[0001] 本发明涉及水稻OsSRFP1基因的抗冷性基因工程应用，属于基因工程领域。技术背景

[0002] 蛋白质的泛素化修饰在细胞生命活动过程中发挥了至关重要的作用，已经发现在植物中参与了植物的生长发育以及生物胁迫与非生物胁迫的响应(Smalle et al.,2004；Vierstra,2009)。三种关键酶共同介导了蛋白质的泛素化过程，包括泛素活化酶E1，泛素结合酶E2和泛素连接酶E3。E3泛素连接酶可使其对特定的蛋白质进行修饰，因此E3是在底物蛋白的特异性选择修饰过程中作用最为关键(Mazzucotelli et al.,2006)。E3泛素连接酶是一个种类繁多的蛋白大家族，水稻中存在数百个不同类型的E3泛素连接酶基因，在水稻的生命过程中发挥了重要而广泛的调控功能。Song等(Song et al.,2007)克隆和鉴定了一个控制水稻谷粒宽度及重量的主效QTL基因-GW2，GW2编码一个RING泛素连接酶，gw2突变体增加了细胞数量，导致形成较大的小穗外壳，加速了谷物奶状营养物填充率，形成增大的谷粒宽度、重量及产量。GW2可能通过降解靶蛋白来负调控细胞分裂。相似的控制水稻谷粒宽度及重量主效QTL基因qSW5/GW5，可能在种子发育过程中通过调节细胞分裂参与泛素-蛋白酶体降解途径(Shomura et al.,2008；Weng et al.,2008)。OsDSG1为RING泛素连接酶，酵母双杂交检测证实OsDSG1与OsABI3互作，缺失OsDSG1的T-DNA突变体种子延迟萌发，表明OsDSG1为ABA在种子萌发的主要调节因子(Park et al.,2010)。OsBBI1编码一个RING泛素连接酶，通过改变细胞壁的厚度和次生代谢物来调控对稻瘟病菌的抗性(Li et al.,2011)。Park等(Park et al.,2012)证实稻瘟病菌通过AvrPiz-t抑制水稻RING泛素连接酶APIP6介导的针对病原体的免疫防卫反应。蛋白互作检测表明AvrPiz-t抑制APIP6的泛素连接酶活性，而APIP6能泛素化AvrPiz-t。在抗白叶枯病研究中，Wang等(Wang et al.,2006)分离和鉴定了水稻抗白叶枯病基因Xa21产物的互作蛋白XB3。XB3编码一个450个氨基酸、含有RING锌指结构域的泛素连接酶，作为XA21的蛋白激酶底物。

[0003] 在响应非生物胁迫应答中，也发现了一些E3泛素连接酶调控植物的逆境响应。OsDIS1编码一个RING泛素连接酶，OsDIS1表达受干旱上调，超表达OsDIS1的转基因水稻植株减少了干旱耐性，而RNA沉默OsDIS1的转基因植株增加了干旱耐性。OsDIS1可能通过转录调节逆境相关基因及蛋白泛素化修饰负调控水稻干旱耐性。OsSDIR1为一个RING泛素连接酶(Gao et al.,2011)，OsSDIR1表达受干旱和盐诱导，包含OsSDIR1的转基因水稻植株比对照植株表现更强的干旱耐性。与此相似，包含超表达RING泛素连接酶基因OsRDCP1和OsCTR1的转基因水稻植株增加了干旱耐性(Bae et al.,2011；Lim et al.,2014)，而过表达OsHCl1的转基因植株增强了高温耐性(Lim et al.,2013)。

[0021] 实施例1

[0022] 选用水稻品种“中花11”，待水稻幼苗长至3叶期后，用4℃进行处理，6小时后立即取叶片置于液氮中冷冻保存，取部分叶片，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内，匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。以获得的总RNA为模板,按照美国Promega公司提供的反转录试剂盒的说明书进行反转录，合成cDNA第一链。设计两端引物:上游引物：F1：ATGGAGCTCGACGACGCG(SEQ ID NO.2)；下游引物：R1：TTAAGCAGGGAGCACCGG(SEQ ID NO.3)，采用RT-PCR方法进行cDNA克隆。PCR扩增使用Primestar HS DNA聚合酶(Takara,Dalian,China)。PCR程序如下：98℃预变性5分钟，
98℃变性5s,58℃复性10s，72℃延伸50s，30个循环后，72℃10min，将PCR产物加入普通Tag酶30min,克隆至pMD18-T载体，获得质粒pMD18T-OsSRFP1，测序后获得具有完整编码区的水稻E3泛素连接酶基因OsSRFP1的cDNA序列SEQ ID NO.1。

[0023] OsSRFP1的ORF全长783bp，BioXM软件分析表明OsSRFP1共编码260个氨基酸，使用BioXM软件(版本2.6)估算其等电点pI＝6.87，分子量MW＝29.86KDa。以OsSRFP1搜索GenBank中现有水稻基因组(包括粳稻和籼稻)数据库，发现OsSRFP1为单拷贝基因。

[0024] 实施例2

[0025] 设计引物(上游引物:F2：AGATGCTGAAGCACGACAAGTTC(SEQ ID NO.4)，下游引物：R2：AGTCGTTGCACACGATCCATCC(SEQ ID NO.5))，进行实时定量RT-PCR分析OsSRFP1基因在水稻幼苗中的表达，以水稻actin基因Rac1(McElroy et al,1990)的表达为内参，结果表明，OsSRFP1基因的表达在4℃处理6h后显著增强，其表达量约为对照的8倍；OsSRFP1基因的表达在100mM NaCl处理6h后显著增强，其表达量约为对照的4倍；OsSRFP1基因的表达在100mM H2O2处理1h后即表达量增加，6h时表达量达到最高，其表达量约为对照的10倍；在脱落酸ABA处理条件下，OsSRFP1基因的表达在1h处理后即表达量增加，12h时表达量达到最高，其表达量约为对照的8倍。本发明的水稻OsSRFP1基因为水稻中的首次报道，有望应用于植物尤其是单子叶植物的抗冷性遗传改良。

[0026] 实施例3

[0027] 根据水稻OsSRFP1基因的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物上引入Nco Ⅰ限制性内切酶位点，下游引物引入了BstP Ⅰ限制性内切酶位点：上游引物：OsSRFP1OE-F：CCATGGAGCTCGACGACGCGTCTC(SEQ ID NO.6)，下游引物：OsSRFP1OE-R：GGTGACCTTAAGCAGGGAGCACCG(SEQ ID NO.7)，以实施例1中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将OsSRFP1的cDNA克隆至中间载体pMD18-T，通过Nco Ⅰ和BstP Ⅰ酶切位点进一步克隆到植物双元表达载体pCambia1304(图1)，获得OsSRFP1基因过表达载体pCAMBIA1304-OsSRFP1。

[0028] 同时利用在线RNAi靶定位点预测软件(http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner；http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmL)， 选 取了OsSRFP1基因中位于SEQ ID NO.1的自5’端起第518bp到730bp长度为213bp的特异核苷酸序列作为干涉载体插入区段，以质粒pMD18T-OsSRFP1的DNA为模板,利用 引 物 RNAi-ZFIP1F1：GGATCCTCGATGCCTATCTTTGACA(SEQ ID NO.8)、RNAi-ZFIP1R1：GGTACCAGCAGGGAGCACCGGGGCA(SEQ ID NO.9)通过BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点将该序列反向插入pTCK303植物干涉表达载体，同时以质粒pMD18T-OsSRFP1的DNA为模板,利用 引 物 RNAi-ZFIP1F2：GAGCTCTCGATGCCTATCTTTGACA(SEQ ID NO.10)、RNAi-ZFIP1R2：
ACTAGTAGCAGGGAGCACCGGGGCA(SEQ ID NO.11)通过Sac Ⅰ和Spe Ⅰ酶切位点将该序列正向插入pTCK303植物干涉表达载体，从而获得该基因的干涉表达载体pTCK303-OsSRFP1(图
2)。

[0029] 将获得的OsSRFP1过表达和RNAi干涉抑制表达载体转入农杆菌，进一步转入水稻，对获得的转基因植株进行PCR,以及RT-PCR验证：

[0030] 取转基因水稻叶片，提取总RNA反转成cDNA。用OsSRFP1基因qRT-PCR特异引物 F3:AGATGCTGAAGCACGACAAGTTC(SEQ ID NO.12)、R3:AGTCGTTGCACACGATCCATCC(SEQ ID NO.13)及内参18s rRNA基因引物18s rRNA-F:ATGGTGGTGACGGGTGAC(SEQ ID NO.14)、18s rRNA-R:AGTCGTTGCACACGATCCATCC(SEQ ID NO.15)对转基因株系进行qRT-PCR验证(图3)。

[0031] 经RT-PCR验证后进行植物的耐逆性评价，转基因植株的T3代和对照植株进行耐冷性分析:取转基因水稻种子和野生型种子，30℃浸种直至露白，然后将发芽一致的18粒种子分别播于蛭石与营养土2:1的混合基质中，培养4周后，置于4℃光照培养箱中处理，当表型出现明显差异时，室温恢复5d，统计存活率，电解质渗透率。转基因植株和野生型水稻幼苗的低温处理结果显示，35S:OsSRFP1转基因水稻植株(即转pCAMBIA1304-OsSRFP1载体的转基因植株)相对于WT对低温更敏感，而35S:OsSRFP1-RNAi转基因株系(即转pTCK303-OsSRFP1载体的转基因植株)更抗低温(图4)。存活率统计显示，冷处理3天恢复后，相对于75％的野生型存活率，只有16％的35S:OsSRFP1转基因水稻植株植株可以存活；而冷处理7天恢复后，相对于20％的野生型存活率，85％的OsSRFP1-RNAi植株能快速恢复正常生长(图4)。随着冷胁迫处理的进行，分别取处理0h、5h、24h的样进行电解质渗透率的测定，结果显示过表达株系的电解质渗透率明显大于野生型，而干涉抑制表达株系的电解质渗透率明显小于野生型(图4)，说明水稻植株在冷胁迫处理时，干涉抑制OsSRFP1表达能更好的保持细胞膜的完整性，增强植株的抗性。以上结果表明OsSRFP1负调控水稻中冷响应过程。

[0032] 上述实施例表明本发明中克隆的水稻E3泛素连接酶基因OsSRFP1，为水稻中首次克隆的E3泛素连接酶基因。实施例2表明该基因与水稻的非生物胁迫密切相关。实施例3表明抑制表达该基因后能够提高转基因水稻的抗冷性，可以通过RNAi，microRNA调控、TALEN或CRISPR等技术培养抑制或阻断表达OsSRFP1基因的水稻转基因植株，进行水稻的抗冷性遗传改良。