技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种提高苗期烟草植株抗冷性的方法。
相关背景技术
[0002] 低温胁迫作为一种主要的非生物胁迫，对植物影响巨大，是影响全球农林作物生长及生产的主要因素之一。
[0003] 烟草(Nicotiana tabacum L.)是我国主要的经济作物。作为一种喜温作物，烟草生长过程对光热条件非常敏感，低温对烟草形态结构、生理代谢途径和生长发育进程会产生较大的影响。在我国大多数烟区，育苗阶段早春低温现象严重，经常会遭受“倒春寒”带来的低温冷害，影响壮苗培育，不利于烟草早生快发，易产生早花现象，严重影响烟叶的产量和质量，制约着优质烟叶的生产。
[0004] 鉴于低温对烟草苗期构成的危害，提升烟草的抗冷能力已经成为生物领域的研究热点之一。本领域前期研究主要涉及培育抗寒品种、栽培管理措施、喷施植物生长调节剂等来缓解幼苗的受害程度，但这些方法存在育种周期长、地域局限性较大、栽培措施工作量大以及见效慢等缺陷。因此，有必要开发一种新的提高烟苗抗冷能力的方法，来降低低温对烟草苗期造成的严重危害。
具体实施方式
[0040] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0041] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0042] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0043] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
[0044] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0045] 实施例1
[0046] 1.实验材料
[0047] 选用烟草品种为对低温敏感的中烟100和贵烟8号，挑选完整的烟草种子播种于育苗盘中，每盘12穴育苗孔，置于昼夜温度25℃/15℃、光周期为14/10h、相对湿度为75％和光照强度为13000lx的人工气候箱中培养。
[0048] 日本外担菌(Exobasidium.japonicum)菌株由贵州省烟草品质研究重点实验室提供，该菌株已在文献“陈明珠.日本外担菌培养液对烤烟幼苗生长及碳氮代谢酶活性的影响”中公开，本发明承诺从本发明申请日起20年，向公众发放。
[0049] 本实验在贵州大学烟草学院进行。
[0050] 2.实验方法
[0051] 日本外担菌培养液的制备：将日本外担菌菌株接种至马铃薯葡萄糖培养基(PD)中，在25℃、130r/min的恒温摇床内培养7d后，8000r/min离心10min，分离得到上清液，上清液即为日本外担菌培养原液，随后用蒸馏水稀释为浓度为1％(V/V)的日本外担菌培养液。
[0052] 采用常规育苗法进行管理，待烟草幼苗长至四叶一心时，选择无病、健壮、长势均一的植株，分为以下三个处理组进行处理：
[0053] 日本外担菌处理组(T)：用浓度为1％的日本外担菌培养液进行叶面喷施，每株定量10mL(叶片正反面均匀喷施)，每天喷施1次，连续喷施5d后移入人工气候箱中进行冷胁迫处理。设置冷胁迫温度梯度变化：10℃→6℃→2℃，温度依次降低，每个温度下处理12h，即10℃处理12h，6℃处理12h，2℃处理12h。
[0054] 空白对照组(CK)：同日本外担菌处理组，区别仅在于，将浓度为1％的日本外担菌培养液替换为PD培养液，同时烟苗不进行冷胁迫处理，持续在25℃下培养。
[0055] 对照组(CK0)：同日本外担菌处理组，区别仅在于，将浓度为1％的日本外担菌培养液替换为PD培养液。
[0056] 日本外担菌处理组和对照组冷胁迫36h后，贵烟8号和中烟100的烟草表型图见图1，可见在遭遇相同低温的条件下，对照组植株萎蔫下垂，叶片边缘卷曲，退绿黄化；而日本外担菌处理组的植株挺立，萎蔫程度较轻，叶片无明显黄化。
[0057] 3.指标检测
[0058] 各组在冷胁迫后(空白对照组为25℃继续培养36h后)每隔12h取一次样，即取样时间为冷胁迫0h、12h、24h、36h，取样点为烟草幼苗自上而下第2～3片真叶，分别测定如下的指标：
[0059] 电导率测定：电解质渗透率(相对电导率)采用浸泡法测定。用打孔器取大小相当的烟草叶片(避开茎节与主脉)，自来水清洗后再用蒸馏水冲洗3次，将叶片表面水分用滤纸吸干；分别称取质量为0.1g的叶片3份，置于10mL去离子水的刻度试管中；室温下浸泡24h后用电导仪测定浸提液电导(R)，沸水浴加热30min，冷却至室温后再次测定浸提液电导(R1)。
[0060] 相对电导率L(％)＝R/R1×100％；
[0061] 伤害度(％)＝[(Lt‑LCK)/(1‑LCK)]×100％；其中，Lt为处理组相对电导率，LCK为对照组相对电导率。
[0062] 叶绿素含量测定：叶片叶绿素(Chl)含量采用乙醇浸提法测定。
[0063] 渗透调节物质含量测定：可溶性蛋白采用考马斯G‑250染色法、可溶性糖采用蒽酮法、脯氨酸的测定采用酸性茚三酮法，均使用苏州格锐思生物科技有限公司所提供的试剂盒进行测定。
[0064] 丙二醛含量测定：丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥法进行测定，采用苏州格锐思生物科技有限公司提供的MDA含量检测试剂盒。
[0065] 抗氧化酶活性测定：烟苗超氧化物歧化酶(SOD)采用氮蓝四唑法测定，过氧化物酶(POD)采用愈创木酚法测定，过氧化氢酶(CAT)采用分光光度法测定。
[0066] 4.结果与分析
[0067] 测定结束后，分析结果如下：
[0068] (1)日本外担菌培养液对冷胁迫下烟草幼苗叶片细胞膜损伤的影响
[0069] 各处理组烟草幼苗叶片的相对电导率、伤害度和丙二醛含量检测结果见图2‑图4。
[0070] 在本实验中，冷胁迫后中烟100和贵烟8号两品种相对电导率和丙二醛均高于空白对照组，初步分析产生这一现象的原因可能是因为低温胁迫导致烟草细胞内环境的稳定被破坏，细胞膜膜脂过氧化严重，促进了丙二醛的大量产生。与对照组相比，施用日本外担菌培养液后能有效降低两个品种烟草叶片相对电导率和MDA含量，显著缓解低温胁迫下膜脂的损伤程度，最大程度地维持细胞膜结构的完整性，减轻低温对烟草细胞膜的伤害。并且日本外担菌培养液对中烟100和贵烟8号细胞膜损伤的缓解程度不同，说明低温下日本外担菌培养液对不同品种适应调节能力存在差异。
[0071] (2)日本外担菌培养液对冷胁迫下烟草幼苗叶片光合色素的影响
[0072] 各处理组烟草幼苗叶片光合色素含量的检测结果见表1。
[0073] 叶绿素是植物叶绿体中进行光合作用的主要色素，其含量直接影响植物的光合作用能力。本发明的检测结果显示，在冷胁迫36h后，中烟100和贵烟8号烟草幼苗叶绿素总量、叶绿素a(Chla)含量、叶绿素b(Chlb)含量均显著下降，可能因为低温降低了叶绿体色素合成酶的活性，抑制了叶绿体的合成；此外，低温还使叶绿素a/b值减小，这可能是因为低温胁迫下叶绿素a的降解速度大于叶绿素b所致。而喷施日本外担菌培养液处理可显著提高冷胁迫下中烟100和贵烟8号叶绿素a含量、叶绿素总量，并显著提高贵烟8号叶绿素a/b的值，有效缓解光合色素的降解速度，这可能是日本外担菌培养液能抑制原有叶绿体色素氧化分解的速度。
[0074] 表1日本外担菌培养液处理对冷胁迫下烟草幼苗叶片光合色素的影响
[0075]
[0076] (3)日本外担菌培养液对冷胁迫下烟草幼苗叶片渗透调节的影响
[0077] 各处理组烟草幼苗脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的检测结果见图5‑图7。如图5‑图7所示，烟草受低温胁迫后，可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸的含量较空白对照组有所增加，说明烟草可自身调节并启动防御机制来缓解冷害胁迫。日本外担菌培养液处理后两品种的可溶性蛋白质、可溶性糖和脯氨酸在烟草叶片中的积累量较对照组进一步提高，维持胞内较高的渗透压，减少了可溶性蛋白和可溶性糖分解，从而降低逆境胁迫下植物对有机物的消耗，充足供应烟草自身代谢所需的能量，提高植物的抗寒力。
[0078] (4)日本外担菌培养液对冷胁迫下烟草幼苗叶片抗氧化代谢的影响
[0079] 各处理组烟草幼苗SOD、POD和CAT活性的检测结果见图8‑图10。如图8‑图10所示，随着胁迫时间的延长和温度的降低，抗氧化酶SOD、CAT和POD活性呈现升后下降的趋势，表明植物体为了缓解低温胁迫下ROS的毒害作用，植物开启了自我保护机制以抵御逆境胁迫；喷施日本外担菌培养液对两品种的抗氧化酶活性产生了不同的影响，但都能提高酶活性，有效清除植物体内活性氧，抑制膜脂过氧化，缓解植物因冷胁迫受到的伤害。
[0080] 实施例2
[0081] 一种提高苗期烟草植株抗冷性的生物制剂，包括1％浓度的日本外担菌培养液。
[0082] 1％浓度的日本外担菌培养液的制备方法如下：
[0083] 将日本外担菌菌株接种至马铃薯葡萄糖培养基(PD)中，在25℃、130r/min的恒温摇床内培养7d后，8000r/min离心10min，分离得到上清液，上清液即为日本外担菌培养原液，随后用蒸馏水稀释为浓度为1％的日本外担菌培养液。
[0084] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
