[0002] 本发明涉及抗体药物领域，具体涉及抗独特型抗体及其应用。

[0003] B7‑H3(又称CD276)是一种I型跨膜蛋白，属于B7配体家族成员，在多数癌症类型中都会过度表达，但是在正常组织中低水平表达。B7‑H3主要表达于纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞等非免疫细胞表面，以及激活的APC、NK细胞表面，研究表明，B7‑H3在黑色素瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤表面过表达，与肿瘤的生长、转移、复发和预后不良密切相关，越来越多的人开始关注这个靶点在肿瘤免疫治疗中的应用价值。

[0004] 抗独特型抗体(anti‑idiotypic antibody)是指针对抗体分子可变区上特异抗原表位群(独特型)的抗体，能够特异性识别并结合另一抗体独特位点(Idiotype)。在抗体类药物开发过程中，有两项检测是以抗独特型抗体为主要工具试剂：1)抗独特型抗体因为特异性结合表位不同，可用于检测血液中各种类型抗体药物的含量(游离型、结合型和总量)，从而在抗体类药物的药代动力学(PK)和药效学(PD)分析中起着重要作用；2)抗独特型抗体作为抗药抗体(Anti‑drug antibodies，ADA)检测的阳性对照，在免疫原性(immunogenicity)评估中也发挥着重要作用。

[0005] 目前，还没有均一性好，结合力强、特异性高的抗独特型抗体应用于药物研发领域。

[0140] 本发明公开了抗独特型抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0141] 一、抗独特型抗体的制备

[0142] 1、动物免疫和抗体制备

[0143] 胃蛋白酶(公司Sigma，货号P6887)酶切抗B7‑H3人源化单抗(迈威(上海)生物科技股份有限公司生产，其重链具有如SEQ ID No.89所示的氨基酸序列，其轻链具有如SEQ ID No.90所示的氨基酸序列)，去除抗体的Fc区域，制备得到F(ab)2样品。将获得的F(ab)2样品作为免疫动物的免疫原，对5只Balb/c小鼠进行免疫，每只免疫3次，每次周期为3周。免疫后的小鼠血清与相应的免疫原要有特异性结合，抗血清效价应在1:10,000以上。

[0144] 选取免疫小鼠中效价最高的1‑2只小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。扩增培养杂交瘤细胞，取上清以ELISA检测效价；选取针对抗B7‑H3人源化单抗呈阳性且针对无关人IgG呈阴性的细胞进行克隆为保证杂交瘤细胞株的阳性率和抗体的稳定产生，进行3‑4次克隆，每次克隆间隔1‑2周，3‑4次均为100％阳性克隆后，细胞扩大培养后接种到小鼠中制备腹水，获得抗独特型抗体。在克隆过程中通过间接ELISA方法检测杂交瘤上清的特异性，即上清中的鼠单抗仅结合抗B7‑H3人源化单抗，而不结合无关人IgG，最终获得4株独特性单克隆抗体，结果见表1。

[0145] 表1杂交瘤上清特异性鉴定结果

[0146]

[0147] 2、靶点竞争性和非竞争性测试

[0148] 对杂交瘤细胞所产生的4株独特性单克隆抗体进行检测，应该分别满足以下条件：

[0149] 1)靶点非阻断型抗体：以ELISA方法检测，识别抗B7‑H3抗体，不识别对照human IgG，不能阻断抗B7‑H3抗体与B7‑H3的结合(ELISA板包被抗原，抗B7‑H3抗体与所制备的抗独特型抗体孵育后加入ELISA板，使用抗人IgG二抗进行检测，信号值与未加入抗独特型抗体孵育组(PBS组)相比没有降低)；或

[0150] 2)靶点阻断型抗体：以ELISA方法检测，识别抗B7‑H3抗体，不识别对照humanIgG，可以阻断抗B7‑H3抗体与B7‑H3的结合(ELISA板包被抗原，抗B7‑H3抗体与所制备的抗独特型抗体孵育后加入ELISA板，使用抗人IgG二抗进行检测，信号值与未加入抗独特型抗体孵育组(PBS组)相比有显著降低)。

[0151] 结果如表2所示，通过比较加入抗体组与未加入抗体组OD值差异，判断抗独特型抗体的靶点阻断性。S‑412‑8和S‑401‑2为靶点阻断型抗体，S‑322‑4和S‑255‑11为靶点非阻断型抗体。

[0152] 表2杂交瘤上清特异性鉴定结果

[0153]

[0154]

[0155] 二、抗独特型抗体的测序

[0156] 1、实验流程

[0157] 扩大培养杂交瘤细胞，提取细胞总RNA，反转录获得cDNA。PCR扩增获得抗体的重链和轻链可变区基因，测序并进行序列的生物信息学分析，剔除非功能的抗体基因。抗体按照其来源的杂交瘤细胞克隆命名，重链和轻链的氨基酸序列如下所示。重链和轻链的可变区以下划线示出，根据KABAT命名系统定义的重链和轻链的CDR区(互补决定区)以高亮示出。

[0158] 2、测序结果

[0159] 1)、S‑412‑8完整抗体序列

[0160] S‑412‑8抗体重链序列的CDR区：

[0161] CDR1(SEQ ID No.1)：NYGMN；

[0162] CDR2(SEQ ID No.2)：WINPYTGEPTYADDFKG；

[0163] CDR3(SEQ ID No.3)：RKYGNYYVMDY；

[0164] S‑412‑8抗体重链序列的FR区：

[0165] FR1(SEQ ID No.4)：QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFT

[0166] FR2(SEQ ID No.5)：WVRQTPGKGLKWMG

[0167] FR3(SEQ ID No.6)：RFAFSLDTSASTAFLQINNLTNEDMTTYFCAR

[0168] FR4(SEQ ID No.7)：WGQGTSVTVSS

[0169] 信号肽(SEQ ID No.8)：MDWLWNLLFLMAAAQSAQA

[0170] S‑412‑8抗体重链序列的可变区(SEQ ID No.9)：

[0171] QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQTPGKGLKWMGWINPYTGEPTYADDFKGRFAFSLDTSASTAFLQINNLTNEDMTTYFCARRKYGNYYVMDYWGQGTSVTVSS

[0172] S‑412‑8重链序列(SEQ ID No.10)：

[0173] QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQTPGKGLKWMGWINPYTGEPTYADDFKGRFAFSLDTSASTAFLQINNLTNEDMTTYFCARRKYGNYYVMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

[0174] S‑412‑8抗体轻链序列的CDR区：

[0175] CDR1(SEQ ID No.11)：RASESVEYYGTSVLQ；

[0176] CDR2(SEQ ID No.12)：GASNVES；

[0177] CDR3(SEQ ID No.13)：QQSGKVPWT；

[0178] S‑412‑8抗体轻链序列的FR区：

[0179] FR1(SEQ ID No.14)：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC

[0180] FR2(SEQ ID No.15)：WYQQKPGQPPKLLIY

[0181] FR3(SEQ ID No.16)：GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFC

[0182] FR4(SEQ ID No.17)：FGGGTKLAIK

[0183] 信号肽(SEQ ID No.18)：MESDTLLLWVLLLWVPGSTG

[0184] S‑412‑8抗体轻链序列的可变区(SEQ ID No.19)：

[0185] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYGTSVLQWYQQKPGQPPKLLIYGASN VESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSGKVPWTFGGGTKLAIK

[0186] S‑412‑8轻链序列(SEQ ID No.20)：

[0187] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYGTSVLQWYQQKPGQPPKLLIYGASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSGKVPWTFGGGTKLAIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC[0188] 2)、S‑322‑4完整抗体序列

[0189] S‑322‑4抗体重链序列的CDR区：

[0190] CDR1(SEQ ID No.21)：HTYIH

[0191] CDR2(SEQ ID No.22)：RIDPVNDNSDYDPKFQG

[0192] CDR3(SEQ ID No.23)：LSGGYYVYAMD

[0193] S‑322‑4抗体重链序列的FR区：

[0194] FR1(SEQ ID No.24)：EVPLQQSGAELVKPGASVKLSCTVSGFNIQ

[0195] FR2(SEQ ID No.25)：WMKQRPEQGLEWIG

[0196] FR3(SEQ ID No.26)：KATITADMSSNTAYLQFNSLTAEDTAVYYCAR

[0197] FR4(SEQ ID No.27)：YWGQGTSVTVSS

[0198] 信号肽(SEQ ID No.28)：MKCSWVIFFLMAMLPGVNS

[0199] S‑322‑4抗体重链序列的可变区(SEQ ID No.29)：

[0200] EVPLQQSGAELVKPGASVKLSCTVSGFNIQHTYIHWMKQRPEQGLEWIGRIDPVNDNSDYDPKFQGKATITADMSSNTAYLQFNSLTAEDTAVYYCARLSGGYYVYAMDYWGQGTSVTVSS

[0201] S‑322‑4重链序列(SEQ ID No.30)：

[0202] EVPLQQSGAELVKPGASVKLSCTVSGFNIQHTYIHWMKQRPEQGLEWIGRIDPVNDNSDYDPKFQGKATITADMSSNTAYLQFNSLTAEDTAVYYCARLSGGYYVYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK[0203] S‑322‑4抗体轻链序列的CDR区：

[0204] CDR1(SEQ ID No.31)：KSSQSLLYSYNQKNYLA

[0205] CDR2(SEQ ID No.32)：WASTRES

[0206] CDR3(SEQ ID No.33)：QQYHTYVT

[0207] S‑322‑4抗体轻链序列的FR区：

[0208] FR1(SEQ ID No.34)DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSC

[0209] FR2(SEQ ID No.35)：WYQQKPGQSPKLLIY

[0210] FR3(SEQ ID No.36)：GVPDRFTGSGSGTDFTLTIISVKAEDLAVYYC

[0211] FR4(SEQ ID No.37)：FGAGTKLELK

[0212] 信号肽(SEQ ID No.38)：MDSQAQVLMLLLLWVSGTCG

[0213] S‑322‑4抗体轻链序列的可变区(SEQ ID No.39)：

[0214] DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSYNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIY WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIISVKAEDLAVYYCQQYHTYVTFGAGTKLELK

[0215] S‑322‑4轻链序列(SEQ ID No.40)：

[0216] DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSYNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIISVKAEDLAVYYCQQYHTYVTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC[0217] 3)、S‑401‑2完整抗体序列

[0218] S‑401‑2抗体重链序列的CDR区：

[0219] CDR1(SEQ ID No.41)：NYGMN

[0220] CDR2(SEQ ID No.42)：WINPYTGEPTYADDFKG

[0221] CDR3(SEQ ID No.43)：REYGNYYVMDY

[0222] S‑401‑2抗体重链序列的FR区：

[0223] FR1(SEQ ID No.44)：QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFT

[0224] FR2(SEQ ID No.45)：WVKQAPGKGLKWMG

[0225] FR3(SEQ ID No.46)：RFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCAR

[0226] FR4(SEQ ID No.47)：WGQGTSVTVSS

[0227] 信号肽(SEQ ID No.48)：MDWLWNLLFLMAAAQSAQA

[0228] S‑401‑2抗体重链序列的可变区(SEQ ID No.49)：

[0229] QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINPYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARREYGNYYVMDYWGQGTSVTVSS

[0230] S‑401‑2重链序列(SEQ ID No.50)：

[0231] QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINPYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARREYGNYYVMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

[0232] S‑401‑2抗体轻链序列的CDR区：

[0233] CDR1(SEQ ID No.51)：RASESVEYYGTSVMQ

[0234] CDR2(SEQ ID No.52)：AASNVES

[0235] CDR3(SEQ ID No.53)：QQSGKVPWT

[0236] S‑401‑2抗体轻链序列的FR区：

[0237] FR1(SEQ ID No.54)：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC

[0238] FR2(SEQ ID No.55)：WYQQKPGQPPKLLIY

[0239] FR3(SEQ ID No.56)：GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFC

[0240] FR4(SEQ ID No.57)：FGGGTKLEIK

[0241] 信号肽(SEQ ID No.58)：MESDTLLLWVLLLWVPGSTG

[0242] S‑401‑2抗体轻链序列的可变区(SEQ ID No.59)：

[0243] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYGTSVMQWYQQKPGQPPKLLIYAAS NVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSGKVPWTFGGGTKLEIK

[0244] S‑401‑2轻链序列(SEQ ID No.60)：

[0245] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYGTSVMQWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSGKVPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC[0246] 4)、S‑255‑11完整抗体序列

[0247] S‑255‑11抗体重链序列的CDR区：

[0248] CDR1(SEQ ID No.61)：SDYAWN

[0249] CDR2(SEQ ID No.62)：YITYSGTTAFNPSLIS

[0250] CDR3(SEQ ID No.63)：GPYSGTNYAMDY

[0251] S‑255‑11抗体重链序列的FR区：

[0252] FR1(SEQ ID No.64)：DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT

[0253] FR2(SEQ ID No.65)：WIRQFPGNKLEWMG

[0254] FR3(SEQ ID No.66)：RISLTRDTSKNQFFLQLSSVTTEDTATFYCAR

[0255] FR4(SEQ ID No.67)：WGQGTSVTVSS

[0256] 信号肽(SEQ ID No.68)：MRMLILLWLFTAFPGILS

[0257] S‑255‑11抗体重链序列的可变区(SEQ ID No.69)：

[0258] DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITYSGTTAFNPSLISRISLTRDTSKNQFFLQLSSVTTEDTATFYCARGPYSGTNYAMDYWGQGTSVTVSS

[0259] S‑255‑11重链序列(SEQ ID No.70)：

[0260] DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYITYSGTTAFNPSLISRISLTRDTSKNQFFLQLSSVTTEDTATFYCARGPYSGTNYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

[0261] S‑255‑11抗体轻链序列的CDR区：

[0262] CDR1(SEQ ID No.71)：RASESVDDYGVSFMN

[0263] CDR2(SEQ ID No.72)：AAFKQGS

[0264] CDR3(SEQ ID No.73)：QQSKEVPWT

[0265] S‑255‑11抗体轻链序列的FR区：

[0266] FR1(SEQ ID No.74)：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC

[0267] FR2(SEQ ID No.75)：WFQQKPGQPPKLLIY

[0268] FR3(SEQ ID No.76)：GVPARISGSGSYTDFSLNIHPMEEDDTAMYFC

[0269] FR4(SEQ ID No.77)：FGGGTKLEVK

[0270] 信号肽(SEQ ID No.78)：MEKDTLLLWVLLLWVPGSTG

[0271] S‑255‑11抗体轻链序列的可变区(SEQ ID No.79)：

[0272] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDDYGVSFMNWFQQKPGQPPKLLIYAAF KQGSGVPARISGSGSYTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEVK

[0273] S‑255‑11轻链序列(SEQ ID No.80)：

[0274] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDDYGVSFMNWFQQKPGQPPKLLIYAAFKQGSGVPARISGSGSYTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEVKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC[0275] 本发明为特异性识别抗B7‑H3人源化单抗的抗独特型单抗，均一性好，结合力强，广泛应用于药物研发领域，主要应用于抗体药物的免疫原性分析及药代动力学分析等。

[0276] 本发明提供具有高结合力、高特异性的B7‑H3人源化单抗抗独特型鼠单克隆抗体。

[0277] 本发明提供的抗独特型抗体及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

[0278] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0279] 实施例1：抗独特型抗体与抗B7‑H3人源化单抗的结合

[0280] 1.试验方法

[0281] 1.1包被与封闭：将抗B7‑H3人源化单抗(迈威(上海)生物科技股份有限公司生产)用包被液稀释至2μg/mL，2～8℃过夜；将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次；将ELISA板拍干，加入3％ BSA/PBST，室温孵育2h；封闭后的ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次。

[0282] 1.2加样：将4株抗独特型抗体(S‑412‑8、S‑322‑4、S‑401‑2、S‑255‑11)分别用1％BSA/PBST稀释至10μg/mL作为起始浓度，3倍梯度稀释共11个点，以1％ BSA/PBST作为0点；将上述样品以加入ELISA板中，设复孔，室温孵育2h。

[0283] 1.3加入检测抗体：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次；将山羊抗鼠IgG HRP标记二抗(JacksonImmunoResearch，货号115‑035‑003)用1％ BSA/PBST稀释20000倍后加入ELISA板，室温孵育1h。

[0284] 1.4显色：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次；将事先平衡至室温的TMB底物(KPL，货号5120‑0047)加入ELISA板，室温避光孵育10min左右；加入1M H3PO4终止反应。

[0285] 1.5读板：显色反应终止后，以650nm为参比波长，读取450nm波长处OD值。

[0286] 2.试验结果

[0287] 结果如图1和表3所示，4个抗独特型抗体均能与抗B7‑H3人源化单抗结合，且结合力无明显差异。

[0288] 表3抗独特型抗体与抗B7‑H3人源化单抗的结合力数据

[0289]

[0290] 实施例2：抗独特型抗体在药物免疫原性ADA检测中的应用

[0291] 1.试验步骤

[0292] 1.1包被与封闭：将抗B7‑H3人源化单抗用包被液稀释至2μg/mL，2～8℃过夜；将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次；将ELISA板拍干，加入3％ BSA/PBST，室温孵育2h；封闭后的ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次。

[0293] 1.2准备待测样品：将4株抗独特型抗体(S‑412‑8、S‑322‑4、S‑401‑2、S‑255‑11)分别用1％ BSA/PBST稀释至10μg/mL作为起始浓度，3倍梯度稀释共11个点，以1％BSA/PBST作为0点。

[0294] 1.3加样：用EZ‑LINK NHS‑LC‑LC‑Biotin(Thermo，Cat#21343)按照说明书标记抗B7‑H3人源化单抗，得到抗B7‑H3抗体‑Biotin，将其用1％ BSA/PBST稀释至0.2μg/mL。将上述稀释好的每一种抗独特型抗体样品和抗B7‑H3抗体‑Biotin以50μl/孔加入ELISA板中，设复孔，室温孵育2h。

[0295] 1.4加入SA‑HRP：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次。将SA‑HRP(SouthernBiotech，货号7105‑05)用1％ BSA/PBST按1:20000稀释后加入ELISA板，室温孵育1h。

[0296] 1.5显色：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次。将事先平衡至室温的TMB底物(KPL，货号5120‑0047)加入ELISA板，室温避光孵育10min左右。加入1M H3PO4终止反应。

[0297] 1.6读板：显色反应终止后，以650nm为参比波长，读取450nm波长处OD值。

[0298] 2.试验结果

[0299] 结果如图2和表4所示，S‑401‑2和S‑412‑8这两个抗独特型抗体性能测试良好，都可以用作ADA分析阳性对照。

[0300] 表4抗独特型抗体ADA分析数据

[0301]

[0302] 实施例3：抗独特型抗体在药物中和抗体检测中的应用

[0303] 1.试验步骤

[0304] 1.1包被与封闭：将B7‑H3胞外蛋白(迈威(上海)生物科技股份有限公司生产)用包被液稀释至2μg/mL，2～8℃过夜；将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次；将ELISA板拍干，加入3％ BSA/PBST，室温孵育2h；封闭后的ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次。

[0305] 1.2准备待测样品：将4株抗独特型抗体(S‑412‑8、S‑322‑4、S‑401‑2、S‑255‑11)分别用1％ BSA/PBST稀释至10μg/mL作为起始浓度，3倍梯度稀释共11个点，以1％BSA/PBST作为0点。

[0306] 1.3加样：用EZ‑LINK NHS‑LC‑LC‑Biotin(Thermo，Cat#21343)按照说明书标记抗B7‑H3人源化单抗，得到抗B7‑H3抗体‑Biotin，将其用1％ BSA/PBST稀释至20ng/mL。将上述稀释好的每一种抗独特型抗体样品和抗B7‑H3抗体‑Biotin分别以50μl/孔加入ELISA板中，设复孔，室温孵育2h。

[0307] 1.4加入SA‑HRP：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次。将SA‑HRP(SouthernBiotech，货号7105‑05)用1％ BSA/PBST按1:20000稀释后加入ELISA板，室温孵育1h。

[0308] 1.5显色：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次。将事先平衡至室温的TMB底物(KPL，货号5120‑0047)加入ELISA板，室温避光孵育10min左右。加入1M H3PO4终止反应。

[0309] 1.6读板：显色反应终止后，以650nm为参比波长，读取450nm波长处OD值。

[0310] 2.试验结果

[0311] 结果如图3和表5所示，S‑322‑4和S‑255‑11为靶点非阻断型抗独特型抗体，S‑401‑2和S‑412‑8为靶点阻断型抗独特型抗体，两株靶点阻断型抗体可以用作中和抗体分析阳性对照。

[0312] 表5抗独特型抗体中和抗体分析数据

[0313]

[0314] 实施例4：抗独特型抗体在非临床药代分析中的应用

[0315] 将抗B7‑H3人源化单抗药物按照3mg/kg剂量单次静脉注射到裸小鼠体内，共计平行给药6只小鼠，在给药后3h、1天、3天、7天、10天、14天和21天静脉取血200μL，血液静置30min后通过1000rpm离心30min分离血清，随后使用ELISA测定血清中的药物浓度。具体的测定方法基于本发明中的抗独特型抗体，方法如下：

[0316] 1.试验步骤

[0317] 1.1包被与封闭：将抗独特型抗体S‑412‑8抗体用包被液稀释至1μg/mL，2～8℃包被过夜。将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次后拍干，加入3％ BSA/PBST，室温孵育2h。封闭后的ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次。

[0318] 1.2待测样品、标准曲线样品和质控品稀释：

[0319] 将抗B7‑H3人源化单抗分别用5％混合空白小鼠血清(昭衍(苏州)新药研究中心有限公司采购)稀释至100ng/mL(ULOQ)、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.12ng/mL、1.56ng/mL(LLOQ)和0.78ng/mL(锚定点)。空白对照(0ng/mL)作为标准曲线的一部分，但不参与标准曲线拟合。

[0320] 将抗B7‑H3人源化单抗用5％混合空白小鼠血清制备3个浓度质控品，浓度为：80ng/mL(HQC，高浓度质控)、20ng/mL(MQC，中浓度质控)、4.0ng/mL(LQC，低浓度质控)。

[0321] 将小鼠给抗B7‑H3人源化单抗药(迈威(上海)生物科技股份有限公司生产)后不同时间点取样得到的血样先用1％ BSA/PBST稀释20倍，随后分别用5％混合空白小鼠血清稀释至合适倍数。

[0322] 1.3加样：将上述待测样品、标准曲线样品和质控样品加入ELISA板中，室温静置孵育2h。

[0323] 1.4加入检测抗体：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次。用EZ‑LINK NHS‑LC‑LC‑Biotin(Thermo，Cat#21343)按照说明书标记抗独特型抗体S‑322‑4，得到的S‑322‑4‑Biotin用1％ BSA/PBST稀释至2μg/mL，加入ELISA板中，室温孵育1h。

[0324] 1.5加入SA‑HRP：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次。将SA‑HRP用1％ BSA/PBST按1:40000稀释后加入ELISA板，室温孵育1h。

[0325] 1.6显色：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次。加入TMB底物，室温避光静置孵育10min左右。加入1M H3PO4终止反应。

[0326] 1.7读板：显色反应终止后，以650nm为参比波长，读取450nm波长处OD值。

[0327] 1.8浓度计算：将标准曲线浓度与OD值进行四参数拟合，用拟合方程计算待测样品的药物浓度。

[0328] 2.试验结果

[0329] 结果见表6～7和图4～图5所示，在抗B7‑H3人源化单抗药物分析中呈现较好的浓度‑吸光度线性，检测中所有质控样品的准确度均在80.0～120.0％范围内，满足方法学要求。抗B7‑H3人源化单抗的药物给药后在大鼠体内的浓度‑时间曲线呈正常的药物药代动力学曲线，说明基于本发明的抗独特型抗体S‑412‑8和S‑322‑4可以很好地检测抗B7‑H3人源化单抗药物在血液中的浓度。

[0330] 表6抗B7‑H3人源化单抗标准曲线测量结果

[0331]

[0332]

[0333] 表7抗B7‑H3人源化单抗药物测量结果

[0334]

[0335] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。