、图8、图9、图10和图11所示，在正常组织上，抗体M22‑321b41.1和抗体MM11表现基本一致，正常组织中部分个体的唾液腺和皮肤上皮呈微弱的Nectin‑4染色阳性，扁桃体隐窝上皮和肺部的支气管呈明显的Nectin‑4阳性，其余正常组织器官基本为阴性。大部分肿瘤组织中肿瘤细胞呈Nectin‑4阳性，而肿瘤组织中的正常细胞呈Nectin‑4阴性。在不同Nectin‑4表达水平的肿瘤组织上，抗体MM11和抗体M22‑321b41.1染色后，靶蛋白Nectin‑4均定位于细胞膜和/或细胞浆上，符合文献报告的蛋白定位，而且不产生非特异性染色。在部分肿瘤组织中，尤其是三阴性乳腺癌上，抗体MM11的染色信号明显强于抗体M22‑321b41.1。

[0232] 表5.Nectin‑4鼠单克隆抗体在正常人体组织上的免疫组织化学染色结果

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[0234] 以上描述了本发明的示例性实施方案，本领域技术人员应当理解的是，这些公开内容仅是示例性的，在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此，本发明不限于文中列举的具体实施方案。

[0235] 示例性序列

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