[0001] 本发明涉及荧光比色传感器构建领域，更具体地说，本发明涉及一种基于铁掺杂碳量子点的氨苄青霉素和四环素可视化检测方法。

[0002] 目前抗生素已被广泛用于预防或治疗人类和动物以及畜牧业的细菌感染，当抗生素释放到环境中时，会通过破坏正常代谢和改变微生物群落，直接威胁人类安全；另一方面，抗生素不断释放到环境中会导致化学污染，并促进抗生素抗性基因(ARGs)和抗生素耐药性细菌(ARB)的产生和传播，抗生素耐药性(AR)降低了抗生素对人类和动物病原体的治疗潜力，对全球公共卫生构成严重威胁。

[0003] 碳量子点(CDs)是一种小于10nm的零维纳米材料，由于其优异的光致发光性能、催化性能和水分散性已被广泛用于不同的应用，包括金属离子检测、光催化、体内生物应用和抗生素检测。然而，CDs经常面临聚集、聚集引起的猝灭(ACQ)效应和水介质中的激发依赖性等挑战，这限制了它们的传感和吸附应用。最近的研究表明，杂原子掺杂可以改善CDs的催化性能，例如，Fe掺杂的碳纳米酶在过氧化酶催化过程中提高了活性中心利用率，与其他金属(即Cu、Co、Ni、Mn)掺杂的碳纳米酶相比，其活性中心利用率更高。基于量子点开发的抗生素生物传感器得到了蓬勃发展，此类方法往往具有良好的现场应用潜力，在即时检测(POCT)、环境监测、农业养殖等领域得到越来越重要的应用。

[0004] 近年来，人们开发了多种抗生素检测方法，并广泛应用于各种环境介质中，目前抗生素检测方法主要是HPLC、LC‑MS等，在通量、灵敏度、精确度、准确度等方面具有无可比拟的优势，但是其前处理繁琐，仪器成本高、检测场地需求高、操作人员专门化程度高，限制了其在抗生素现场快速检测中的应用，因此，开发快速、便捷、灵敏、特异的抗生素检测新技术具有重要意义。为了解决上述问题，现提供一种技术方案。

[0045] 下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的技术方案仅仅是本发明一部分，而不是全部。基于本发明中的技术方案，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他技术方案，都属于本发明保护的范围。

[0046] 实施例1

[0047] 图1示出了本发明实施例一提供的一种基于铁掺杂碳量子点的氨苄青霉素和四环素可视化检测方法的流程示意图。如图1所示，本实施例中的一种基于铁掺杂碳量子点的氨苄青霉素和四环素可视化检测方法，包括如下步骤：

[0048] 步骤1、通过水热法合成铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)；

[0049] 步骤2、通过透射电子显微镜(TEM)、紫外可见光谱、荧光光谱和X射线光电子能谱(XPS)光谱，对铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)进行表征；

[0050] 步骤3、通过电子顺磁共振自旋捕获技术检测电子顺磁共振(EPR)信号，在室温下用5，5‑二甲基‑1‑吡咯啉‑N‑氧化物(DMPO)和2，2，6，6‑四甲基哌啶(TEMP)捕获剂捕获自由基和过氧化物酶(POD)活性动力学测试，对铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)过氧化酶活性的鉴定；

[0051] 步骤4、通过不同氨苄青霉素(Amp)浓度下Fe‑CDs+TMB+H2O2体系的比色信号、不同四环素(TC)浓度下系统的荧光信号以及传感器在干扰因素下的选择性，构建氨苄青霉素和四环素的双模传感检测；

[0052] 步骤5、开发便携式试纸条，通过智能手机传感平台实现抗生素的快速视觉检测，通过智能手机拍摄比色照片，选择照片的特定区域，将照片颜色强度转换为RGB值，自动生成R、G、B值与浓度的线性拟合关系。

[0053] 其中，TMB指的是3,3',5,5'‑四甲基联苯胺，是一种非致癌性显色底物。

[0054] 步骤1中，通过水热法合成铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)的具体步骤为：将1.3g柠檬酸、0.15g六水合三氯化铁和150μL乙二胺溶于20mL去离子水中，将溶液转移到聚四氟乙烯衬里高压釜中，并在230℃下加热12小时，待混合物冷却至室温后，将棕黑色悬浮液通过0.22μm滤膜过滤，再用去离子水透析12小时后储存在4℃冰箱中。

[0055] 步骤2中，对铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)进行表征的具体步骤为：铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)是通过水热法合成构建，因具有荧光信号和POD酶活性，从而产生独特的比色/荧光双模式检测，通过TEM图像、荧光光谱和XPS光谱对铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)进行表征；

[0056] 如图2铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)的表征图像所示，其中，如图2A图所示铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)的透射电子显微镜(TEM)显示图像，材料尺寸分布均匀，平均直径为3.1nm；如图2B图所示为铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)的荧光光谱显示图像，铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)在436nm处表现出最佳发射波长，在365nm紫外下呈现蓝色，验证了其具有荧光特性；如图2C所示铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)的X射线光电子能谱(XPS)光谱显示图像，Fe‑CDs主要由C1s、O1s、N1s和Fe2p四种元素组成，证明了Fe元素的成功掺杂；如图2D所示为C1s的X射线光电子能谱(XPS)光谱显示图像，在284.6、285.9和287.9eV处被分辨为三个峰，它们归因于三种不同类型的碳原子。

[0057] 步骤3中，在室温下用5，5‑二甲基‑1‑吡咯啉‑N‑氧化物(DMPO)和2，2，6，6‑四甲基哌啶(TEMP)捕获剂捕获自由基和过氧化物酶(POD)活性动力学测试对铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)过氧化酶活性的鉴定，具体步骤为：

[0058] 步骤31、通过铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)的催化，催化H2O2氧化TMB产生氧化态TMB(ox‑TMB)，溶液呈现蓝色，其特征吸收峰在652nm处；

[0059] 步骤32、通过调整TMB和H2O2的浓度，绘制米氏‑门腾(Michaelis‑Menten)曲线。

[0060] 步骤32中，TMB的浓度范围为0.15‑1.2m·mol·L‑1，H2O2的浓度范围为0.8‑3.8m·‑1mol·L 。

[0061] 步骤32中，米氏‑门腾(Michaelis‑Menten)曲线显示TMB和H2O2的最大初始速度‑8 ‑8 ‑1 ‑1(Vmax)分别为3.77×10 和3.54×10 mol·L ·s ，相应的Michaelis‑Menten常数(Km)为‑1
0.256和0.772m·mol·L 。

[0062] 在步骤32中，基于米氏‑门腾动力学方程描述TMB的浓度范围内的酶促反应速率和H2O2的浓度范围的酶促反应速率，其中，描述TMB的浓度范围内的酶促反应速率公式为：

[0063]

[0064] 式中： 为TMB的浓度范围内的酶促反应速率， 为TMB的最大初始速度，‑1为TMB相应的米氏‑门腾常数，具体为0.256m·mol·L ，[STMB]为TMB的浓度范围。

[0065] 描述H2O2的浓度范围内的酶促反应速率公式为：

[0066]

[0067] 式中： 为H2O2的浓度范围内的酶促反应速率， 为H2O2的最大初始速度，‑1为H2O2相应的米氏‑门腾常数，具体为0.772m·mol·L ， 为H2O2的浓度范围。

[0068] 如图3所示铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)过氧化酶活性的鉴定图像，如图3A所示，在铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)的催化下，催化H2O2氧化TMB，由于ox‑TMB的产生，溶液呈现蓝色；如图3B所示，其特征吸收峰在652nm处；如图3C所示EPR光谱进一步证实了自由基中间体的存在，以DMPO/TEMP为自由基捕获剂，能够清楚地观察到·OH的信号峰。如图3D以及图3E所示，‑1 ‑1通过调整TMB(0.15‑1.2m·mol·L )和H2O2(0.8‑3.8m·mol·L )的浓度，同时将其他变量保持在最佳浓度范围内，绘制米氏‑门腾(Michaelis‑Menten)曲线，阐明了过氧化酶活性的‑8 ‑8 ‑1
动力学机制。TMB和H2O2的最大初始速度(Vmax)分别为3.77×10 和3.54×10 mol·L ·s‑1 ‑1
，相应的Michaelis‑Menten常数(Km)为0.256和0.772m·mol·L 。与文献报道的其他酶相比，Fe‑CDs不仅表现出更高的Vmax，而且表现出显著的更低的Km，显示出对TMB的更明显的亲和力。

[0069] 作为本发明的进一步方案，步骤4中，通过不同氨苄青霉素(Amp)浓度下Fe‑CDs+TMB+H2O2体系的比色信号、不同四环素(TC)浓度下系统的荧光信号和传感器在干扰因素下的选择性，构建氨苄青霉素和四环素的双模传感检测，具体步骤为：

[0070] 步骤41、通过紫外分光光度计检测氨苄青霉(Amp)，在0–300μM范围内，随着氨苄青霉(Amp)浓度的增加，652nm处吸光值逐渐减少，蓝色逐渐褪去，652nm处的吸光度变化值与2
氨苄青霉(Amp)浓度拟合的相关系数R为0.998，拟合的线性方程为：

[0071] y1＝0.1006x1+0.2142；

[0072] 式中：y1为652nm处的吸光度变化值，x1为氨苄青霉(Amp)浓度；

[0073] 步骤42、通过荧光分光光度计检测四环素(TC)，在0–600μM范围内，随着四环素(TC)浓度的增加，436nm处荧光信号逐渐减弱，436nm处的荧光变化值与四环素浓度拟合的2
相关系数R为0.995，拟合的线性方程为：

[0074] y2＝1431.53x2+1121.57；

[0075] 式中：y2为436nm处的荧光变化值，x2为四环素浓度。

[0076] 如图4所示氨苄青霉素和四环素的双模式传感检测示意图像，如图4A所示，对于氨苄青霉素的检测，通过使用紫外分光光度计，如图4B所示，在0–300μM范围内，发现随着氨苄浓度的增加，652nm处吸光值逐渐减少，蓝色逐渐褪去，652nm处的吸光度变化值与氨苄浓度的对数呈现良好的线性关系，为了证明该方法具有良好的特异性，如图4C所示，以各种无机离子、代表性氨基酸以及常见抗生素为阴性对照，未发现氨苄青霉素检测的显著干扰。如图4D所示，对于四环素的检测，如图4E所示，在0–600μM范围内，随着四环素浓度的增加，436nm处荧光信号逐渐减弱。436nm处的荧光变化值与四环素浓度的对数呈现良好的线性关系，如图4F所示，同样发现潜在的干扰因素对荧光强度几乎没有影响。基于这些发现，可以得出结论，所提出的传感器具有优异的电极性和抗干扰性能，进一步证明了该传感器可以成为抗生素检测的高精度和高分辨率工具。

[0077] 在步骤5中，开发便携式试纸条，通过智能手机传感平台实现抗生素的快速视觉检测，通过智能手机拍摄比色照片，选择照片的特定区域，将照片颜色强度转换为RGB值，自动生成R、G、B值与浓度的线性拟合关系，具体步骤为：

[0078] 步骤51、将铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)的打印在滤纸上，开发便携式试纸条，滴入分析物，利用在智能手机中的互补金属氧化物半导体(CMOS)将捕获相应的比色/荧光图像；

[0079] 步骤52、通过使用颜色识别应用程序提取照片的RGB信息，并利用G/R作为拟合参数实现半定量测定；

[0080] 步骤53、将浓度范围为0至150μg/ml的氨苄青霉素标准溶液，滴到试纸上并自然干燥，随着浓度增大，试纸条蓝色逐渐褪去，此时伽玛比率(G/R)变化值与氨苄青霉素标准溶2
液浓度拟合的相关系数R为0.999，拟合的线性方程为：

[0081] y3＝0.01246x3+0.5686；

[0082] 式中：y3为伽玛比率(G/R)变化值，x3为氨苄青霉素标准溶液浓度；

[0083] 步骤54、将浓度范围为0至200μg/ml的四环素标准溶液滴到试纸上，并提取照片的2
RGB信息，此时伽玛比率(G/R)变化值与四环素标准溶液浓度拟合的相关系数R为0.991，拟合的线性方程为：

[0084] y3＝0.02402x4+1.1732；

[0085] 式中：y3为伽玛比率(G/R)变化值，x4为四环素标准溶液浓度。

[0086] 如图5所示基于智能手机的便携式纸质传感器示意图所示，如图4A所示，将铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)的打印在滤纸上，开发便携式试纸条，滴入分析物，利用在智能手机中的互补金属氧化物半导体(CMOS)将捕获相应的比色/荧光图像，通过使用Color Recognizer应用程序提取照片的RGB信息，并利用G/R作为拟合参数，可以方便地实现半定量测定。如图4B所示，将一系列氨苄青霉素标准溶液，浓度从0至150μg/ml滴到试纸上并自然干燥，发现随着浓度增大，试纸条蓝色逐渐褪去。在该浓度范围内，G/R变化值与氨苄青霉素浓度呈良好的线性关系。如图4C所示，同上，将浓度从0至200μg/ml的四环素标准溶液滴到试纸上，提取照片的RGB信息，得出G/R变化值与四环素浓度呈良好的线性关系。结果表明，该便携式智能手机检测平台能够快速实现对抗生素的视觉定量传感，灵敏度高，大大拓展了在实际检测领域的应用。

[0087] 本发明实施例通过水热法合成铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)，对铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)进行表征，并鉴定铁掺杂碳量子点(Fe‑CDs)过氧化酶活性，基于紫外/荧光分光光度计进行氨苄青霉素和四环素的双模式传感检测，最后开发便携式试纸条，利用智能手机传感平台自动生成R、G、B值与浓度的线性拟合关系，实现了实时、现场、无需仪器且具有成本效益的即时检测，并将促进抗生素在环境化学行为、时间空间分布和生物生态毒性方面的研究；避免了酶培养所需的时间和严格的条件，使其更适合各种场景下的实时检测；检测响应在较短时间内完成，满足了当前日益增长的快速检测需求；借助色彩识别器，通过3D打印实现智能手机传感的便携式集成设备，能够实现定量检测结果读出。

[0088] 以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

[0089] 最后：以上所述仅为本发明的优选方案而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。